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    組蛋白去乙?;敢种苿〤UDC-101對去勢抵抗性前列腺癌AR-V7表達(dá)的影響

    2020-04-20 10:39:21張燁張璐劉修恒
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào) 2020年7期
    關(guān)鍵詞:前列腺癌

    張燁 張璐 劉修恒

    [摘要] 目的 探討組蛋白去乙?;敢种苿〤UDC-101對去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)雄激素受體剪切變異體7(AR-V7)表達(dá)的影響,為臨床提供相應(yīng)的理論參考。 方法 2018年1月~2019年6月通過免疫印跡法對CRPC的PC-3、VCaP、22Rvl、LNCap等17株細(xì)胞株中的AR-V7蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測,篩選AR-V7表達(dá)最高細(xì)胞株進(jìn)一步研究。并按照不同抑制劑分為MG149組和CUDC-101組,比較兩種抑制劑對CRPC細(xì)胞中AR-V7表達(dá)降低情況。再按照不同制劑方法分為單獨(dú)使用MDV3100組、30 nmol劑量CUDC-101聯(lián)合應(yīng)用組、300 nmol劑量CUDC-101聯(lián)合應(yīng)用組,分析對CRPC細(xì)胞中AR-V7表達(dá)的影響。 結(jié)果 CRPC細(xì)胞株22Rvl存在AR-V7陽性表達(dá),PC-3、VCaP和LNCap等CRPC細(xì)胞株,均未發(fā)現(xiàn)AR-V7陽性表達(dá)。CUDC-101組AR-V7表達(dá)陽性率低于MG149組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。30、300 nmol 劑量CUDC-101聯(lián)合應(yīng)用組AR-V7陽性表達(dá)率均低于單獨(dú)使用MDV3100組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。 結(jié)論 組蛋白去乙?;敢种苿〤UDC-101應(yīng)用在CRPC患者中,可以降低AR-V7表達(dá)水平,提高內(nèi)分泌治療敏感性,具有治療CRPC的潛力。

    [關(guān)鍵詞] 組蛋白去乙?;敢种苿?CUDC-101;前列腺癌;雄激素受體剪切變異體7

    [中圖分類號] R733.7? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210(2020)03(a)-0011-04

    [Abstract] Objective To investigate the effect of histone deacetylase inhibitor CUDC-101 on the expression of androgen receptor shear variant 7 (AR-V7) in castration-resistant prostate cancer (CRPC), and to provide relevant theoretical reference for clinical practice. Methods From January 2018 to June 2019, the expression of AR-V7 protein in CRPC PC-3, VCaP, 22Rvl, LNCap and other 17 cell lines were detected by immunoblotting, while the highest AR-V7 expression was screened further the study. According to different inhibitors, the cell lines were divided into MG149 group and CUDC-101 group. The two inhibitors were compared to reduce the expression of AR-V7 in CRPC cells. Then according to different preparation methods, the cell lines were divided into using MDV3100 alone group, 30 nmol dose CUDC-101 combined application group, and 300 nmol dose CUDC-101 combined application group. The effects on the expression of AR-V7 in CRPC cells were analyzed. Results CRPC cell line 22Rvl had AR-V7 positive expression, and PC-3, VCaP and LNCap CRPC cell lines did not find AR-V7 positive expression. The positive rate of AR-V7 expression in the CUDC-101 group was lower than that in the MG149 group, and the difference was statistically significant (P < 0.05). The AR-V7 positive expression rate 30, 300 nmol dose CUDC-101 combined application group were lower than that in the MDV3100 group alone, and the differences were statistically significant (P < 0.05). Conclusion Histone deacetylase inhibitor CUDC-101 can reduce the expression level of AR-V7, while improve the sensitivity of endocrine therapy. It has the potential to treat CRPC.

    [Key words] Histone deacetylase inhibitors; CUDC-101; Prostate cancer; Androgen receptor splice variants 7

    前列腺癌是指發(fā)生在前列腺的上皮性惡性腫瘤,好發(fā)于中老年群體,尤其是70歲以上老年群體發(fā)病率保持在較高水平,是男性泌尿系統(tǒng)發(fā)病率較高的惡性腫瘤[1]。流行病學(xué)調(diào)查顯示[2],全世界每年因前列腺癌死亡的男性患者數(shù)量超過25萬,并仍然呈上升趨勢。前列腺癌發(fā)病原因比較復(fù)雜,目前普遍認(rèn)為前列腺癌發(fā)生與發(fā)展依賴于雄激素(AR)信號傳導(dǎo)以及雄激素本身,即AR信號持續(xù)傳導(dǎo)在支持腫瘤細(xì)胞存活方面發(fā)揮著積極作用[3]。針對目前臨床對前列腺癌的治療,對于AR信號通路的過度激活普遍采用雄激素剝奪治療。盡管最初有一定效果,但是絕大部分患者在一段時(shí)間的治療后會產(chǎn)生不同程度的抵抗,逐步進(jìn)展為去勢抵抗性前列腺癌(CRPC)[4]。CRPC的發(fā)生意味著前列腺癌發(fā)展到嚴(yán)重程度,病情十分危急,是臨床上棘手的難題[5]。雄激素受體剪切變異體7(AR-V7)是AR的重要變異體,由于特殊的結(jié)構(gòu)受到越來越多的關(guān)注。同時(shí),研究顯示其與CRPC的發(fā)生發(fā)展以及耐藥性的形成存在密切的關(guān)系,與患者的預(yù)后存在密切聯(lián)系[6]。近年來,隨著CRPC的研究不斷深入,有研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙?;敢种苿τ贑RPC患者AR表達(dá)具有一定的抑制作用,但目前并無太多報(bào)道。本研究通過分析組蛋白去乙?;敢种苿〤UDC-101的應(yīng)用對于CRPC患者AR-V7表達(dá)的影響,探究其對于CRPC治療并取得了理想效果?,F(xiàn)報(bào)道如下:

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    組蛋白去乙?;敢种苿┲蠧UDC-101和MG149抑制劑(上海賽導(dǎo)通生物科技公司,871026-44-7);MDV3100(北京樂博生物科技公司,915087-33-1)。中科院研究所提供PC-3、VCaP、22Rvl、LNCap等前列腺癌細(xì)胞株??谷薃R-V7特異性小鼠抗體(GR2195 17-16)及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠抗體(1387300604)分別購自Abcam公司及上海碧云天生物科技公司,細(xì)胞活性檢測試劑盒(080719190830)購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司。

    1.2 方法

    前列腺細(xì)胞的培育和給藥檢測,嚴(yán)格按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行操作。采用免疫印跡法對AR-V7表達(dá)情況進(jìn)行檢測:在完成前列腺癌細(xì)胞的培養(yǎng)之后,對細(xì)胞總蛋白進(jìn)行提取,并對其濃度予以測定,進(jìn)行蛋白電泳、轉(zhuǎn)膜處理。轉(zhuǎn)膜完成后,使用濃度為5%脫脂奶粉溶液將其封閉,1 h后加入抗人AR-V7特異性小鼠抗體。第2天清晨洗滌3次后加入HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體,1 h后洗滌4次加人ECL試劑,使用化學(xué)發(fā)光法獲取目標(biāo)條帶,使用bandscan(version 5.0)凝膠圖像分析軟件測定灰度值,進(jìn)而比較AR-V7表達(dá)的差異。

    采用免疫印跡法對不同前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3、VCaP、22Rvl、LNCapAR-V7陽性的表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測:分別向不同的前列腺癌細(xì)胞株中加入濃度20 μmol的MDV3100,而后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。進(jìn)一步檢測蛋白去乙?;敢种苿┲蠧UDC-101和MG149抑制劑對前列腺癌細(xì)胞株陽性表達(dá)的影響:AR-V7陽性的細(xì)胞株中,分別加入CUDC-101和MG149抑制劑,2 d后收集不同的細(xì)胞株,使用免疫印跡法檢測AR-V7的表達(dá)。進(jìn)一步比較CUDC-101聯(lián)合MDV3100對前列腺癌細(xì)胞株AR-V7陽性表達(dá)的影響:AR-V7陽性的細(xì)胞株中,分別加入30 nmol、300 nmol的CUDC-101以及30 μmol的MDV3100,2 d后收集不同的細(xì)胞株,使用免疫印跡法檢測AR-V7的表達(dá)。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示,比較采用χ2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 免疫印跡試驗(yàn)結(jié)果分析

    CRPC患者細(xì)胞株P(guān)C-3、VCaP和LNCap,均不存在AR-V7陽性表達(dá)情況(AR-V7陽性表達(dá)率為0.00%)。CRPC患者細(xì)胞株22Rvl,存在AR-V7陽性表達(dá),AR-V7陽性表達(dá)率為75.60%。細(xì)胞株22Rvl處理后AR-V7陽性表達(dá)率高于其他細(xì)胞株,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見圖1。

    2.2 CUDC-101和MG149處理細(xì)胞株22Rvl后AR-V7陽性表達(dá)率比較

    蛋白去乙?;敢种苿┲蠧UDC-101和MG149分別處理CRPC細(xì)胞株22Rvl后,CUDC-101組AR-V7陽性表達(dá)率低于MG149組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)。見表1。

    2.3 不同抑制方法對前列腺癌細(xì)胞株的抑制作用比較

    30 nmol劑量CUDC-101聯(lián)合MDV3100組及300 nmol劑量CUDC-101聯(lián)合MDV3100組對AR-V7陽性表達(dá)的抑制率均高于單獨(dú)使用MDV3100組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2 = 4.250、5.765,P < 0.05)。30 nmol劑量CUDC-10聯(lián)合MDV3100組與300 nmol劑量CUDC-101聯(lián)合MDV3100組抑制率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P > 0.05)。見表2。

    3 討論

    我國前列腺癌患者很大一部分在初診時(shí)已處于中晚期,手術(shù)效果不理想或已失去手術(shù)根治的機(jī)會,內(nèi)分泌治療是主要治療方法,因此CRPC患者比例在增加[8]。在前列腺癌患者中,普遍存在前列腺特異性抗原升高的現(xiàn)象,并且以CRPC患者表現(xiàn)得尤為明顯,而又受到AR通路調(diào)節(jié),升高幅度因此受影響[9]。臨床實(shí)踐調(diào)查顯示,采用內(nèi)分泌治療后,幾乎所有患者在取得最初良好收益后,病情會逐步發(fā)展為CRPC[10]。而AR通路過度激活,被領(lǐng)域內(nèi)研究學(xué)者認(rèn)為是進(jìn)展的主要原因[3,11]。MDV3100和阿比特龍,可以通過結(jié)合AR,阻斷受體與雄激素結(jié)合,從而降低AR的陽性表達(dá),對抗腫瘤的生長[12]。該方法能夠在一定程度上延長患者的生存期,一般在5個(gè)月作用,但是在遠(yuǎn)期產(chǎn)生耐藥性的可能性非常大,疾病的惡化同樣會出現(xiàn)[13]。

    AR信號通路的作用,從前列腺癌的發(fā)病、發(fā)展到惡化,直至患者死亡,始終存在并出現(xiàn)。作用機(jī)制表現(xiàn)為:雄激素結(jié)合AR后,構(gòu)象發(fā)生變化而被激活,可進(jìn)一步激活一系列下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo),促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生長,進(jìn)而影響疾病的變化發(fā)展[14]。AR通路傳導(dǎo)在支持前列腺細(xì)胞存活方面發(fā)揮積極作用,通過以下3種方式上調(diào):增加雄激素生物合成、AR擴(kuò)增及過表達(dá)、AR突變。AR-V7是AR突變的重要表現(xiàn)形式,也是AR信號通路的重要介質(zhì)之一,AR-V7的持續(xù)激活被認(rèn)為是AR通路過渡激活的主要因素之一[15]。相關(guān)研究顯示[16],MDV3100和阿比特龍無法阻斷AR-V7的激活,而這也導(dǎo)致了AR-V7能夠在雄激素水平較低的情況下對任意前列腺癌細(xì)胞遺傳物質(zhì)的控制,誘發(fā)細(xì)胞的生長增殖和擴(kuò)散轉(zhuǎn)移,從而導(dǎo)致耐藥性的出現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示,AR-V7陽性的細(xì)胞株22Rvl對MDV3100具有很強(qiáng)的耐藥性,進(jìn)一步提示AR-V7在前列腺癌細(xì)胞對MDV3100耐藥性的產(chǎn)生過程中發(fā)揮積極作用。

    現(xiàn)已證明在雄激素存在的條件下,AR-V7具有AR的活性;而在沒有雄激素配體的情況下,AR-V7在大量共調(diào)節(jié)因子的幫助下完成最終的激活并調(diào)控其下游基因的轉(zhuǎn)錄,增強(qiáng)AR的轉(zhuǎn)錄活性,與CRPC密切相關(guān)[17]。因此,有學(xué)者認(rèn)為[18-19],可以將AR-V7的表達(dá)水平的高低作為預(yù)測CRPC患者預(yù)后的重要指標(biāo),AR-V7過度表達(dá)則往往意味著CRPC復(fù)發(fā)率和死亡率的上升。若降低CRPC患者的AR-V7表達(dá)水平能夠改善患者抗雄治療效果,間接提示AR-V7可以其促進(jìn)耐藥性的產(chǎn)生[20-21]。相關(guān)研究顯示[22],前列腺癌中的AR-V7表達(dá)與表觀修飾可能存在一定的聯(lián)系。表觀遺傳抑制劑包括許多類型,本實(shí)驗(yàn)CUDC-101便是其中一種。表觀遺傳抑制劑與內(nèi)分泌治療藥物聯(lián)合應(yīng)用在前列腺癌領(lǐng)域顯現(xiàn)出巨大的潛力[23-24]。本研究結(jié)果顯示,使用CUDC-101處理CRPC細(xì)胞株22Rvl后,AR-V7陽性表達(dá)率低于蛋白去乙?;敢种苿┲蠱G149(P < 0.05),提示CUDC-101對CRPC細(xì)胞株22Rvl中AR-V7陽性表達(dá)的抑制效果更好。在不同抑制方法方面,30、300 nmol的CUDC-101聯(lián)合MDV3100使用AR-V7陽性表達(dá)率低于MDV3100單獨(dú)使用(P < 0.05),這主要是因?yàn)槁?lián)合使用降低了CRPC耐藥性,對AR-V7陽性表達(dá)的抑制作用更明顯,同樣為CRPC新藥的研究探索新方向。但是本研究也存在一定的不足,不同藥物濃度對AR-V7陽性表達(dá)的抑制效果并無進(jìn)一步分析,需要在今后研究中加以改進(jìn)。

    綜上所述,在CRPC患者中采用組蛋白去乙?;敢种苿〤UDC-101可以降低AR-V7表達(dá)水平,可作為治療CRPC潛在治療藥物。

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    (收稿日期:2019-09-10? 本文編輯:王曉曄)

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