舞毒蛾標(biāo)本DNA提取和COI基因擴(kuò)增

徐 瑤，王鴻斌，王 梅，李國(guó)宏

(1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國(guó)家林業(yè)局森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)系，北京100193)

世界各地的生物博物館保存有數(shù)百萬(wàn)個(gè)標(biāo)本，其包含了時(shí)間和空間上不同歷史階段廣泛的生物群，提供了生物多樣性的豐富記錄[1-2]，是生物分類學(xué)、生物地理學(xué)和生物系統(tǒng)學(xué)研究的重要組成部分[3-7]。同時(shí)，博物館標(biāo)本為物種進(jìn)化研究提供了難以置信的潛力[8]，歷史標(biāo)本與現(xiàn)生標(biāo)本的結(jié)合可以揭示物種在一定時(shí)間尺度上以響應(yīng)環(huán)境壓力在表現(xiàn)型或基因型上發(fā)生的變化[9-10]。隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)以及相關(guān)統(tǒng)計(jì)工具的發(fā)展，標(biāo)本中更多的分子數(shù)據(jù)正在被挖掘和利用，例如對(duì)博物館標(biāo)本中基因序列的分析能夠標(biāo)識(shí)目前形成的物種遺傳多樣性的過(guò)程[11]；將從模式標(biāo)本獲得的序列作為新物種描述和分類修訂的附加數(shù)據(jù)來(lái)源，可增加物種識(shí)別的準(zhǔn)確性并加快物種分類的過(guò)程等[12-13]。然而，標(biāo)本中低濃度和小片段的DNA限制了從其中獲得基因序列的能力[14-15]。因此，前人做了很多關(guān)于標(biāo)本DNA提取方法的研究[16-19]。Guzman-Larraldeet al[19]評(píng)價(jià)了 DNeasy?Blood& Tissue Kit、改良DNeasy?Blood& Tissue Kit、CaCl2法、改良 CaCl2法和HotSHOT法5種方法對(duì)乙醇保存昆蟲(chóng)標(biāo)本的DNA提取效果。魏亦寒等[20]用了4種方法（CTAB法、SDS法、磁珠法以及GeneJET基因組DNA純化試劑盒）對(duì)扶桑綿粉蚧成蟲(chóng)的新鮮樣本以及乙醇保存標(biāo)本進(jìn)行DNA的分離提取，并對(duì)4種方法的DNA提取效果進(jìn)行了比較分析。Hunter等人[21]在提取雙翅目昆蟲(chóng)標(biāo)本的DNA時(shí)將裂解液用超聲波處理。雖然在國(guó)內(nèi)外期刊上已經(jīng)發(fā)表了很多有關(guān)標(biāo)本DNA提取方法的相關(guān)文獻(xiàn)，但是目前為止還未有一個(gè)適用于各類型標(biāo)本的、提取效果較好的通用方法。標(biāo)本DNA的提取方法常因保存方法、物種體型大小以及保存物種的不同而存在差異[22-27]。因此為了保證順利從標(biāo)本中提取到分子數(shù)據(jù)并減少標(biāo)本資源的浪費(fèi)，常需要根據(jù)標(biāo)本的保存方法、保存物種以及標(biāo)本體型大小等選擇合適的DNA提取方法。因此本研究嘗試比較分析SDS法、磁珠法以及E.Z.N.A.?昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒3種方法對(duì)舞毒蛾新鮮樣本、干燥成蟲(chóng)標(biāo)本和福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的DNA提取效果，以確定適用于3種類型標(biāo)本的DNA提取方法，為進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)打好基礎(chǔ)。

此外，標(biāo)本的保存時(shí)間、保存方式以及保存環(huán)境常會(huì)對(duì)標(biāo)本的DNA降解產(chǎn)生影響[14-15,28-30]，從而導(dǎo)致從標(biāo)本中擴(kuò)增基因序列變得困難。Zimmermann 等人[29]表明鱗翅目夜蛾科標(biāo)本保存時(shí)間越久，標(biāo)本中含有的大片段DNA越少，PCR擴(kuò)增成功率越低。Strange等人[14]在利用熊蜂(Bombus)標(biāo)本擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)時(shí)，同樣表明微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增的成功率與標(biāo)本的保存時(shí)間成負(fù)相關(guān)。Sutrisno等人[30]在利用鱗翅目通用引物進(jìn)行基因擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn)：對(duì)于保存時(shí)間低于6年的標(biāo)本可以成功擴(kuò)增出650 bp的片段；保存7年的標(biāo)本擴(kuò)增300 bp的片段較容易成功；而對(duì)于保存7～19年的標(biāo)本未擴(kuò)增得到目的片段。季清娥等[31]比較并分析了繭蜂的冷凍標(biāo)本、干燥標(biāo)本和乙醇標(biāo)本的DNA降解情況，結(jié)果表明50 mmol·L-1無(wú)水乙醇保存的寄生蜂標(biāo)本DNA降解程度最低。Miller等人[15]利用酒精保存蜘蛛標(biāo)本并調(diào)查了保存時(shí)間、體型大小、系統(tǒng)發(fā)育距離等因素對(duì)DNA條形碼測(cè)序成功率的影響。結(jié)果表明保存時(shí)間與測(cè)序成功率成負(fù)相關(guān)；標(biāo)本大小與測(cè)序成功率成正相關(guān)，與較小的蜘蛛物種相比可以從保存更長(zhǎng)時(shí)間的較大的蜘蛛物種獲得標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼序列；而物種系統(tǒng)發(fā)育距離與測(cè)序成功率無(wú)明顯的相關(guān)關(guān)系。通過(guò)比較不同類型標(biāo)本的基因序列擴(kuò)增成功率不僅能夠預(yù)測(cè)是否能夠從保存標(biāo)本中成功獲取到分子數(shù)據(jù)以及進(jìn)一步的研究，而且能夠?yàn)闃?biāo)本的處理和保存提供指導(dǎo)。因此本研究嘗試分析討論保存時(shí)間和保存方式對(duì)舞毒蛾標(biāo)本基因序列擴(kuò)增成功率的影響，從而為舞毒蛾標(biāo)本的保存和處理提供建議。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮舞毒蛾幼蟲(chóng)樣本由中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院昆蟲(chóng)病毒研究中心提供。舞毒蛾的卵塊是2008年在遼寧收集，然后在溫室中進(jìn)行人工飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件如下：溫度保持在24～26°C，光周期保持14L：10D，相對(duì)濕度60%～80%。

在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生物標(biāo)本館中，本研究獲得了1956年至1996年收集的舞毒蛾標(biāo)本（表1），所有標(biāo)本都保存在低溫（10 ℃左右）、通風(fēng)、光線暗的環(huán)境中。標(biāo)本在保存時(shí)間和保存方式上存在差異，因此本研究嘗試?yán)脴?biāo)本進(jìn)行兩個(gè)方面的研究：一方面利用1956年、1979年和1993年收集的干燥成蟲(chóng)標(biāo)本和福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本以及新鮮舞毒蛾幼蟲(chóng)樣本分析并比較不同DNA提取方法對(duì)各標(biāo)本的提取效果，以確定一種適合各標(biāo)本DNA提取的最優(yōu)方法；另一方面利用本研究中確定的最優(yōu)DNA提取方法提取其他所有舞毒蛾標(biāo)本的DNA，并將提取的標(biāo)本DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析并比較保存時(shí)間和保存方式對(duì)基因序列擴(kuò)增的影響。

表 1 本研究所用的舞毒蛾標(biāo)本Table 1 Lymantria dispar specimens used in this study

1.2 方法

以往的研究表明SDS法[20,32]和磁珠法[18,33]對(duì)各種標(biāo)本的DNA提取效果較好，另外E.Z.N.A.TM昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒是一種專用于提取昆蟲(chóng)DNA的試劑盒，因此本研究首先比較了這3種方法對(duì)舞毒蛾標(biāo)本的DNA提取效果。

1.2.1 標(biāo)本預(yù)處理 （1）干燥標(biāo)本的預(yù)處理 ：干燥標(biāo)本DNA提取前先用干凈的毛刷刷掉標(biāo)本表面的鱗毛、灰塵等污染物，然后取適當(dāng)組織先用0.9% NaCl溶液浸泡3 h[18]，然后將浸泡后的組織用去離子水清洗3～4次，組織清洗后在室溫條件下（15～25 ℃）自然風(fēng)干，最后用液氮研磨至粉末狀。一般取成蟲(chóng)標(biāo)本腹部組織30 mg進(jìn)行DNA提取。

（2）福爾馬林標(biāo)本的預(yù)處理：福爾馬林標(biāo)本在DNA提取前需利用不同濃度的乙醇溶液逐步將福爾馬林置換出來(lái)[17,34-35]。本試驗(yàn)依次用濃度為65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%和100%的乙醇溶液置換。在預(yù)處理過(guò)程中先用低濃度乙醇溶液浸泡標(biāo)本2 h，浸泡后5 000×g離心10 min，丟棄浸泡液，然后再依次用高濃度乙醇溶液浸泡標(biāo)本2 h，浸泡后5 000×g離心10 min，丟棄浸泡液。用各濃度乙醇溶液浸泡離心后再用去離子水清洗3～4次，自然風(fēng)干后剪去頭部取30 mg組織利用全自動(dòng)樣品快速研磨機(jī)（凈信JXFSTPRP-64）以60 Hz的頻率研磨1 min。

另外，新鮮的幼蟲(chóng)標(biāo)本在進(jìn)行DNA提取前用去離子水清洗3～4次，組織清洗后在室溫條件下（15～25 ℃）自然風(fēng)干，自然風(fēng)干后剪去頭部取30 mg組織利用全自動(dòng)樣品快速研磨機(jī)（凈信JXFSTPRP-64）以60 Hz的頻率研磨1 min。

1.2.2 SDS法提取標(biāo)本DNA 根據(jù)曲良建等[32]的SDS-蛋白酶K法對(duì)預(yù)處理過(guò)的標(biāo)本進(jìn)行DNA的提取，但本試驗(yàn)中為減少裂解液對(duì)核酸的損傷，將組織、裂解液、蛋白酶K的混合液65 ℃恒溫水浴2 h。

1.2.3 磁珠法提取標(biāo)本DNA 磁珠法動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒購(gòu)買自生工生物工程（上海）股份有限公司，根據(jù)操作說(shuō)明對(duì)預(yù)處理過(guò)的標(biāo)本分別進(jìn)行提取。

（1）將研磨過(guò)的組織放入1.5 mL離心管中，加入 400 μLBuffer MACL、200 μLBuffer MCL 和20 μLProteinase K，震蕩混勻，然后65 ℃恒溫水浴2 h，水浴過(guò)程中每隔0.5 h混勻一次以充分裂解組織細(xì)胞。

（2）其他操作步驟參考蔣欣悅[35]的研究。

1.2.4 E.Z.N.A.?昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒提取E.Z.N.A.?昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒購(gòu)買自上海索萊寶生物科技有限公司，根據(jù)操作說(shuō)明對(duì)預(yù)處理過(guò)的標(biāo)本分別進(jìn)行提取。

（1）將研磨過(guò)的組織放入1.5 mL 離心管中，在離心管中加入 350 μL Buffer CTL和 25 μL Proteinaseine K（20 mg·mL-1），然后 60 ℃ 恒溫水浴2 h，水浴過(guò)程中每隔0.5 h混勻一次以充分裂解組織細(xì)胞。

（2）水浴裂解后，在2 mL離心管中加入350 μL核酸提取液（氯仿：異戊醇=24∶1），震蕩混勻后10 000×g離心5 min，離心后取250 μL上清液小心轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中。在上清液中加入 5 μLRNase A（25 mg·mL-1）溶液，混勻，室溫放置 10～15 min。

（3）1.5 mL離心管中加入250 μLBuffer CBL，震蕩混勻15 s，然后60 ℃恒溫水浴10 min。

（4）1.5 mL離心管中加入250 μL無(wú)水乙醇（96%～100%），震蕩混勻15 s。

（5）將HiBind?DNA吸附柱放入新的2 mL收集管中，將1.5 mL離心管中的750 μL混合液轉(zhuǎn)移至吸附柱中，10 000×g離心1 min，丟掉收集管中的廢棄液并將吸附柱重新放入2 mL收集管中。

（6）吸附柱中加入500 μLBuffer HB，10 000×g離心1 min，丟掉廢棄液及收集管并將吸附柱放入新的2 mL收集管中。

（7）吸附柱中加入700 μLWash Buffer（使用前需要加入無(wú)水乙醇），10 000×g離心1 min，丟掉廢棄液及收集管并將吸附柱放入新的2 mL收集管中。

（8）吸附柱中加入700 μLWash Buffer（使用前需要加入無(wú)水乙醇），10 000×g離心1 min，丟掉收集管中的廢棄液，將吸附柱放回2 mL收集管中然后10 000×g離心2 min，丟掉廢棄液及收集管。

（9）將吸附柱放入新的1.5 mL離心管中，加入 50～100 μLElution Buffer（提前 60～70 ℃ 恒溫水浴5 min）并在60 ℃恒溫水浴2 min，最后10 000×g離心1 min得到DNA提取液。

將3種方法提取的標(biāo)本DNA用超微量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（DeNovixDS-11）測(cè)定濃度和純度，將已知濃度和純度的DNA置于-20 ℃低溫保存?zhèn)溆?。此外，取部分已?jīng)測(cè)定濃度和純度的DNA樣本送去厚澤生物公司，利用Qsep100全自動(dòng)核酸蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)檢測(cè)樣本中的DNA片段分布情況。一般情況下待檢測(cè)的樣本DNA濃度需高于 10 ng·μL-1，DNA 純度（A260/A280）需在 1.8～2.0之間。對(duì)于DNA提取濃度較高（＞500 ng·μL-1）的樣本，為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢測(cè)之前常需要用Elution Buffer稀釋，稀釋后濃度在100 ng·μL-1左右最好。

在比較不同DNA提取方法對(duì)各標(biāo)本的提取效果時(shí)，本研究?jī)H利用了1956年、1979年和1993年收集的干燥成蟲(chóng)標(biāo)本和福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本進(jìn)行分析。在確定一種適合各標(biāo)本DNA提取的最優(yōu)方法后，本研究利用最優(yōu)DNA提取方法提取其他舞毒蛾標(biāo)本的DNA，并將提取的所有標(biāo)本DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析保存時(shí)間和保存方式對(duì)基因序列擴(kuò)增的影響。

1.2.5 不同標(biāo)本DNA片段化程度的差異顯著性檢驗(yàn) 本研究檢測(cè)到所有標(biāo)本的DNA片段大小都分布在20 bp至900 bp之間，而且全自動(dòng)核酸蛋白質(zhì)分析系統(tǒng)自動(dòng)將所有DNA片段依次分成了44組（20～40 bp, 40～60 bp, ···, 880～900 bp），并提供了每組DNA片段在所有片段中所占的百分比。本研究首先利用似然比檢驗(yàn)（Likelihood ratio test,LRT）分析不同方法提取的標(biāo)本DNA中各組DNA片段百分比分布的差異，以確定在DNA提取過(guò)程中3種方法對(duì)DNA的損傷情況，其中每一個(gè)樣本的數(shù)據(jù)都由44組DNA片段組成，同一種標(biāo)本所有樣本的各組DNA片段所占的百分比被平均。在SPSS 18.0軟件中進(jìn)行LRT檢驗(yàn)時(shí)參數(shù)的設(shè)置如下所示：（1）在加權(quán)個(gè)案窗口選擇加權(quán)個(gè)案，頻率變量輸入各組DNA片段的百分比；（2）在交叉表窗口的“行”輸入44組DNA片段的分布情況（20～40 bp, 40～60 bp, ···, 880～900 bp），“列”輸入標(biāo)本類型；（3）統(tǒng)計(jì)量選擇卡方；（4）在單元格窗口依次選擇觀察值、期望值、行、列和無(wú)調(diào)節(jié)。此外，為了直觀表現(xiàn)出不同標(biāo)本DNA降解程度的差異，本研究將所有原始DNA片段百分比分布的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到Origin 9.5軟件中以獲得DNA片段百分比分布的擬合曲線。在進(jìn)行曲線擬合時(shí)，本研究首先將原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Origin 9.5軟件中以獲得DNA片段分布的散點(diǎn)圖，其中44組DNA片段作為橫坐標(biāo)，每組DNA片段所占有的百分比作為縱坐標(biāo)，然后對(duì)散點(diǎn)圖進(jìn)行了各種非線性擬合以獲得最佳擬合曲線（具有最高相關(guān)系數(shù)R2）。為了直觀表現(xiàn)出干燥成蟲(chóng)標(biāo)本和福爾馬林標(biāo)本的DNA片段分布差異，本研究利用Origin 9.5軟件制作了兩種標(biāo)本的堆積柱形圖。由于44組DNA片段所占的百分比相對(duì)較小，若直接用44組DNA片段所占的百分比作圖會(huì)導(dǎo)致堆積柱形圖對(duì)比不清晰。因此，在制作堆積柱形圖時(shí)本研究將44組DNA片段分成了四個(gè)大組（A，B，C和D），其中A組包括第1至8組的DNA片段，B組包括第9至17組的DNA片段，C組包括第18至 26組的DNA片段，D組包括第27至第44組的DNA片段，然后分別計(jì)算這四組DNA片段在所有片段中各自所占百分比。最后利用四組DNA片段在所有片段中各自所占百分比在Origin 9.5軟件中繪制兩種標(biāo)本成組堆積柱狀圖。在繪制擬合曲線和堆積柱狀圖時(shí)，本研究利用了每一種標(biāo)本所有樣本的各組DNA片段百分比的平均值。

1.2.6 引物設(shè)計(jì)和PCR擴(kuò)增 本研究根據(jù)標(biāo)本中的DNA片段分布情況（20～900 bp）設(shè)計(jì)了15對(duì)COI基因特異性引物，其目標(biāo)片段在216 bp至977 bp之間。在設(shè)計(jì)引物時(shí)參考了GenBank上已經(jīng)公布的舞毒蛾完整的線粒體基因序列（FJ617240，KY798442和KY923059-KY923067）。所有設(shè)計(jì)引物信息如表2所示。

將已知濃度和純度的DNA作為模板，利用以上15對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：DNA模板質(zhì)量＜1 μg，2×Tap PCR MasterMix（天根）12.5 μL，正反引物各 1 μL，ddH2O 補(bǔ)至 25 μL。PCR反應(yīng)循環(huán)的設(shè)置為：

94℃ 3 min

94℃ 3 sec

48 ℃～54.3 ℃ 30 sec (2～4 步) 30 個(gè)循環(huán)

72 ℃ 1 min

72 ℃ 5 min

表 2 本研究所用的引物Table 2 All primers used in this study

其中15對(duì)特異性引物的退火溫度不同，在PCR擴(kuò)增時(shí)具體退火溫度的設(shè)置如表2所示。

將擴(kuò)增產(chǎn)物上樣到1%的瓊脂糖凝膠中，以DL2000 DNA Marker（天根）作為參考DNA Marker，在1×TAE電泳緩沖液中電泳30～40 min，電泳完成后取出瓊脂糖凝膠在凝膠成像系統(tǒng)中檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度與純度

3種提取方法提取的各標(biāo)本的DNA濃度和純度如表3所示，從表中可以看出SDS法對(duì)1956年、1979年和1993年收集干燥成蟲(chóng)標(biāo)本和福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的DNA提取效果相對(duì)較差，特別是未能從1956年收集的福爾馬林標(biāo)本中提取到DNA；磁珠法和E.Z.N.A.TM昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒對(duì)于新鮮樣本的提取效果差異不是很明顯，但E.Z.N.A.TM昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒對(duì)于干燥標(biāo)本和福爾馬林標(biāo)本的DNA提取濃度和純度都較磁珠法較好。

表 3 不同方法提取DNA的濃度與純度Table 3 The concentration and purity of genomic DNA extracted by different methods

2.2 不同提取方法對(duì)標(biāo)本DNA的損傷程度

本研究對(duì)用不同方法提取的干燥成蟲(chóng)標(biāo)本（收集時(shí)間相同）的DNA片段分布進(jìn)行了似然比檢驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)用不同方法提取的干燥成蟲(chóng)標(biāo)本（收集時(shí)間相同）的DNA片段分布差異是不顯著的（df=1,P1956=0.745,P1979=0.560,P1993=0.101）。同樣的，通過(guò)對(duì)用不同方法提取的福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本（收集時(shí)間相同）的DNA片段分布進(jìn)行似然比檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)用不同方法提取的福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本（收集時(shí)間相同）的DNA片段分布差異是不顯著的（df=1,P1956=0.439,P1979=0.983,P1993=0.482）。因此，本研究表明雖然3種DNA提取方法的提取效果存在差異，但是3種方法在提取過(guò)程中都未對(duì)標(biāo)本DNA產(chǎn)生損傷，也可能3種方法在提取過(guò)程中對(duì)標(biāo)本DNA產(chǎn)生的損傷程度是相同的。此外，本研究獲得了不同方法提取的干燥成蟲(chóng)標(biāo)本和福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本（收集時(shí)間相同）的DNA片段百分比分布的擬合曲線，如圖1所示。從圖1中可以看出不同方法提取的干燥成蟲(chóng)標(biāo)本和福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的（收集時(shí)間相同）DNA片段分布的擬合曲線基本是一致，這同樣表明3種提取方法在提取過(guò)程中對(duì)標(biāo)本DNA的損傷程度差異是不明顯的。

2.3 不同標(biāo)本的COI基因擴(kuò)增

各年份收集的舞毒蛾標(biāo)本的15對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示，從圖2中可以看出干燥標(biāo)本的保存時(shí)間越久長(zhǎng)序列目的片段的擴(kuò)增越困難。對(duì)于1982年之前保存的標(biāo)本未能擴(kuò)增出大于400 bp的基因序列，而對(duì)于1987年到1996年收集的標(biāo)本擴(kuò)增大于400 bp基因序列的成功率顯著增加。但是所有保存標(biāo)本均未能擴(kuò)增獲得大于600 bp的目的片段，而15對(duì)引物在新鮮舞毒蛾樣本中均擴(kuò)增成功。本研究推測(cè)導(dǎo)致所有標(biāo)本均未能擴(kuò)增獲得大于600 bp的目的片段的原因主要與標(biāo)本DNA的降解有關(guān)，而且標(biāo)本保存時(shí)間越長(zhǎng)（22～62 a）舞毒蛾標(biāo)本提取DNA的降解越嚴(yán)重。本研究獲得了各年份收集的舞毒蛾干燥標(biāo)本的DNA片段百分比分布的擬合曲線，如圖3所示。從圖3可以看出不同年份收集的舞毒蛾干燥標(biāo)本的DNA片段百分比分布的擬合曲線明顯不一致。隨著保存時(shí)間的增加，標(biāo)本中大片段DNA所占的百分比明顯降低，小片段DNA所占的百分比顯著增加。

圖 1 不同方法提取DNA的片段分布Fig. 1 The fragment distribution of genomic DNA extracted by different methods

圖 2 不同年份收集的舞毒蛾標(biāo)本的測(cè)序成功情況Fig. 2 Sequencing success profile for L. dispar specimens collected in different years

另外，本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于收集時(shí)間相同的福爾馬林標(biāo)本和干燥標(biāo)本，福爾馬林保存的舞毒蛾標(biāo)本其總體擴(kuò)增成功率比干燥標(biāo)本的略高，其中1956年、1979年和1993年收集的福爾馬林標(biāo)本的擴(kuò)增成功率分別為33.33%、46.67%和73.33%，而干燥標(biāo)本的擴(kuò)增成功率分別為26.67%、40.00%和53.33%。在干燥成蟲(chóng)標(biāo)本和福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的DNA片段百分比的堆積柱狀圖中（圖4），本研究展示出四組DNA片段百分比組成在福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本和干燥成蟲(chóng)標(biāo)本之間存在明顯差異。而且干燥成蟲(chóng)標(biāo)本中的小片段DNA比例明顯要高于福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的小片段DNA比例（1-8組DNA片段）；相反的，干燥成蟲(chóng)標(biāo)本中的大片段DNA比例明顯低于福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的大片段DNA比例（9-44組DNA片段）。

圖 3 舞毒蛾標(biāo)本的DNA片段百分比分布圖Fig. 3 The percentage distributions of DNA fragments for L. dispar specimen

圖 4 干燥成蟲(chóng)標(biāo)本和福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的DNA片段分布比較Fig. 4 Comparison of DNA fragment distributions between dried adults and formalin-fixed larval specimens

3 討論

通過(guò)比較分析SDS法、磁珠法以及E.Z.N.A.TM昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒3種方法對(duì)舞毒蛾新鮮樣本、干燥標(biāo)本和福爾馬林標(biāo)本的DNA提取效果，本研究發(fā)現(xiàn)E.Z.N.A.TM昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒更適合館藏的舞毒蛾干燥標(biāo)本和福爾馬林標(biāo)本的DNA提取。SDS法在DNA提取時(shí)利用SDS（十二烷基硫酸鈉）破壞細(xì)胞壁并裂解DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，使DNA釋放出來(lái)。但在標(biāo)本中細(xì)胞內(nèi)的DNA-蛋白質(zhì)的交聯(lián)現(xiàn)象加重，使得SDS（十二烷基硫酸鈉）無(wú)法有效裂解DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，因此減少了標(biāo)本中DNA的釋放。同時(shí)SDS法中常用到的氯仿、苯酚等提取劑也無(wú)法完全清除，使得標(biāo)本DNA提取純度降低，因此SDS法提取的模板DNA不利于進(jìn)行PCR擴(kuò)增等下一步實(shí)驗(yàn)。近年來(lái)，磁珠法由于其操作過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單、快速，不需要氯仿等有毒溶劑的抽提，也無(wú)需過(guò)多離心、沉淀等耗時(shí)的純化步驟，而且能夠提高DNA提取純度，在標(biāo)本DNA提取方面的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[18,33]。但是磁珠法DNA提取效果常常受磁珠量的影響。當(dāng)磁珠量過(guò)少時(shí)，由于磁珠表面的DNA吸附量有限，因此使得標(biāo)本DNA未能被完全吸附；當(dāng)磁珠量過(guò)多時(shí)，由于磁棒對(duì)磁珠的吸附能力有限導(dǎo)致部分磁珠未能被吸附，從而使部分磁珠吸附的DNA被浪費(fèi)。因此為了達(dá)到最好的磁珠法提取效果，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)該適當(dāng)控制磁珠量。E.Z.N.A.TM昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒雖然提取過(guò)程較磁珠法復(fù)雜，同時(shí)需要用到氯仿等有毒溶劑的抽提，但其在標(biāo)本DNA提取過(guò)程中用到的裂解、抽提緩沖液以及純化溶劑能夠很好的裂解組織細(xì)胞并將DNA釋放出來(lái)，DNA提取純度也較高，因此該法利用相對(duì)較少的標(biāo)本材料即能提取到相對(duì)較高濃度和純度的DNA。因此雖然E.Z.N.A.TM昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒和磁珠法基因組DNA抽提試劑盒對(duì)于舞毒蛾干燥標(biāo)本和福爾馬林標(biāo)本的提取效果都較SDS法好，但是從節(jié)省珍貴標(biāo)本資源的角度出發(fā)，本研究更傾向于利用E.Z.N.A.TM昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒進(jìn)行舞毒蛾干燥標(biāo)本和福爾馬林標(biāo)本的DNA提取。

本研究發(fā)現(xiàn)在標(biāo)本館的保存環(huán)境下標(biāo)本保存時(shí)間越久擴(kuò)增長(zhǎng)序列目的片段的成功率越低，這可能與標(biāo)本保存過(guò)程中DNA發(fā)生降解有關(guān)。一方面新鮮活體被做成標(biāo)本后其體內(nèi)的代謝活動(dòng)停止，細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)失去調(diào)控而導(dǎo)致體內(nèi)DNA開(kāi)始被降解，但在標(biāo)本保存一段時(shí)間后其細(xì)胞內(nèi)的水分會(huì)逐漸丟失從而導(dǎo)致體內(nèi)酶失活，DNA自身降解作用也會(huì)逐漸停止。因此標(biāo)本體內(nèi)是否保留水分以及保留水分的時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)標(biāo)本DNA的降解至關(guān)重要[17]。另一方面我們以前的研究表明（未發(fā)表）在標(biāo)本保存足夠時(shí)間后（比如保存時(shí)間大于18 a），標(biāo)本館中的環(huán)境如濕度和溫度同樣會(huì)對(duì)標(biāo)本體內(nèi)DNA降解產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致DNA片段降解程度在保存時(shí)間不同的標(biāo)本中存在差異，標(biāo)本保存時(shí)間越久其體內(nèi)的DNA降解越嚴(yán)重，提取DNA中的大片段DNA（＞400 bp）含量越低，因此擴(kuò)增大片段目的序列越困難。此外，本研究表明福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的擴(kuò)增成功率比干燥成蟲(chóng)標(biāo)本的略高，因此福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的DNA降解程度略低于干燥成蟲(chóng)標(biāo)本的DNA降解程度。這可能與干燥標(biāo)本在保存前的處理以及標(biāo)本館的環(huán)境有關(guān)。干燥標(biāo)本在保存之前未完全干燥，使得標(biāo)本體內(nèi)保存水分，細(xì)胞內(nèi)的酶系統(tǒng)繼續(xù)降解體內(nèi)DNA；標(biāo)本館環(huán)境濕度較大或者存在其他影響DNA降解的因素也可能加劇干燥標(biāo)本體內(nèi)的DNA降解作用。而對(duì)于福爾馬林保存的幼蟲(chóng)標(biāo)本，常因?yàn)楦栺R林成分中的甲醛被氧化成甲酸而導(dǎo)致DNA降解。但是在用福爾馬林保存標(biāo)本時(shí)常會(huì)在瓶口部位纏繞封口膜以減少福爾馬林與空氣的接觸，防止甲醛氧化成甲酸從而降低了對(duì)標(biāo)本DNA的損傷。因此，本研究表明干燥成蟲(chóng)標(biāo)本DNA降解程度比福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的DNA降解程度要嚴(yán)重。但是，本研究及以前研究表明福爾馬林標(biāo)本的DNA提取困難，而且樣本中存在很多PCR抑制劑[36]，因此本研究不建議利用福爾馬林保存標(biāo)本。另外，福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本與干燥成蟲(chóng)標(biāo)本的DNA降解程度差異也有可能與2種標(biāo)本的保存蟲(chóng)態(tài)有關(guān)。

標(biāo)本中的分子數(shù)據(jù)是進(jìn)行物種系統(tǒng)地理學(xué)、物種進(jìn)化研究的重要信息，而標(biāo)本DNA提取是獲得標(biāo)本分子數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)步驟，因此標(biāo)本DNA提取方法的選擇和優(yōu)化是有效提取標(biāo)本分子數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。所以在嘗試?yán)脴?biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)研究時(shí)，首先需要對(duì)DNA提取方法進(jìn)行討論分析。本研究表明標(biāo)本在處理、保存過(guò)程中發(fā)生了DNA降解，因此在標(biāo)本收集保存過(guò)程中應(yīng)該盡量避免導(dǎo)致DNA降解的操作。例如，將一部分收集的新鮮樣本直接完全干燥不做還軟處理即保存于標(biāo)本館中，這將降低標(biāo)本體內(nèi)的水分以及水分保留時(shí)間，從而減少標(biāo)本DNA自身降解的持續(xù)時(shí)間，降低標(biāo)本DNA的降解程度保留更多的長(zhǎng)片段基因序列，以便將來(lái)可利用這些標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)研究；而另外一部分標(biāo)本可在完全干燥后展翅保存以便進(jìn)行形態(tài)學(xué)研究。標(biāo)本的保存條件(溫度、濕度等)也可能加劇標(biāo)本體內(nèi)的DNA降解作用，因此在標(biāo)本保存過(guò)程中應(yīng)該適當(dāng)調(diào)節(jié)標(biāo)本館的環(huán)境溫度和濕度，例如降低標(biāo)本保存的溫度和濕度，最適合標(biāo)本保存的溫度和濕度等還需要進(jìn)一步研究。以前的研究表明標(biāo)本的保存方式會(huì)對(duì)基因序列的擴(kuò)增成功率產(chǎn)生影響[24,37-38]，閆華超等[24]比較了甲醛、不同濃度乙醇保存標(biāo)本和自然干燥標(biāo)本的DNA降解程度，結(jié)果表明75%乙醇保存的蜜蜂標(biāo)本DNA降解程度最低；鄭斯竹等[33]也表明無(wú)水乙醇-20 ℃保存的天牛標(biāo)本比干燥標(biāo)本的PCR擴(kuò)增成功率高。本研究表明干燥成蟲(chóng)標(biāo)本的PCR擴(kuò)增成功率低于福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的PCR擴(kuò)增成功率，因此為了不影響利用標(biāo)本進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)并減少采集標(biāo)本的損失，可在短時(shí)間內(nèi)利用適當(dāng)濃度的乙醇溶液保存標(biāo)本。此外，本研究建議在利用標(biāo)本獲取分子數(shù)據(jù)之前提前檢測(cè)標(biāo)本中的DNA片段分布和各片段的百分比分布，這將有利于為引物設(shè)計(jì)提供直接證據(jù)并減少標(biāo)本資源的損失。

4 結(jié)論

本研究表明與SDS法和磁珠法相比，E.Z.N.A.TM昆蟲(chóng)DNA提取試劑盒更適合舞毒蛾新鮮樣本、干燥成蟲(chóng)標(biāo)本和福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本的DNA提取，而且提取過(guò)程中未對(duì)標(biāo)本DNA產(chǎn)生額外損傷。舞毒蛾標(biāo)本的保存時(shí)間和保存方式均會(huì)對(duì)基因序列擴(kuò)增產(chǎn)生影響，標(biāo)本保存時(shí)間越久擴(kuò)增長(zhǎng)序列目的片段的成功率越低，而且福爾馬林幼蟲(chóng)標(biāo)本總體擴(kuò)增成功率比干燥成蟲(chóng)標(biāo)本的略高

致謝：本研究感謝中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生物標(biāo)本館以及昆蟲(chóng)病毒研究中心提供的舞毒蛾樣本。本研究還要感謝中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所張?zhí)K芳副研究員在試驗(yàn)過(guò)程中給予的幫助和建議。