非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組方法分析鱘魚肽抗D-半乳糖導(dǎo)致的小鼠衰老作用的研究

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(1.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院臨床營養(yǎng)科,遼寧大連 116023; 2.大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院 麻醉二科,遼寧大連 116001; 3.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧大連 116023)

鱘魚類為一類軟骨硬鱗魚,具有極高的經(jīng)濟價值。中國現(xiàn)有鱘魚類為2科3屬8種,分布于長江水系、黑龍江水系以及新疆[1]。鱘魚不僅有豐富的營養(yǎng),還擁有重要的藥用價值。據(jù)《本草拾遺》記載[2]:“鱘魚,肉味甘,性平,無毒。補虛益氣,令人肥健?！?。研究表明,鱘魚含有豐富的不飽和脂肪酸、硫酸軟骨素、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)元素等[3]。這些物質(zhì)往往具有多種多樣的生理活性。因此,鱘魚具有潛在的抗氧化、抗衰老、抗疲勞作用。尋找鱘魚的潛在藥用活性部位,是利用好鱘魚資源的關(guān)鍵之一。研究發(fā)現(xiàn),鱘魚頭的軟骨中含有大量的硫酸軟骨素,因此鱘魚頭也成為硫酸軟骨素新的來源。鱘魚頭經(jīng)過酶解等加工過程,可以獲得肽類、多糖類等具有利用價值的化合物,不但可以獲得鱘魚藥用部位的研究結(jié)果,而且可以極大地提高鱘魚產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟效益。

衰老是機體各組織器官在多種原因、多種生理反應(yīng)作用下發(fā)生的結(jié)果。在提出的許多衰老原因中,免疫功能下降學(xué)說和自由基學(xué)說具有一定的地位[4]。近年來,開發(fā)具有抗衰老作用的多肽類物質(zhì)成為熱點。樊金娟等[5]研究了經(jīng)中性蛋白酶酶解米糠所獲得的米糠抗氧化肽的抗衰老作用,先利用D-半乳糖致衰小鼠構(gòu)建模型,再灌胃米糠抗氧化肽,結(jié)果表明,米糠抗氧化肽組與衰老組相比,高劑量(500 mg/kg bw)米糠抗氧化肽可顯著提高致衰老小鼠心腦線粒體過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、琥珀酸脫氫酶(SDH)和總?cè)姿嵯佘彰?T-ATPase)活性(p<0.05),明顯降低小鼠腦線粒體DNA(mtDNA)缺失突變水平(p<0.01),效果優(yōu)于中、低劑量米糠抗氧化肽組,米糠抗氧化肽具有較好的抗衰老作用。吉雅等[6]研究了大豆短肽顆粒劑對衰老小鼠模型的作用,發(fā)現(xiàn)大豆短肽可以顯著降低衰老小鼠血清和肝組織中的丙二醛(MDA)含量,并顯著升高其超氧化物歧化酶(SOD)活力,而且大豆短肽還可以顯著提高小鼠的免疫功能,促進其脾細胞增殖,因此大豆短肽顆粒劑有顯著的抗衰老和增強免疫的作用。曹新志[7]研究了富含谷胱甘肽制品對小鼠抗衰老能力的影響,發(fā)現(xiàn)飼喂富含谷胱甘肽制品的小白鼠顯著提高了其抗衰老能力。李琳等[8]利用D-乳糖致衰小鼠模型灌胃鳙魚肽,發(fā)現(xiàn)其可使致衰小鼠肝腦組織中MDA的含量明顯下降,腦組織中單胺氧化酶(MAO-B)的活性顯著降低(p<0.01),抗氧化酶SOD和谷胱甘肽過氧化物酶的活性有所提高,并能使致衰小鼠吞噬細胞的吞噬能力顯著提高(p<0.01)。

鱘魚養(yǎng)殖目前成為水產(chǎn)養(yǎng)殖的一個熱點。養(yǎng)殖鱘魚的主要目的是為了獲得鱘魚卵,它是高級魚子醬的重要原料。鱘魚頭是鱘魚加工的主要副產(chǎn)物,目前鱘魚頭并沒有得到很好的利用,主要是因為鱘魚肽(Acipenser schrenki Brandt peptides,ASP)的生物活性沒有很好的研究。本論文對從鱘魚副產(chǎn)物制備的ASP的性質(zhì)進行研究,進而利用D-半乳糖致衰老小鼠模型以及非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究鱘魚肽的抗衰老作用,以期從分子水平上闡述鱘魚肽抗衰老機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鱘魚肽(Acipenser schrenki Brandt peptides,ASP) 分子量介于805～3300 Da,長陽清江鵬博開發(fā)有限公司(湖北武漢);SPF級雄性昆明小鼠(體重18～22 g) 大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(遼)2008-0002];總抗氧化能力(T-AOC)檢測試劑盒、SOD測定試劑盒、MDA測定試劑盒、考馬斯亮藍蛋白質(zhì)測定試劑盒 南京建成生物工程公司;D-半乳糖、十二烷基硫酸鈉(SDS)、尿素、二硫蘇糖醇(DTT)、吲哚乙酸(IAA) Bio-Rad公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、NH4HCO3、三氟乙酸(TFA)、C18Cartridge Sigma公司;BCA定量試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司;胰蛋白酶(Trypsin) Promega公司;10 kDa超濾離心管 Sartorius公司;小鼠-3多重親和去除液相色譜柱(Multiple Affinity Removal LC Column-Mouse 3)、上樣柱(Thermo Scientific Acclaim PepMap100,100 μm×2 cm,nanoViper C18)、分析柱(Thermo scientific EASY column,10 cm,ID75 μm,3 μm,C18-A2) Agilent公司;其它試劑 為國產(chǎn)分析純。

5430R低溫高速離心機、真空離心濃縮儀 Eppendordf公司;Triple TOF 6600+質(zhì)譜儀 AB SCIEX公司;Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀 Agilent公司。

1.2 D-半乳糖致小鼠衰老模型的建立、給藥和處理

將60只SPF級昆明小鼠(雄性)稱重后隨機分為5組,分別為正常組、衰老模型組、鱘魚肽低、中、高濃度劑量組,其中除正常組每天注射等體積生理鹽水外,其他各組每天都皮下組織注射0.5 mL 5% D-半乳糖(生理鹽水配制)。低、中、高濃度劑量組每日分別灌胃一次低濃度100 mg/(kg·d)、中濃度200 mg/(kg·d)、高濃度400 mg/(kg·d)鱘魚肽水溶液,正常組和衰老模型組給予生理鹽水(0.1 mL/20 g),連續(xù)灌胃6周后,稱重,摘眼球取血,離心(3000 r/min 10 min),取上層血清,-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。處死小鼠后迅速取其肝臟和大腦,生理鹽水洗凈,用濾紙吸干血水,各組織稱取0.3 g,制成10%勻漿液,離心(4500 r/min 10 min),取上清液,4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 小鼠體質(zhì)量及組織臟器指數(shù)測定

小鼠在電子天平上稱重后處死,快速取出肝臟、腦、胸腺和脾,生理鹽水洗凈,用濾紙吸干血水,直接在電子天平上稱重,臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

1.4 生化指標(biāo)測定

按試劑盒說明測定小鼠血清中T-AOC能力、SOD活性和MDA含量。

1.5 蛋白質(zhì)組樣品制備

取D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清和鱘魚肽灌胃中、高劑量組等比例混合小鼠血清各50 μL,均采用去血清高豐度親和色譜柱,按照Agilent對應(yīng)方案[9-11]中的操作方法獲得小鼠血清中低豐度蛋白組分。經(jīng)超濾濃縮后加入等體積SDT裂解液,沸水浴裂解小鼠血清中低豐度蛋白15 min,再于14000×g條件下離心20 min。上清采用BCA法進行定量。鱘魚肽灌胃小鼠血清低豐度蛋白質(zhì)樣品標(biāo)記為Z,D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清低豐度蛋白質(zhì)樣品標(biāo)記為M。

1.6 SDS-PAGE電泳

取未經(jīng)去血清高豐度親和色譜柱處理的模型組小鼠血清蛋白(Ori)、D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清低豐度蛋白質(zhì)的3個平行樣本(分別標(biāo)記為M1、M2、M3)和鱘魚肽灌胃小鼠血清低豐度蛋白質(zhì)的3個平行給藥綜合組樣品(分別標(biāo)記為Z1、Z2、Z3)各20 μg,按5∶1(體積比)加入5倍上樣緩沖液,沸水浴5 min,進行12.5% SDS-PAGE電泳。條件:恒流15 mA,電泳時間60 min,考馬斯亮藍染色。

1.7 樣品酶解

分別取各組蛋白質(zhì)樣品30 μL,加入0.003 mmol DTT,沸水浴5 min后冷卻至室溫。加入200 μL尿素緩沖液(8 mol/L尿素,150 mmol/L Tris-HCl,pH8.0)混勻后,在10 kDa超濾離心管中于14000×g離心15 min,棄濾液(重復(fù)該步驟一次:加尿素緩沖液,混勻,超濾),加入100 μL 100 mmol/L IAA緩沖液(以尿素緩沖液溶解),在600 r/min條件下振蕩1 min,室溫避光30 min后于14000×g離心15 min,加入100 μL尿素緩沖液,于14000×g離心15 min(該步驟重復(fù)兩次:加IAA緩沖液、振蕩、避光、離心、加尿素緩沖液、離心),加入100 μL 25 mmol/L NH4HCO3溶液,于14000×g離心15 min兩次,加入40 μL 0.1 g/L胰蛋白酶緩沖液(以100 mmol/L NH4HCO3溶液配制),600 r/min振蕩反應(yīng)1 min,37 ℃靜置16 h。換新收集管,于14000×g離心15 min,再加入40 μL 25 mmol/L NH4HCO3,于14000×g離心15 min并收集濾液。通過C18Cartridge脫鹽凍干后,以40 μL 0.1%甲酸溶液復(fù)溶,測定280 nm吸光值。

1.8 酶解產(chǎn)物的LC-MS/MS鑒定

酶解后的樣品,采用納升流速的HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC進行分離。A相:0.1%甲酸水溶液,B相:0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱以300 nL/min 95%的A相平衡,樣品依次通過上樣柱和分析柱分離。0～50 min,B相線性梯度0%～35%;50～55 min,B相線性梯度35%～100%;55～60 min,B相維持100%。經(jīng)色譜分離后的樣品用Q-Exactive質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜分析。

1.9 MaxQuant的數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件,采用MaxQuant軟件(版本號1.3.0.5)[12-13]進行查庫鑒定,并根據(jù)Label free算法進行定量分析[14-15]。

1.10 基因本體(Gene Ontology,GO)功能注釋

利用Blast2GO[16]對目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進行GO注釋。利用NCBI BLAST+(ncbi-blast-2.2.28+-win32.exe)比對小鼠血清數(shù)據(jù)庫,保留E值≤0.001的前10條,再依次通過提取、注釋。

1.11 KEGG通路注釋及其注釋的富集分析

利用KEGG Automatic Annotation Server軟件[17]獲取目標(biāo)蛋白質(zhì)序列參與的通路信息。通過Fisher精確檢驗評價GO term或KEGG通路蛋白質(zhì)富集度的顯著性水平。

1.12 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 衰老模型組動物一般情況

衰老模型組的小鼠連續(xù)6周皮下組織注射5% D-半乳糖0.5 mL/d(生理鹽水配制)后,小鼠毛色變灰暗,失去光澤,形體瘦弱,行動緩慢以及精神萎靡不振,體質(zhì)量僅增加18.02 g,增加量明顯低于正常級(表1),呈現(xiàn)出明顯衰老體征,表明建模成功。

表1 對小鼠體質(zhì)情況及臟器指數(shù)的影響Table 1 Effects of ASP on body weight and its organs index of mice

2.2 治療組小鼠體質(zhì)變化情況及臟器指數(shù)

各組SPF級雄性昆明小鼠灌胃對應(yīng)溶液6周后,進行體重變化及臟器指數(shù)統(tǒng)計(表1),結(jié)果表明,各組小鼠體重均有所增加,但增加量各不相同。正常組小鼠體質(zhì)量增加21.83 g,鱘魚肽低、高劑量組體重增加量分別為17.22、18.07 g,與正常組相比具有顯著差異(p<0.05),中劑量組增加量為20.04 g,與正常組相比無顯著性差異(p>0.05)。D-半乳糖致小鼠衰老時,致使小鼠代謝紊亂,進而導(dǎo)致體重增加緩慢[18]。

在臟器指數(shù)中,各給藥組的肝指數(shù)和胸腺指數(shù)與正常組相比不顯著(p>0.05),但中、高劑量組的脾指數(shù)與正常組相比,增加顯著(p<0.05),低劑量組的脾指數(shù)增加不顯著(p>0.05);中劑量組的腦指數(shù)低于正常組,變化顯著(p<0.05),且與模型組相比,差異極顯著(p<0.01),而低、高劑量組的腦指數(shù)與正常組相比,差異不顯著(p>0.05)。脾臟是重要的免疫器官,灌胃鱘魚肽后,可以增加脾臟指數(shù),可在一定程度上增強小鼠機體免疫功能。

2.3 生化指標(biāo)檢測

對小鼠血清中T-AOC、SOD活性和MDA含量進行測定,結(jié)果見表2。由表2可見,與模型組相比,灌胃鱘魚肽中、高劑量組極顯著升高了小鼠血清中T-AOC和SOD活性(p<0.01)。灌胃鱘魚肽低、中、高劑量組均能極顯著降低MDA含量(p<0.01)。注射D-半乳糖后,小鼠體內(nèi)T-AOC下降,SOD活性降低,MDA含量升高,從而引起小鼠衰老現(xiàn)象發(fā)生,灌胃鱘魚肽后,小鼠體內(nèi)T-AOC增加,因此,鱘魚肽具有抗D-半乳糖致小鼠衰老作用。

表2 小鼠血清中T-AOC、SOD活性和MDA含量Table 2 T-AOC,SOD activity and MDA content in serum in mice

2.4 血清樣品SDS-PAGE和質(zhì)譜測定

SDS-PAGE(見圖1A)結(jié)果表明,未經(jīng)去血清高豐度親和色譜柱處理的模型組小鼠血清蛋白(Ori)中66 kDa附近蛋白含量過高,影響低豐度蛋白分析,而D-半乳糖致小鼠衰老模型組小鼠血清低豐度蛋白質(zhì)的3個平行樣本M1、M2、M3和鱘魚肽灌胃小鼠血清低豐度蛋白質(zhì)的3個平行給藥綜合組樣品Z1、Z2、Z3電泳條帶清晰,且各平行組內(nèi)樣品平行性良好,可以進行質(zhì)譜驗證樣品平行性。質(zhì)譜分析Basepeak結(jié)果見圖1B和圖1C,從Basepeak圖譜可以看出,組間樣本平行性好,表明酶解效果良好,適合進行非標(biāo)記定量質(zhì)譜測定。

圖1 小鼠血清樣本平行性Fig.1 Samples parallelism of proteins in serum in mice注:A:小鼠血清蛋白SDS-PAGE; B:去除高豐度蛋白的模型組M1小鼠血清蛋白質(zhì)譜圖; C:去除高豐度蛋白的給藥綜合組Z1小鼠血清蛋白質(zhì)譜圖。

2.5 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果統(tǒng)計

通過Maxquant中的Label free算法對二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行非標(biāo)記定量計算結(jié)果如表3,3個模型組鑒定到肽段數(shù)分別為3101、3352、3328個,查庫分別得到295、312、321種蛋白質(zhì);3個灌胃鱘魚肽組鑒定到肽段數(shù)分別為3335、3299、3320個,查庫分別得到321、308、317種蛋白質(zhì)。

表3 蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果統(tǒng)計Table 3 Statistic of identified proteins

通過GO功能注釋,結(jié)果如圖2。小鼠低豐度蛋白參與了21個生理過程,其中蛋白質(zhì)數(shù)目較多的是單生物過程、代謝過程、細胞過程;具有7種分子功能,主要是具有結(jié)合和催化活性功能;存在于10種細胞組分中,主要在細胞部分、細胞、細胞器和細胞膜外區(qū)中。

圖2 基因本體2水平統(tǒng)計Fig.2 GO level 2 statistics

對參與的生物學(xué)過程、具有的分子功能和所處的細胞組分對小鼠血清低豐度表達蛋白質(zhì)進行分類,通過Fisher精確檢驗評價小鼠血清低豐度表達蛋白質(zhì)顯著富集度(表4)。結(jié)果表明,在小鼠血清低豐度表達蛋白質(zhì)中,與M組相比,Z組有4、2和2種顯著表達的蛋白質(zhì)分別參與了糖代謝過程、活性氧響應(yīng)和細胞氧化還原3個生物過程,其富集度分別為0.19、0.4和0.33;而參與信息素結(jié)合、小分子結(jié)合、氣味結(jié)合、轉(zhuǎn)運、異構(gòu)化、糖苷鍵水解和糖化合物水解等7個生物功能的蛋白質(zhì)分別有3、5、3、4、2、2、2種表達顯著。

表4 顯著富集的GO term統(tǒng)計Table 4 Enriched GO terms

在模型組的3個平行組和在灌胃鱘魚肽的3個平行組中,篩選出同一平行組中至少有兩個非空值的數(shù)據(jù),同時根據(jù)蛋白質(zhì)表達差異倍數(shù)>2.0倍(上調(diào)或下調(diào))且p值<0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn),獲得差異表達蛋白質(zhì)3個,其中1個上調(diào),2個下調(diào)(表5),即二磷酸甘油酸變位酶表達量顯著上調(diào)(Z/M為2.07,p<0.05),間α胰蛋白酶抑制劑H4和主要尿蛋白20表達量顯著下調(diào)(Z/M分別為0.38和0.22,p<0.05)。根據(jù)蛋白質(zhì)表達差異倍數(shù)>1.5且p值<0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn),獲得9個蛋白質(zhì)(5個上調(diào),4個下調(diào))進行生物信息分析(表5),其中5種表達上調(diào)的蛋白質(zhì)為二磷酸甘油變位酶、載脂蛋白D、黃素還原酶、纖蛋白-1和過氧化物酶-2,4種表達下調(diào)的蛋白質(zhì)分別為巰基氧化酶1、主要尿蛋白1、間α胰蛋白酶抑制劑H4和主要尿蛋白20。這9種蛋白質(zhì)中,二磷酸甘油酸變位酶、黃素還原酶和過氧化物酶-2分別參與糖酵解途徑、卟啉和葉綠素代謝途徑、細胞凋亡途徑。二磷酸甘油酸變位酶、載脂蛋白D、黃素還原酶和過氧化物酶-2的上調(diào)以及巰基氧化酶1的下調(diào)可以提高機體清除自由基的能力。

表5 進行生物信息學(xué)分析的9種蛋白質(zhì)Table 5 Statistic of the 9 proteins for bioinformatics analysis

生物體內(nèi)的各種蛋白質(zhì)在行使其生物功能時,常常需要其他相關(guān)蛋白質(zhì)參與。將這些相互作用的蛋白質(zhì)以網(wǎng)絡(luò)形式連接,從而獲得蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)。灌胃鱘魚肽小鼠差異表達蛋白質(zhì)的交互作用網(wǎng)絡(luò)見圖3。從圖中可以看出,主要尿蛋白1(AC:Q4FZE8,基因名Mup1)、間α胰蛋白酶抑制劑H4(AC:A6X935,基因名Itih4)、二磷酸甘油酸變位酶(AC:P15327,基因名Bpgm)、黃素還原酶(AC:Q923D2,基因名Blvrb)、過氧化物酶-2(AC:Q61171,基因名Prdx2)、纖蛋白-1(AC:Q08879,基因名Fbln1)分別與4、4、1、2、9和1種蛋白具有交互作用。

圖3 差異表達蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI networks of the 9 proteins

3 結(jié)論

本研究通過D-半乳糖致小鼠衰老實驗,發(fā)現(xiàn)鱘魚肽可以引起小鼠體重、脾指數(shù)、血清中T-AOD和SOD活力增加,并同時降低MDA含量。去除高豐度蛋白后的小鼠血清樣本中,鱘魚肽可以導(dǎo)致小鼠血清中二磷酸甘油酸變位酶、載脂蛋白D、黃素還原酶和過氧化物酶-2的表達上調(diào),并導(dǎo)致巰基氧化酶1表達量下調(diào),這些蛋白質(zhì)表達量的增加或降低,可以提高機體清除自由基的能力,延緩小鼠衰老過程。這些結(jié)果表明,分子量為805～3300的鱘魚肽具有抗小鼠衰老作用。