弗吉尼亞櫟不定芽增殖及試管苗再生影響因子研究

孫海菁，施 翔，陳益泰，王樹(shù)鳳，徐琴娣

(中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所，浙江省林木育種技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311400)

弗吉尼亞櫟（Quercus virginianaMill）原產(chǎn)美國(guó)，為殼斗科（Fagaceae）櫟屬（QuercusL.）常綠高大喬木，分布于美國(guó)東南沿海。弗吉尼亞櫟是沿海森林植被群落中的優(yōu)勢(shì)樹(shù)種，其根系深而發(fā)達(dá)，具有很強(qiáng)的抗風(fēng)能力，能抵御颶風(fēng)和暴雨的襲擊，耐短期水澇；還耐干旱、高濃度鹽霧和土壤鹽分，病蟲(chóng)害較少，是難得的沿海防護(hù)林優(yōu)良樹(shù)種[1-2]。又因其四季常青，樹(shù)冠開(kāi)闊，也可作為良好的行道遮陰樹(shù)種和園林綠化樹(shù)種。

弗吉尼亞櫟于2001年首次引入我國(guó)，在浙江富陽(yáng)、上虞、慈溪、海寧和上海、江蘇等地海涂試種，都表現(xiàn)出良好的適應(yīng)性[3-4]。目前，國(guó)內(nèi)弗吉尼亞櫟苗木大多依靠種子繁殖，由于種子變異大[5]，實(shí)生苗在生長(zhǎng)速度、株形、葉形等方面具有很大差異，導(dǎo)致苗木質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重制約生產(chǎn)推廣。同時(shí)，弗吉尼亞櫟種子沒(méi)有休眠期，只要條件合適即可萌發(fā)，不耐儲(chǔ)存，且存在象甲及動(dòng)物取食的影響，種子產(chǎn)量極不穩(wěn)定。無(wú)性繁殖對(duì)控制弗吉尼亞櫟苗木質(zhì)量及苗木快繁具有重要意義。研究報(bào)道，弗吉尼亞櫟通過(guò)扦插繁殖，可達(dá)70%～80%的生根率[6-7]，但依然存在生根率不穩(wěn)定、難以規(guī)模化生產(chǎn)等問(wèn)題。因此，有必要進(jìn)一步探索、完善弗吉尼亞櫟無(wú)性繁殖技術(shù)，尤其組織培養(yǎng)研究。

櫟類樹(shù)種組織培養(yǎng)研究始于20世紀(jì)80年代末，隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)體細(xì)胞胚發(fā)生和芽再生的方法已實(shí)現(xiàn)多種櫟樹(shù)植株再生，培養(yǎng)成功的櫟樹(shù)已近30個(gè)種[8]，包括歐洲夏櫟（Q. roburL.）[9-10]、歐洲栓皮櫟（Q. suberL.）[11-12]、冬青櫟（Q. ilexL.）[13]、北美紅櫟（Q.rubraL.）[14]、麻櫟（Q.acutissimaCarruth.）[15]以及高山櫟（Q.semecarpifoliaSm.）[8]等。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)在大葉櫟（Castanopsis fissa(Champ. ex Benth.) Rehd. et Wils.）[16]、遼東櫟（Q. liaotungensisKoidz.）[17]、蒙古櫟（Q. mongolicaFisch. ex Ledeb）[18]等櫟樹(shù)組織培養(yǎng)上也取得一些突破。弗吉尼亞櫟引種以來(lái)，國(guó)內(nèi)針對(duì)育苗技術(shù)、繁殖技術(shù)以及對(duì)生態(tài)因子的響應(yīng)等方面展開(kāi)了大量研究[19-22]。培育弗吉尼亞櫟無(wú)性系苗是當(dāng)前該樹(shù)種生產(chǎn)過(guò)程中的一大難題，雖然已有試驗(yàn)以扦插繁殖進(jìn)行無(wú)性系選育[6-7]，但至今沒(méi)有應(yīng)用到生產(chǎn)實(shí)踐中。本研究以弗吉尼亞櫟莖段為外植體，通過(guò)不定芽增殖途徑，探索弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)過(guò)程中外植體防褐化措施、不同種類激素及激素配比對(duì)不定芽增殖和生根的影響，以期建立弗吉尼亞櫟試管苗再生體系，為弗吉尼亞櫟無(wú)性系選育提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

弗吉尼亞櫟種子或帶芽莖段。種子來(lái)源于浙江上虞弗吉尼亞櫟母樹(shù)林，該母樹(shù)林位于紹興市上虞區(qū)瀝海鎮(zhèn)，營(yíng)建于2004年，造林種源來(lái)自美國(guó)路易斯安那州。帶芽莖段取自中國(guó)林科院亞熱帶林業(yè)研究所實(shí)驗(yàn)大棚2～4年生地栽苗，取材一般在每年3—5月份，剪取未木質(zhì)化新萌枝條備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒 種子或莖段經(jīng)自來(lái)水沖洗24 h后，再以75%的酒精消毒30 s（若是大田采取的外植體，加入1～2滴吐溫-80），在無(wú)菌操作臺(tái)以升汞浸泡3～10 min（其中幼嫩葉片或頂芽需3 min，種子需8 min），然后以無(wú)菌水沖洗3～5次，置于無(wú)菌玻璃瓶備用。

1.2.2 無(wú)菌苗培養(yǎng) 選取無(wú)蟲(chóng)眼、顆粒飽滿的弗吉尼亞櫟種子，在自來(lái)水中浸泡24 h，棄去漂浮的種子，然后以飽和漂白粉上清液浸泡30 min進(jìn)行表面消毒，消毒后的一部分種子剝?nèi)シN皮，于超凈工作臺(tái)內(nèi)，按1.2.1程序進(jìn)行消毒，消毒后的種子接種于瓊脂培養(yǎng)基，置于（25±2）℃培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行暗培養(yǎng)。

1.2.3 外植體防褐化試驗(yàn) 采用3種防褐化試劑[23-24]：抗壞血酸、硫代硫酸鈉和活性炭，質(zhì)量濃度分別為：抗壞血酸2.50、5.00 g·L-1，硫代硫酸鈉 1.00、2.00 g·L-1，活性炭 1.00、3.00、5.00 g·L-1，分別添加于增殖培養(yǎng)基中，對(duì)照培養(yǎng)基則不添加任何防褐化試劑。

1.2.4 不定芽增殖及壯苗試驗(yàn) 2012—2017年間，以MS、1/4MS和WPM為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的6-芐氨基嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）和吲哚乙酸（IAA）進(jìn)行不定芽增殖試驗(yàn)，6-BA 質(zhì)量濃度為 1.00、1.20、1.50 mg·L-1，NAA 為 0.00、 0.10、 0.20 mg·L-1， IAA 為 0.00、0.30、0.50 mg·L-1，設(shè)置細(xì)胞分裂素和生長(zhǎng)激素不同濃度配比，以只添加細(xì)胞分裂素（6-BA）的培養(yǎng)基作為對(duì)照，激素濃度設(shè)置參考文獻(xiàn)[9-18]有關(guān)濃度配比及項(xiàng)目組前期的大量試驗(yàn)。在無(wú)菌條件下，將滅菌的嫩枝剪成1 cm左右?guī)а壳o段，每種處理接種50個(gè)莖段，3次重復(fù)，分別在接種15、30 d后記錄莖段生長(zhǎng)、增殖情況和不定芽健康狀態(tài)等，進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。培養(yǎng)條件為：溫度25±2℃，光照3 000 lx，光暗周期14 h/10 h，培養(yǎng)室相對(duì)濕度70%左右。

1.2.5 生根培養(yǎng) 以1/4MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的吲哚丁酸（IBA）和NAA進(jìn)行生根試驗(yàn)，IBA質(zhì)量濃度為0.50、0.80、1.00 mg·L-1，NAA為0.50、1.00、1.50 mg·L-1，將壯苗培養(yǎng)中生長(zhǎng)一致的苗接種于不同培養(yǎng)基，每個(gè)處理接種15株，3次重復(fù)，接種20 d后統(tǒng)計(jì)生根情況及根系狀態(tài)。

1.2.6 煉苗及移植 試管苗生根后，先將生根的培養(yǎng)瓶瓶蓋打開(kāi)，置于馴化室中進(jìn)行馴化，3～5 d后取出小苗，洗凈根部，移植于裝有滅菌河沙的無(wú)紡布容器袋，置于大棚內(nèi)培養(yǎng)，期間嚴(yán)格控制水分，保持沙子表面濕潤(rùn)。30 d后統(tǒng)計(jì)幼苗成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗氧化劑和吸附劑對(duì)外植體褐化的影響

由表1可以看出：3.00、5.00 g·L-1活性炭處理對(duì)防止弗吉尼亞櫟外植體褐化效果最好，但5.00 g·L-1的活性炭中芽生長(zhǎng)的啟動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，因此，在培養(yǎng)基中添加3.00 g·L-1的活性炭可有效防止褐化。另外，發(fā)現(xiàn)多次反復(fù)接種也可以有效防止褐化。外植體第一次接種后，培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基，如此轉(zhuǎn)接3次，褐化基本不會(huì)發(fā)生。

2.2 培養(yǎng)基成分和激素配比對(duì)不定芽增殖和生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在添加不同質(zhì)量濃度激素的MS、1/4MS和WPM培養(yǎng)基中，弗吉尼亞櫟莖段均能生長(zhǎng)，但在MS培養(yǎng)基中，外植體褐化較嚴(yán)重，在低鹽的1/4MS和WPM培養(yǎng)基中，褐化較輕（表2）。

從表3可以看出：在供試的33種培養(yǎng)基中，5號(hào)、20號(hào)、21號(hào)培養(yǎng)基對(duì)弗吉尼亞櫟叢芽發(fā)生具有促進(jìn)作用，特別是5號(hào)配方，莖段在該培養(yǎng)基中叢芽發(fā)生最多，增殖倍數(shù)達(dá)6.60，且叢芽生長(zhǎng)狀態(tài)良好。21號(hào)培養(yǎng)基雖然增殖倍數(shù)也較高，但增殖的芽纖弱，且部分葉片沒(méi)有展開(kāi)。

2.3 不同激素配比對(duì)弗吉尼亞櫟叢芽生根的影響

由表4可以看出：生根培養(yǎng)20 d 時(shí)，單獨(dú)添加IBA或NAA均導(dǎo)致弗吉尼亞櫟叢芽基部愈傷化，雖然部分叢芽也有根的發(fā)生，但生根率極低，最高也僅3.33%。在本試驗(yàn)中，生根率最高的激素配比是 0.50 mg·L-1IBA+0.50 mg·L-1NAA，該培養(yǎng)基中叢芽的生根率可達(dá)53.33%，且每株芽的平均根數(shù)達(dá)到6條，同時(shí)在該培養(yǎng)基中發(fā)生的根系狀態(tài)也與其它不同，該培養(yǎng)基中的根較粗壯，且木質(zhì)化程度較高。另外，發(fā)現(xiàn)在IBA質(zhì)量濃度不變情況下，提高NAA質(zhì)量濃度不利于弗吉尼亞櫟的生根。

2.4 弗吉尼亞櫟試管苗的移植

對(duì)形成木質(zhì)化根的弗吉尼亞櫟試管苗進(jìn)行煉苗移植。首先將培養(yǎng)容器蓋打開(kāi)，放在培養(yǎng)室中進(jìn)行3～5 d煉苗，然后將試管苗取出，以滅菌河沙為介質(zhì)進(jìn)行移植，放于大棚中培養(yǎng)。2016—2018年，共計(jì)移苗61株，平均成活率57.78%，其中，2017年5月移植的試管苗成活率達(dá)83.33%以上。通過(guò)對(duì)試管苗移植的觀察，其成活率與葉片的數(shù)量和大小有關(guān)，葉片較多的試管苗更易成活，推測(cè)可能是由于葉片數(shù)量多，使光合產(chǎn)物增多，從而提高了試管苗的活力。

弗吉尼亞櫟試管苗移植的成功說(shuō)明通過(guò)不定芽增殖途徑獲得試管苗的技術(shù)體系是可行的，因此，基于組織培養(yǎng)中外植體防褐化措施、不定芽增殖和叢芽生根等過(guò)程影響因子的選擇和優(yōu)化，建立弗吉尼亞櫟試管苗再生體系，具體流程見(jiàn)圖1。

表 1 不同濃度抗褐化劑對(duì)外植體褐化及芽啟動(dòng)時(shí)間的影響Table 1 Effects of anti-browning agents with different concentration on browning of explants and the initial time for buds

表 2 弗吉尼亞櫟莖段在不同基本培養(yǎng)基的生長(zhǎng)狀況Table 2 Growth difference of stem segments ofQ. virginiana on different primary media

3 討論

櫟類樹(shù)種是離體培養(yǎng)較難的樹(shù)種之一，影響其組織培養(yǎng)最重要原因之一是外植體的褐化[25]，褐化主要與植物組織內(nèi)的酚類物質(zhì)有關(guān)，木本植物由于本身含豐富木質(zhì)素、單寧、色素等次生代謝物，因此較草本植物更容易褐化[26]。研究表明，外植體的褐化與基因型、外植體取材部位、取材季節(jié)以及外植體本身的年齡等有關(guān)，一般而言，年齡越大，木質(zhì)化程度越高的外植體越容易褐化，幼齡組織褐化相對(duì)較輕[23]。然而，位于形態(tài)學(xué)最上端的頂端分生組織，由于細(xì)胞活躍，各種酶活性較高，作為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)時(shí)，也很容易褐化。劉光金等[27]對(duì)3年生大葉櫟不同部位莖段進(jìn)行多酚含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，半木質(zhì)化枝條莖段和葉子的多酚類物質(zhì)含量高于新生萌芽條的莖段與葉子，而同一枝條形態(tài)學(xué)上端多酚類物質(zhì)含量高于形態(tài)學(xué)下端。于艷等[24]研究發(fā)現(xiàn)，采用麻櫟枝條的幼嫩莖段和半木質(zhì)化的莖段作為外植體，褐化率較低，萌發(fā)率較高；而采用帶生長(zhǎng)點(diǎn)的莖尖作為外植體，褐化率最高。本研究也發(fā)現(xiàn)，從成年弗吉尼亞櫟植株上取材的外植體在培養(yǎng)過(guò)程中褐化較嚴(yán)重，而無(wú)菌苗取材的外植體基本未發(fā)現(xiàn)褐化現(xiàn)象。呂秀立等[28]在研究舒瑪櫟（Q. shumardiiBuckl.）組織培養(yǎng)中也發(fā)現(xiàn)，從自然條件下生長(zhǎng)的枝條取材，無(wú)論是頂芽還是腋芽莖段，外植體褐化非常嚴(yán)重，均難以正常的生長(zhǎng)。

表 3 不同激素種類、配比對(duì)弗吉尼亞櫟叢芽發(fā)生及生長(zhǎng)的影響Table 3 Effects of different types and proportion of hormones combination on the development and growth of cluster buds of Q. virginana stem segments

表 4 不同激素配比對(duì)弗吉尼亞櫟叢芽生根的影響Table 4 Effects of different proportions of hormone combination on root development of cluster buds in Q. virginiana

組織培養(yǎng)中的防褐化措施，主要從培養(yǎng)基的選擇、pH值、硬度、外植體的選擇和處理以及吸附劑、抗氧化劑和激素的添加等方面抑制[23]，其中，向培養(yǎng)基中添加抗氧化劑和活性炭是最常用的措施，且也是最有效的措施。劉光金等[27]發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加活性炭、抗壞血酸可以有效減輕大葉櫟外植體的褐化。于艷等[24]發(fā)現(xiàn)，對(duì)麻櫟莖段褐化抑制效果最好的是1.0 mg·L-1PVP。在本研究中，針對(duì)野外取材的外植體，采用活性炭和添加抗氧化劑的方法對(duì)褐化進(jìn)行控制試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)活性炭和抗氧化劑對(duì)弗吉尼亞櫟外植體的褐化均有一定的抑制作用，但總的來(lái)說(shuō)，活性炭的效果要優(yōu)于抗氧化劑。作者發(fā)現(xiàn)，弗吉尼亞櫟外植體切口處氧化速度非常快，因此，在接種過(guò)程需要盡快將外植體接種到培養(yǎng)基中，而活性炭對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生的酚類物質(zhì)具有很好的吸附作用，推測(cè)這可能是活性炭對(duì)弗吉尼亞櫟外植體更有效的原因?？寡趸瘎╇m然能夠抑制外植體進(jìn)一步的氧化，但對(duì)已經(jīng)產(chǎn)生的酚類物質(zhì)無(wú)法去除，因此，導(dǎo)致接種前產(chǎn)生的酚類物質(zhì)在培養(yǎng)基中擴(kuò)散。

6-BA在促進(jìn)櫟樹(shù)不定芽增殖方面的效果已在眾多組織培養(yǎng)中得以證明，但不同櫟樹(shù)不定芽增殖階段對(duì)6-BA的濃度反應(yīng)均有不同。在歐洲夏櫟組織培養(yǎng)研究中，Chalupa[9,29]發(fā)現(xiàn)，0.88～3.50 μmol·L-16-BA在誘導(dǎo)不定芽增殖方面的效果要優(yōu)于6-糠氨基嘌呤（KT）。Puddephat等[10]認(rèn)為，0.44 μmol·L-16-BA（約 0.10 mg·L-1）對(duì)夏櫟腋芽的誘導(dǎo)、伸長(zhǎng)以及數(shù)量增殖均有良好的促進(jìn)效果，而較高濃度 6-BA（4.40 μmol·L-1）則會(huì)導(dǎo)致玻璃化、基部愈傷化以及葉片的變形扭曲，進(jìn)而影響芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)。在北美紅櫟組織培養(yǎng)過(guò)程中，Vengadesan 等[14]發(fā) 現(xiàn) ， 4.40 μmol·L-1（ 約 1.00 mg·L-1）6-BA可以促進(jìn)不定芽的增殖。蒙古櫟在含有 0.20 mg·L-16-BA的培養(yǎng)基中不定芽誘導(dǎo)效果最佳[18]，而麻櫟不定芽的誘導(dǎo)則需要1.00 mg·L-16-BA[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，1.20 mg·L-16-BA對(duì)弗吉尼亞櫟不定芽的誘導(dǎo)效果最佳，增值倍數(shù)可達(dá)6.6。因此，作者推測(cè)在櫟類樹(shù)種不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，6-BA 濃度在 0.44～4.40 μmol·L-1范圍進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以有效縮短試驗(yàn)探索周期。在不定芽誘導(dǎo)和增殖方面，除6-BA單獨(dú)使用以外，6-BA常與GA、TDZ以及NAA組合使用，也能獲得良好的增殖系數(shù)[14]?？紤]到成本問(wèn)題，作者在設(shè)計(jì)弗吉尼亞櫟不定芽增殖試驗(yàn)中使用6-BA和NAA組合，但發(fā)現(xiàn)NAA在0.50～1.50 mg·L-1條件下，與不同濃度6-BA搭配，增值倍數(shù)最高也僅4.18，均不及單獨(dú)使用6-BA的效果，推測(cè)可能是NAA濃度過(guò)高，抑制了不定芽的增殖[31]。由于本試驗(yàn)并未考慮6-BA與GA和TDZ的組合，因此，為提高弗吉尼亞櫟不定芽增殖系數(shù)，今后的研究中應(yīng)加以補(bǔ)充，以尋找最佳的激素組合。

圖 1 弗吉尼亞櫟組織培養(yǎng)流程Fig. 1 Different steps of tissue culture of Q. virginiana

試管苗的生根誘導(dǎo)是組織培養(yǎng)是否成功的關(guān)鍵步驟，在櫟樹(shù)生根誘導(dǎo)過(guò)程中，激素配比及其施用方法對(duì)根系的發(fā)生至關(guān)重要，其次，培養(yǎng)基組分、光暗周期等均可影響試管苗的生根。研究發(fā)現(xiàn)，在櫟樹(shù)試管苗生根誘導(dǎo)過(guò)程中，IBA的效果優(yōu)于NAA[11]，但也有采用IBA與NAA組合使用獲得良好的生根效果，Chalupa采用IBA（0.30 mg·L-1）和 NAA（0.10 mg·L-1）用于夏櫟（Q. roburL.）的誘導(dǎo)生根[9]。研究發(fā)現(xiàn)，IBA的濃度和施用方法均可影響根系的誘導(dǎo)，大多數(shù)研究是在含有激素的培養(yǎng)基中進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，IBA濃度最低為2.50 μmol·L-1，可用于舒瑪櫟的生根培養(yǎng)[32]；Manzanera等[11]采用5.00 mg·L-1IBA連續(xù)培養(yǎng)7～14 d，獲得栓皮櫟（Q. suberL.）的試管苗生根。當(dāng)采用高濃度IBA時(shí)，一般采用短期浸泡方式誘導(dǎo)生根，Purohit等采用 100.00 μmol·L-1IBA 對(duì)櫟樹(shù)不定芽基部進(jìn)行24 h浸泡，Q. glaucaThunb、Q. leucotrichophoraL.和Q. floribundaLindl. 試管內(nèi)生根[33-35]。本研究在 IBA 0.50 mg·L-1和 NAA 0.50 mg·L-1條件下，獲得良好的生根率（53.33%），其次為IBA 0.50 mg·L-1和 NAA 1.50 mg·L-1，生根率 40.67%，但 NAA比例提高時(shí)，基部愈傷化明顯，根系不發(fā)達(dá)；而在IBA:NAA為1時(shí)，獲得的根系粗壯，木質(zhì)化程度高，移苗成活率也高。除此以外，研究也表明，低鹽基本培養(yǎng)基有利于櫟樹(shù)試管苗的生根[29,36]，不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中采用WPM和1/4MS兩種低鹽培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)1/4MS對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效果要優(yōu)于WPM，因此，在生根誘導(dǎo)過(guò)程中采用1/4MS培養(yǎng)基，也獲得良好的生根誘導(dǎo)效果。

4 結(jié)論

研究表明，野外取材的弗吉尼亞櫟外植體易褐化，但可通過(guò)添加 3.00 g·L-1或 5.00 g·L-1的活性碳解決；無(wú)論是室內(nèi)無(wú)菌苗來(lái)源的外植體，還是野外取材，均可通過(guò)不定芽增殖途徑獲得大量的叢芽，進(jìn)而獲得生根的試管苗。由于弗吉尼亞櫟喜砂質(zhì)土壤，因此，試管苗的移植開(kāi)始宜采用滅菌河沙，在河沙中成活以后，可移植至含有營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)的土壤。