SPF級大鼠、小鼠IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)玉米芯墊料使用量的探討

高婷婷 孫天奇 劉鑫鑫 任延玲 邱業(yè)峰 王 進 侯 婷 袁 征 張 濤

(軍事醫(yī)學研究院實驗動物中心，北京 100071)

墊料是實驗動物直接接觸的微環(huán)境因素，是影響實驗動物健康、福利和動物實驗結(jié)果的國際公認的重要環(huán)境條件之一[1-2]。它不僅能滿足嚙齒類動物啃咬、做窩的生活習性，還能吸附排泄物，降低籠內(nèi)氨氣濃度，保持籠內(nèi)環(huán)境干燥，抑制有害細菌生長，起到維持飼養(yǎng)籠具和環(huán)境清潔衛(wèi)生的作用[3-6]。但目前僅河北、江蘇地區(qū)的地方標準對實驗動物墊料質(zhì)量做了要求。實驗動物墊料多種多樣，既有自然材料也有人工材料[7]。研究顯示，實驗動物日常飼養(yǎng)管理中,采用玉米芯替代刨花后,可以適當延長換窩間隔,但具體使用量不明確[8-9]。相同換籠周期下，理論上認為墊料使用量越多，其功效越好，對實驗動物生長因素的影響越小，但會增加成本和工作量。而墊料使用量太少不利于實驗動物健康和福利，且換籠周期對籠盒內(nèi)潔凈度有較大影響。在符合標準的最大飼養(yǎng)密度下，國內(nèi)實驗動物機構(gòu)大鼠、小鼠換籠周期多為7～14 d[8]，國外多為14～21 d[10]。為了確定屏障環(huán)境內(nèi)IVC系統(tǒng)飼養(yǎng)的大鼠、小鼠籠盒玉米芯墊料的適宜使用量及其換籠周期，本研究對此進行了初步探討。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

玉米芯顆粒墊料直徑6～8 mm，購自欣淼木材加工有限公司；IVC小鼠籠盒尺寸(寬×深×高)0.43×0.165×0.174 m，IVC大鼠籠盒尺寸(寬×深×高)0.461×0.274×0.228 m，均購自泰尼百斯公司。

1.2 實驗動物

8周齡C57雌性小鼠45只，8周齡SD雌性大鼠27只，均購買于北京斯貝福生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2019-0010。此實驗經(jīng)實驗動物管理與使用委員會審核，編號：IACUC-DWZX-2018-302。

1.3 屏障環(huán)境條件及IVC主機參數(shù)

大鼠和小鼠飼養(yǎng)于實驗動物中心動物房內(nèi)，設施許可證號：SYXK(軍)2017-0022。環(huán)境溫度23～26 ℃，濕度45%～70%，通風換氣量≥20次/h，主機通風換氣次數(shù)75次/h，飼養(yǎng)架為泰尼百斯藍線NEXT系列TN144型和HN36型。

1.4 方法

1.4.1實驗分組：按照飼養(yǎng)墊料的使用量，實驗分為低墊料組、中墊料組和高墊料組。C57小鼠飼養(yǎng)于小鼠籠盒內(nèi)，隨機分為3組，分別為Mouse低、Mouse中、Mouse高，每組5只，組間3個重復。SD大鼠飼養(yǎng)于大鼠籠盒內(nèi)，隨機分為3組，分別為Rat低、Rat中、Rat高，每組實驗動物3只，組間3個重復。小鼠、大鼠籠盒墊料使用量按表1添加。

表1 小鼠、大鼠籠盒墊料使用量Table 1 The amount of pad material used in mouse and rat cage

1.4.2體質(zhì)量：將實驗動物放入籠盒內(nèi)時分別對其初始體質(zhì)量進行稱重、記錄，在飼養(yǎng)過程中，每3天進行一次稱重并記錄，連續(xù)記錄21 d。

1.4.3采食量：將實驗動物放入籠盒內(nèi)時，分別稱取對應相同質(zhì)量的飼料(±0.1 g)置于籠盒飼料架上，其中小鼠實驗組分別稱取200 g，大鼠實驗組分別稱取400 g。實驗開始后，每3天稱量飼料架上的剩余飼料量后，再分別添加新鮮飼料(小鼠實驗組200 g，大鼠實驗組400 g)，記錄實驗動物每3天的采食量，連續(xù)記錄21 d。

1.4.4糞便量：將干凈底盒裝入墊料后稱重，即為初始重量，實驗期間不更換籠盒和墊料，每3天稱量1次籠盒帶墊料的重量，連續(xù)記錄21 d，計算糞便量(g)=實驗天稱量重量(g)-初始重量(g)

1.4.5籠盒污染評價：通過肉眼對墊料的色澤和糞便的污染比例進行評分，從而對墊料的污染情況做出評價。干凈墊料記為0分，污染越重分值越高，污染最嚴重的墊料記為5分。根據(jù)每日糞便量的多少、墊料的污染情況評分，總分5分。實驗結(jié)束時墊料的污染情況記為5分。每3天拍照記錄墊料污染情況，連續(xù)記錄21 d。

1.4.6統(tǒng)計方法：利用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學處理及作圖，組間采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 墊料使用量對體質(zhì)量的影響

由圖1可知，各實驗組小鼠體質(zhì)量隨著飼養(yǎng)天數(shù)的增加呈上升趨勢，但無統(tǒng)計學差異。3個實驗組小鼠平均初始體重17.5 g，實驗前3天體增重8%。3 d后體質(zhì)量增長趨勢變緩，每3天平均體增重2.5%。15～21 d，Mouse中組體質(zhì)量高于其他2組，但無統(tǒng)計學差異。

圖1 不同實驗組小鼠的體質(zhì)量變化Fig.1 The weight changes of mouse

由圖2可知，各實驗組大鼠體質(zhì)量隨飼養(yǎng)天數(shù)的增加呈上升趨勢，但無統(tǒng)計學差異。3個實驗組的大鼠平均初始體質(zhì)量為198 g，實驗前3 d體增重5%，3 d后體質(zhì)量增加趨勢變緩。3～21 d，Rat低組體質(zhì)量低于其他兩組。18 d時Rat高組體質(zhì)量高于其他兩組，但無統(tǒng)計學差異。

圖2 不同實驗組大鼠的體質(zhì)量變化Fig.2 The weight changes of rats

2.2 墊料使用量對采食量的影響

由圖3可知，實驗過程中各實驗組小鼠的采食量變化趨勢較一致，但無統(tǒng)計學差異。實驗前3 d，3個實驗組小鼠每只采食量平均10 g左右。3～12 d，各實驗組小鼠采食量減少，平均每3 d采食量減少7%。12～18 d，各組采食量增加，且18 d時采食量在10 g左右，18 d后各組采食量減少。

圖3 不同實驗組小鼠的采食量變化Fig.3 The feed intake changes of mouse

由圖4可知，實驗過程中各實驗組大鼠采食量變化趨勢較一致，但無統(tǒng)計學差異。實驗前3 d，各實驗組大鼠每只采食量平均在38.6 g左右。3～9 d，各組采食量增加，Rat低組采食量低于其他2組。9～21 d，各組采食量呈下降趨勢。

圖4 不同實驗組大鼠的采食量變化Fig.4 The feed intake changes of rats

2.3 墊料使用量對糞便量的影響

由圖5可知，實驗過程中各組小鼠糞便量前6 d較為一致，每只小鼠每3 d糞便量平均約為5 g。9～21 d，Mouse中組的糞便量高于其他2組，Mouse低組的糞便量低于其他2組，但各組之間無統(tǒng)計學差異。

圖5 不同實驗組小鼠的糞便量變化Fig.5 The fecal weight changes of mouse

由圖6可知，實驗過程中各組大鼠糞便量變化趨勢一致，且前6 d變化較小。每只大鼠每3 d糞便量約為18 g。6～21 d,Rat低組糞便量低于其他2組，各組之間無統(tǒng)計學差異。

圖6 不同實驗組大鼠的糞便量變化Fig.6 The fecal weight changes of rats

2.4 墊料潔凈度評價

圖7顯示了小鼠不同墊料清潔度對應的評分標準。第0天小鼠干凈墊料的評分記錄為0分，糞便量僅在墊料中占2%左右記錄為1分；糞便量的堆積占據(jù)飼養(yǎng)籠盒內(nèi)一角(明顯)記錄為2分；糞便量的堆積占據(jù)飼養(yǎng)籠盒內(nèi)兩角(明顯)記錄為3分；糞便量的堆積占據(jù)飼養(yǎng)籠盒內(nèi)兩角且中間零散分布部分糞便(明顯)記錄為4分；糞便量的堆積占據(jù)飼養(yǎng)籠盒內(nèi)兩角且中間零散分布糞便占籠盒面積的50%(明顯)記錄為5分。

圖7 小鼠不同墊料清潔度對應的評分標準Fig.7 The scoring standard corresponding to cleanliness of different bedding materials in mice

由圖8可知，各實驗組小鼠墊料潔凈度第6天均達到2分，且無統(tǒng)計學差異。6～21 d，Mouse高組墊料潔凈度評分低于其他2組，且9 d后Mouse高組與Mouse中組差異顯著(P<0.05)，12 d后，Mouse高組與Mouse低組差異顯著(P<0.001)。Mouse低組與Mouse中組潔凈度9 d時接近3分，Mouse高組潔凈度21 d達到3分。

圖8 各實驗組小鼠的墊料潔凈度變化Fig.8 The changes of bedding cleanliness of mice in each experimental group

圖9顯示了大鼠不同墊料清潔度對應的評分標準。第0天大鼠干凈墊料的評分記錄為0分，糞便量僅在墊料中占10%左右記錄為1分，糞便量的堆積占據(jù)飼養(yǎng)籠盒面積的30%左右記錄為2分；糞便量的堆積占據(jù)飼養(yǎng)籠盒面積的50%左右記錄為3分；糞便量的堆積占據(jù)飼養(yǎng)籠盒面積的70%左右記錄為4分；糞便量的堆積占據(jù)飼養(yǎng)籠盒面積的90%(明顯)記錄為5分。

圖9 大鼠不同墊料清潔度對應的評分標準Fig.9 The scoring standard corresponding to cleanliness of different bedding materials in rats

由圖10可知，實驗組大鼠墊料潔凈度第6天時均達到2分，且無統(tǒng)計學差異；6～21 d，Rat中組潔凈度評分高于其他2組，Rat高組潔凈度評分低于其他2組，且均無統(tǒng)計學差異。12 d時，Rat中組與Rat高組差異顯著(P<0.01)。Rat低組與Rat中組潔凈度9 d時接近3分，Rat高組潔凈度12 d時接近3分。

圖10 各實驗組大鼠墊料的潔凈度變化Fig.10 The changes of bedding cleanliness of rat in each experimental group

3 討論

墊料使用量和更換周期影響大鼠和小鼠的生活環(huán)境、動物福利甚至實驗結(jié)果。而定期更換滅菌墊料是飼養(yǎng)過程中工作量較大的環(huán)節(jié)。大鼠和小鼠對環(huán)境變化比較敏感，日常墊料的更換工作，也會對其生理狀態(tài)造成一定應激反應[11]。所以探討合理的墊料使用量及換籠周期對規(guī)范實驗動物飼養(yǎng)工作具有重要意義。目前常用墊料種類有刨花、木屑、秸稈、玉米芯、新型墊料、再生紙等，但由于原料成分混雜，來源不明，墊料質(zhì)量控制尚未有明確國家標準和管理條例監(jiān)管。刨花墊料在使用過程中粉塵量大，吸濕性能較差，采用7 d換籠時籠盒內(nèi)微環(huán)境濕度較大，潔凈度較差，且刨花分裝時不利于飼養(yǎng)人員職業(yè)健康安全。改成玉米芯墊料后，粉塵量減少，吸濕性能好，且屏障環(huán)境內(nèi)配備IVC系統(tǒng)，7 d換籠時籠盒內(nèi)濕度正常，墊料潔凈度較好。

本研究結(jié)果顯示，大鼠和小鼠使用的3組墊料對體質(zhì)量無明顯影響，前3 d體質(zhì)量增加較大可能是由于飼料適口性較好使采食量增加，從而促進體質(zhì)量增加。這也與小動物改變生活環(huán)境后至少適應性飼養(yǎng)3 d需求相符合。研究結(jié)果顯示，大鼠和小鼠不同墊料使用量對飼料采食量、糞便量無明顯影響，說明3組墊料使用量沒有對大鼠和小鼠造成明顯的健康應激。墊料潔凈度是直觀反映是否需要更換籠盒的依據(jù)。在日常工作中，更換籠盒時一般籠盒內(nèi)墊料潔凈度評分在3分左右，在本研究中小鼠低墊料組和中墊料組在實驗第9天時接近3分，高墊料組在第21天達到3分；大鼠低墊料組和中墊料組第9天達到3分，高墊料組第9天之后達到3分。動物房前期使用墊料量處于中墊料組，更換周期為一周一換。本研究結(jié)果表明，小鼠采用低墊料量的情況下，換籠周期可以調(diào)整至12 d一換，大鼠換籠周期調(diào)整至9 d一換，可以采用低墊料組，隨著換籠周期的延長而增加墊料使用量，例如節(jié)假日，尤其是時間較長的節(jié)假日可調(diào)整為14 d換籠，但要增加籠內(nèi)墊料使用量。此更換周期，減少大鼠和小鼠對環(huán)境敏感性的應激反應以及人員工作量，同時也大大減少動物房經(jīng)濟支出。

SPF級大鼠和小鼠都需飼養(yǎng)于屏障或隔離系統(tǒng)中，飼養(yǎng)模式有屏障系統(tǒng)、層流架、IVC、EVC、隔離罩等。IVC系統(tǒng)為采用微型隔離技術(shù)，通過獨立通風系統(tǒng)向每個籠盒內(nèi)部輸送經(jīng)過過濾的空氣，獲得潔凈度在100級以上的大鼠和小鼠生活環(huán)境，且能夠?qū)⒏骰\盒之間、籠盒與環(huán)境之間進行有效隔離開來，減少動物之間發(fā)生交叉污染幾率，也能更好控制實驗動物與工作人員之間感染的風險[12-14]。本研究中，大鼠、小鼠所處屏障環(huán)境溫度23～26 ℃，濕度45%～70%，氣流速度≤0.01，換氣次數(shù)≥20次/h(定值，15次/h)，IVC系統(tǒng)通風換氣次數(shù)75次/h。屏障環(huán)境為全新風系統(tǒng)，IVC主機送風為屏障環(huán)境內(nèi)取風，所以屏障環(huán)境內(nèi)的參數(shù)對大鼠和小鼠籠盒內(nèi)的小環(huán)境有直接的影響。本研究選用玉米芯墊料，其自身吸水吸濕性能好，同時來自IVC系統(tǒng)的獨立通風換氣，使籠盒內(nèi)潔凈度在短期飼養(yǎng)內(nèi)評分較低，延長籠盒換籠周期，減少大鼠和小鼠的環(huán)境適應性。

綜上所述，本研究探討了SPF級大小鼠在標準IVC飼養(yǎng)系統(tǒng)中玉米芯墊料的合理使用量，證實不同墊料使用量對大鼠和小鼠體質(zhì)量、飼料采食量、糞便量、潔凈度無明顯影響。研究結(jié)果可為制定相關(guān)玉米芯墊料使用量標準或大鼠和小鼠更換籠盒周期提供參考。