楊樹油菜素內(nèi)酯合成基因DET2的克隆與功能分析

李澤華，杜 娟，賀學(xué)嬌，趙樹堂，劉穎麗，盧孟柱＊

(1. 林木遺傳育種國家重點實驗室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091；2. 浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310029)

油菜素內(nèi)酯（BRs）作為一種重要的植物激素，存在于植物的各個器官中[1]參與植物幼苗生長、細胞伸長、細胞壁形成等許多生長發(fā)育過程[2-3]，并且參與了植物對干旱、低溫、高鹽等逆境脅迫的響應(yīng)[4]。

目前，關(guān)于BRs的生物合成途徑已研究的較為清楚。Fujioka等人通過懸浮培養(yǎng)的長春花（Catharanthus roseue（Linn.) G.Don)細胞系統(tǒng)，以油菜甾醇（CR）作為BRs合成的起始物闡明了BRs合成的基本途徑[5-6]。通過對擬南芥突變體的研究表明，在BRs的合成過程中有幾個比較重要的基因參與。DET2（DEETIOLATED2）基因表達合成一個5α-還原酶（5α-reductase），可以將油菜甾醇（（24R）-24-methylcholest-4-En-3-one）轉(zhuǎn)變?yōu)橛筒绥尥榇迹ǎ?4R）-24-methyl-5alpha-cholestan-3-one）[7-8]。擬南芥DET2基因功能缺失突變體det2-1中，植物無法合成BRs，表現(xiàn)出植株矮小、葉色深綠、根明顯縮短等表型[9]。DWF4（DWARF4）基因和BR6ox（BR-6-oxidase1）基因也被認為是BRs合成的關(guān)鍵基因，在擬南芥突變體中具有和det2-1相似的表型[10-11]。

楊樹作為研究木本植株生長發(fā)育的模式樹種，研究BRs在楊樹生長發(fā)育中的作用和機制對于BRs的研究和分子育種都有重要的理論指導(dǎo)意義。目前，在楊樹中過量表達BR6ox基因和DWF4基因已有報道，均有引起楊樹增高增粗等表型[12-13]。關(guān)于楊樹DET2基因功能的研究，此前已有一些報導(dǎo)。鄧偉等人、譚玉朋、嚴飛通過在楊樹中異源表達棉花GhDET2基因，分析了對楊樹生長發(fā)育的影響[14-16]。目前，關(guān)于在楊樹中過量表達其自身DET2基因的研究還未見報導(dǎo)，關(guān)于過量DET2基因是否可以提高植物內(nèi)源油菜素內(nèi)酯的研究也未見報導(dǎo)。本研究從銀腺楊 84K（Populus alba×P.glandulosa，‘84K’）中分離出擬南芥AtDET2同源基因PagDET2，構(gòu)建PagDET2過量表達載體，并通過遺傳轉(zhuǎn)化獲得過量表達PagDET2的轉(zhuǎn)基因楊樹，對其生長、發(fā)育進行分析，為研究DET2在楊樹生長發(fā)育中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究使用的楊樹材料均為銀腺楊84K，為中國林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國家重點實驗室保存。實驗所用楊樹均由組培苗擴繁而來，并由組培苗移栽至營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)。將帶有頂端的組培苗嫩莖（約2.5 cm）扦插到生根培養(yǎng)基（1/2MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，0.05 mg·L-1IBA 和 0.02 mg·L-1NAA，0.5%瓊脂粉，pH 5.8～6.0），培養(yǎng)于人工氣候室（溫度為23～25 ℃，光周期為14 h/10 h光照/黑暗，光照強度為 50 μmol·m-2·s-1）。生長 20 天后，將其移栽到營養(yǎng)土中，在22 ℃長日照（14 h/10 h光照/黑暗）培養(yǎng)室中繼續(xù)培養(yǎng)。

本研究所使用的Gateway入門載體pDNOR207、過表達載體pMDC32、GUS組織表達分析載體pMDC164、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α 及農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101菌種均由本實驗室保存。PCR引物合成和序列測序由Invitrogen公司完成。PCR反應(yīng)用的2倍濃度的Premix高保真酶Primer STAR HS、普通擴增酶PCRMix、DNA marker、膠回收試劑盒（TaKaRaAgarose Gel DNA Purification Kit）均為Takara公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成及RT-qPCR分析采用QIAGEN公司RNA提取試劑盒（RNeasy mini kit），并按照說明書提取RNA。RNA濃度和質(zhì)量分別用 Nanodrop8000（Thermo Fisher Scientific）和瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa）并按照說明書操作，進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。

在Roche 480定量儀器，使用SYBR Premix ExTaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa）上進行RT-qPCR分析，ACTIN基因作為內(nèi)參，每個樣品進行4個技術(shù)重復(fù)。

1.2.2PagDET2基因的克隆 以擬南芥AtDET2基因為目的基因，在毛果楊（Populus trichocarpa）基因組數(shù)據(jù)庫（http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中 Blast獲取AtDET2同源基因PtDET2（Potri.016G110600）序列。使用引物設(shè)計軟件Primer設(shè)計PtDET2基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)（CDS區(qū)）特異引物（PagDET2-F和PagDET2-R）（表1），以84K楊cDNA為模板，利用高保真聚合酶Prime STAR進行PCR擴增，得到目的基因PagDET2，并進行測序驗證。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）在線分析84K楊DET2蛋白的基本理化性質(zhì)。利用NCBI蛋白結(jié)構(gòu)分析網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析PagDET2蛋白結(jié)構(gòu)和功能。利用NCBI網(wǎng)站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）和植物基因組網(wǎng)站（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）查找獲取不同物種中DET2氨基酸序列。使用DNAMAN軟件比對不同物種中DET2蛋白氨基酸序列，并分析保守結(jié)構(gòu)域[17]。使用軟件MEGA 6利用N-J法構(gòu)建不同物種的DET2蛋白序列系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

五六年級的孩子已開始步入青春期，開始對異性有一些朦朦朧朧的感覺。這說明孩子長大了，對自己的性別有了認同，對異性也產(chǎn)生了認識欲望，這是很正常的事。但我認為“談戀愛”三個字用在他們身上還不合適，頂多就是對異性的一種好感，一種認同。該如何疏導(dǎo)呢？說重了，怕給他們造成心理陰影，說輕了，反而使他們對異性更加好奇，說不定，還會影響其他孩子。思前想后，我決定從小雨身上找突破口。

表 1 PCR擴增所用引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR

1.2.4 基因表達組織特異性分析 利用半定量PCR方法對DET2在84K楊各組織中的表達情況進行分析。以84K楊各組織的cDNA為模板，用特異引物進行PCR擴增，并對PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳。根據(jù)條帶亮度判斷DET2基因在各組織中的表達情況。

1.2.5 載體構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化 利用Gateway技術(shù)，將PagDET2基因連接至入門載體pDNOR207上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序驗證后，重組至過表達載體pMDC32中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并測序驗證。

將構(gòu)建好的過表達載體pMDC32-DET2電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化84K楊。具體遺傳轉(zhuǎn)化方法見文獻[18]。得到的轉(zhuǎn)基因株系進行PCR檢測，并提取RNA對PagDET2基因進行RT-qPCR定量分析。選擇表達量較高的3個過表達轉(zhuǎn)基因株系進行試驗。

1.2.6 植物體內(nèi)油菜素內(nèi)酯濃度測定 每個株系各選3株在營養(yǎng)土中生長2月的楊樹苗，取其1至3節(jié)間，迅速放入液氮凍存，冷凍研磨后按比例加入PBS（磷酸緩沖液，pH 7.4）。使用植物（Plant）油菜素內(nèi)酯（BR）ELISA檢測試劑盒（綠源伯德生物公司，北京）測定油菜素內(nèi)酯含量，每個樣本進行3次技術(shù)重復(fù)，并按照說明操作[13]。

1.2.7 植物生長量及耐鹽性、抗旱性研究 在不同年份不同批次分別選取野生型84K楊和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊#1各9株，在營養(yǎng)土中培養(yǎng)75天，測量株高，并重復(fù)3次。

選取野生型84K楊和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊#1各10株，在營養(yǎng)土中培養(yǎng)2個月用于耐鹽性和抗旱性分析，其中高鹽實驗各使用5株，干旱實驗各使用5株，并重復(fù)3次。在耐鹽實驗中，以300 mmol·L-1的NaCl水溶液處理植物，連續(xù)處理10天，持續(xù)觀察；在抗旱實驗中，首先給予充足水分，隨后進行持續(xù)干旱處理6天，持續(xù)觀察。以正常澆水的植株作為對照組。過氧化氫檢測使用過氧化氫檢測試劑盒（碧云天，上海），并按照說明書操作。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 使用SPSS Statistics 24軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，并用t檢驗法檢驗差異顯著水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 PagDET2基因克隆和序列分析

以84K楊cDNA為模板，使用特異引物PagDET2-F和PagDET2-R通過PCR擴增獲得84K楊DET2基因編碼區(qū)序列，并命名為PagDET2基因。序列分析表明，PagDET2基因與毛果楊PtDET2核酸序列相似度達97.93%，蛋白序列相似度達96.89%。PagDET2基因編碼區(qū)全長774 bp，編碼一個長度為257個氨基酸的蛋白質(zhì)，蛋白分子量約為29.84 kDa，理論等電點（pI）為9.49。PagDET2蛋白序列中含有兩個5α-還原酶（5α-reductase）必需的谷氨酸[19]，分別為Glu（56）和Glu（199）[20-21]（圖1），利用NCBI進行蛋白結(jié)構(gòu)分析表明為一種固醇類還原酶DET2（steroid reductase DET2）。

構(gòu)建基于84K楊、毛果楊、擬南芥、水稻等植物DET2蛋白氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹（圖2）。結(jié)果顯示，DET2蛋白的進化在高等植物中主要分為單子葉植物和雙子葉植物兩個類群。84K楊DET2與毛果楊、擬南芥等雙子葉植物DET2同屬于一個系統(tǒng)發(fā)育分支，親緣關(guān)系較近，而與水稻、玉米等單子葉植物DET2親緣關(guān)系較遠，這與形態(tài)學(xué)分類相一致。

2.2 基因表達組織特異性分析

為了研究PagDET2基因的組織表達情況，分別取84K楊根、未完全展開的嫩葉、成熟葉、中間節(jié)間和正在伸長的1至3節(jié)間提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行半定量PCR檢測。結(jié)果表明，PagDET2基因在84K楊各個組織中均有表達，且在1至3節(jié)間（In1-3）、中間節(jié)間（S）和嫩葉（YL）表達量較高，在根（R）和成熟葉片（ML）中表達量較低。PagDET2基因作為油菜素內(nèi)酯合成的必須基因，參與了植物頂端生長、葉片成熟、木材形成等生長發(fā)育過程（圖3）。

圖 1 基于不同物種中DET2同源蛋白序列的比對分析Fig. 1 Multiple sequence alignment of DET2 amino acid sequence in different plants

圖 2 基于不同物種中DET2同源蛋白序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig. 2 Phylogenetic tree constructed on the basis of DET2 amino acid sequence

圖 3 楊樹中PagDET2基因在各組織中的表達情況（YL：嫩葉，ML：成熟葉，S：中間節(jié)間，In1-3：1至3節(jié)間，R：根）Fig. 3 Expression patterns of PagDET2 in poplar（YL,young leaves; ML, mature leaves; S, middle internode;In1-3, internode 1st to 3rd; R, root）

2.3 轉(zhuǎn)基因楊樹的轉(zhuǎn)化與鑒定

為了進一步研究PagDET2基因在楊樹生長發(fā)育中的作用，構(gòu)建了由CaMV 35S啟動子驅(qū)動的PagDET2過表達載體PagDET2-OE Vector，采用農(nóng)桿菌侵染葉盤法，獲得了過量表達PagDET2基因的轉(zhuǎn)基因株系PagDET2-OE。通過PCR克隆和RT-qPCR檢測后，選取3個表達量較高（圖4）的株系（命名為#1、#2、#3）進行試驗。

圖 4 PagDET2基因在PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因植株中的表達情況Fig. 4 The expression levels of PagDET2 in PagDET2-OE lines

2.4 過表達PagDET2基因?qū)顦溆筒怂貎?nèi)酯的體內(nèi)合成的影響

DET2基因作為油菜素內(nèi)酯合成過程中的關(guān)鍵限速基因，為了研究DET2基因在楊樹中的過量表達后對植物體內(nèi)油菜素內(nèi)酯含量的影響，通過RT-qPCR檢測了油菜素內(nèi)酯信號通路關(guān)鍵基因PtPP2A基因在PagDET2-OE株系中的表達量。結(jié)果顯示：PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊中的PtPP2A基因顯著高于野生型84K（圖5）。

圖 5 PtPP2A基因在PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因植株中的表達情況Fig. 5 The expression levels of PtEXPA8 in PagDET2-OE lines

進一步通過ELISA檢測楊樹體內(nèi)油菜素內(nèi)酯的含量，結(jié)果顯示：與野生型84K楊對比，PagDET2-OE株系中油菜素內(nèi)酯含量顯著升高（圖6）。

2.5 過量表達PagDET2基因?qū)顦渖L發(fā)育及抗逆的影響

在人工氣候室培養(yǎng)室同時培養(yǎng)野生型84K楊和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊，生長75天的PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊高生長明顯高于野生型84K楊（圖7）。

圖 6 PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因植株中的油菜素內(nèi)酯含量Fig. 6 The content of BRs in PagDET2-OE lines

為了研究PagDET2基因?qū)τ谥参锟果}、耐旱的影響，對野生型84K和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊進行干旱和鹽脅迫。結(jié)果顯示：在未脅迫的情況之下，轉(zhuǎn)基因楊樹和野生型84K楊都能正常生長；在干旱脅迫6天后，野生型84K楊和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊都出現(xiàn)了萎蔫、葉片卷曲、枯黃的現(xiàn)象，無明顯差別；在鹽處理8天后，野生型84K楊還能正常生長，但是PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊出現(xiàn)了蔫蔫、葉片卷曲、枯黃的現(xiàn)象（圖8）。對野生型84K楊和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊進行過氧化氫含量檢測，取正常生長、干旱處理3天和鹽處理4天后的葉片，液氮研磨后使用過氧化氫檢測試劑盒檢測其過氧化氫含量，結(jié)果顯示：未處理時，過氧化氫含量基本相同，干旱處理和鹽處理均會導(dǎo)致過氧化氫含量升高，但是干旱處理3天后兩者沒有明顯差別，鹽處理4天后，PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊的葉片過氧化氫含量顯著高于相同處理的野生型84K楊。

3 討論

圖 7 野生型84K（WT）和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因植株75天生長情況Fig. 7 75-day-old wide type（WT）and PagDET2-OE transgenic poplars

圖 8 野生型84K和PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因植株高鹽處理8天后的生長情況Fig. 8 Wide type（WT）and PagDET2-OE transgenic poplars were treated with 300 mMNaCl for 8 days

植物激素在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育方面具有不可替代的作用，DET2基因作為BRs合成過程中的關(guān)鍵限速基因，對于BRs的合成有重要作用，改變其在植物體內(nèi)的表達，對于研究BRs對于植物的功能和機制有重要意義。

基因表達模式的組織分析表明，正在伸長生長的莖和已經(jīng)完成伸長生長的莖中DET2基因均有較高的表達，說明DET2可能影響莖的生長發(fā)育。過量表達楊樹DET2有增高表型，這一結(jié)果與在楊樹中異源表達棉花GhDET2基因的結(jié)果相似[14-16]。PtPP2A是AtPP2A基因的同源基因，有研究表明AtPP2A調(diào)控著BRZ1的磷酸化，BZR1是油菜素內(nèi)酯信號通路的核心，所以AtPP2A被認為是油菜素內(nèi)酯信號通路的開關(guān)，在油菜素內(nèi)酯信號傳導(dǎo)中有重要的積極作用[1,22]。PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊中的PtPP2A基因顯著高于野生型84K，說明轉(zhuǎn)基因楊中油菜素內(nèi)酯下游信號通路可能得到了加強。

通過ELISA檢測植物體內(nèi)BRs的含量表明，PagDET2-OE植株中的BRs含量明顯高于野生型。且前人研究表明擬南芥DET2基因功能缺失突變體det2-1中，植物無法合成BRs[9]，說明改變DET2基因的表達量可以改變植物內(nèi)源BRs的含量，這對于進一步研究油菜素內(nèi)酯在植物生長發(fā)育中的調(diào)控機制有重要意義。DET2過量表達對于莖生長發(fā)育和油菜素內(nèi)酯信號通路基因表達量的影響可能是通過改變油菜素內(nèi)酯含量實現(xiàn)的。這一功能與BRs合成的另一關(guān)鍵基因DWF4相似，在楊樹中過量表達DWF4基因，可以促進楊樹增高，提高BRs含量[13]。關(guān)于DET2等BRs合成中的關(guān)鍵基因的研究對利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增加楊樹生物量，從而進行定向分子育種有潛在應(yīng)用價值。

楊樹中過量表達PagDET2基因可使植株對高鹽的耐受性明顯下降。鹽處理4天后，PagDET2-OE轉(zhuǎn)基因楊的葉片過氧化氫含量顯著高于相同處理的野生型84K楊，這從生理上明確了高表達轉(zhuǎn)基因楊樹抗性降低的機制。雷雨婷等研究了過量表達楊樹PtDET2基因?qū)煵菰诟珊?、高鹽等處理下的影響[23]，通過在煙草中過量表達PtDET2基因，可以提高煙草抗旱、耐鹽能力。這與本研究結(jié)果有些不同，可能是由于煙草和楊樹的生長特性不同導(dǎo)致的。84K楊作為木本植物速生樹種，對分水需求很大，對高鹽和干旱更敏感。本研究觀察到的高生長轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性降低，預(yù)示著培育速生林木品種需要精細的管理，盡量避免其處于脅迫狀態(tài)。

4 結(jié)論

本研究通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，分析了DET2基因作為BRs合成的關(guān)鍵基因在楊樹生長中的作用。結(jié)果表明，過量表達可以顯著提高內(nèi)源BRs含量，促進植株增高，對速生品種的定向培育提供了基礎(chǔ)。但高生長植株對高鹽脅迫更具有敏感性，在林木培育中應(yīng)盡量避免逆境脅迫。