選擇性COX-2抑制劑聯(lián)合順鉑對肺癌新生血管的影響及機(jī)制研究

魏慧 張卿

1內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科,呼和浩特010010;2內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,呼和浩特010010

肺癌是臨床發(fā)病率、病死率居于各種惡性腫瘤之首[1]。臨床患者中約60%～68%發(fā)現(xiàn)肺癌時已屬晚期,已失去了手術(shù)機(jī)會,目前治療主要以含“鉑類方案”為主[2],但其不良反應(yīng)較多導(dǎo)致患者依從性差、生活質(zhì)量降低,且易產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。

有研究表明,隨著腫瘤細(xì)胞血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)蛋白的表達(dá)增加[3],肺癌移植瘤微血管密度(ministerstvo vnutrennikh del,MVD)增高[4],MVD表達(dá)高,腫瘤組織可以獲得充足的血液供應(yīng),滿足了腫瘤細(xì)胞快速生長的需要,癌細(xì)胞更易于生長和轉(zhuǎn)移[5]。MVD計數(shù)越高,表明腫瘤的新生血管越多,腫瘤生長越快,而且與腫瘤患者臨床分期及腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)性[6]。

抗腫瘤血管生成治療,并聯(lián)合細(xì)胞毒藥物化療,已經(jīng)成為當(dāng)今腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點之一。本研究構(gòu)建肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤模型,以尼美舒利(nimesulide,NIM)、順鉑(cisplatin,DDP)對肺癌荷瘤鼠進(jìn)行藥物干預(yù),計算干預(yù)后裸鼠移植瘤的抑瘤率,用免疫組織化學(xué)的方法檢測藥物干預(yù)后裸鼠移植瘤新生血管密度,以及相關(guān)血管生長因子VEGF的蛋白表達(dá),以明確選擇性環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)抑制劑NIM聯(lián)合DDP對肺癌新生血管的影響,并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

1.1.1 細(xì)胞株 人肺癌細(xì)胞株A549購買于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所,培養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)臨床研究中心細(xì)胞培養(yǎng)室。

1.1.2 實驗動物 4周齡雌性BALB/C裸鼠36只,體質(zhì)量16～18 g,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心裸鼠室(SPF級),實驗裸鼠許可證號:SCXK(京2012-0001)。

1.1.3 主要試劑及生化材料 (1)胎牛血清、胰蛋白酶、RPIM-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;(2)COX-2抗 體、TGF-β 抗 體 購 自 美 國Santa Cruz Biotechnology公司,生產(chǎn)批號:sc-166475、sc-130348;(3)VEGF、b-FGF鼠抗人單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司,產(chǎn)品編號:MAB-0243、RAB-0305;(4)DDP凍干粉購自山東齊魯制藥廠;(5)NIM購自安徽仁和藥業(yè)有限公司;(6)裸鼠生長繁殖飼料購自北京科澳協(xié)力飼料公司;(7)KIT-5010試劑盒、EDTA修復(fù)液Max Vision試劑盒(鼠/兔,生產(chǎn)批號:150121407C)購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)肺癌A549細(xì)胞株 RPIM-1640培養(yǎng)基80%,胎牛血清19%,雙抗1%,配成完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)A549細(xì)胞,置于37℃,5% CO2飽和濕度恒溫培養(yǎng)箱中,細(xì)胞即可擴(kuò)增,取對數(shù)生長期細(xì)胞傳代。

1.2.2 細(xì)胞計數(shù) 細(xì)胞生長呈對數(shù)生長期時,用于細(xì)胞計數(shù)。細(xì)胞數(shù)/ml=4大格細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)×104/4;每一大格的體積為=0.1 cm×0.1 cm×0.01 cm=10-4ml。

1.2.3 構(gòu)建肺癌A549裸鼠移植瘤模型 36只裸鼠無菌飼養(yǎng)3 d后行荷瘤術(shù)。取對數(shù)生長期A549肺腺癌細(xì)胞,用胰酶消化后,溶于PBS液中離心3次,189×g每次離心5min,細(xì)胞計數(shù)1×107/ml的細(xì)胞懸液,無菌操作注射于裸鼠背部皮下組織,0.2 ml/只。

1.2.4 實驗分組和藥物干預(yù) 荷瘤后密切觀察并測量瘤徑,待瘤徑約4～5 mm時,即荷瘤8 d時,36只裸鼠中4只未成瘤,將32只荷瘤鼠隨機(jī)分為對照組、NIM組、DDP組、NIM+DDP組,每組8只,做好標(biāo)記。

1.2.5 標(biāo)本采集和固定 用藥21 d結(jié)束后停藥,第22天測量瘤徑后處死裸鼠,剝離皮下移植瘤,并稱瘤重,迅速放入福爾馬林溶液中,固定48 h后修剪、沖洗、脫水、固定、包埋等,待切片做免疫組織化學(xué)、HE染色。

1.2.6 藥物對腫瘤生長的抑制效應(yīng) 體積抑制率=(對照組移植瘤體積-用藥組瘤體積)/對照組瘤體積×100%;

1.2.7 對肺癌A549裸鼠移植瘤組織內(nèi)血管生長因子進(jìn)行測定 采用免疫組織化學(xué)方法檢測腫瘤組織內(nèi)VEGF,并用CD31標(biāo)記微血管,計算腫瘤組織MVD?；静襟E:(1)石蠟包埋,組織切片4μm。(2)烤片:65℃烤片。(3)脫蠟、水化:二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡10 min。一次浸泡于無水乙醇水化。(4)抗原修復(fù):放入高壓鍋中,加入EDTA溶液,至沸騰2 min,冷卻后PBS浸泡。(5)去過氧化物酶:將切片放入3% H2O2溶液中浸泡10 min,水沖洗,PBS 3 min。(6)加一抗:VEGF、CD31使用福州邁新即用型一抗,室溫孵育1 h。PBS緩沖液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各洗3 min。(7)加二抗:福州邁新即用型二抗(鼠/兔)覆蓋組織表面,室溫孵育20 min。水沖洗1 min,PBS緩沖液洗3 min。(8)DAB顯色:將DAB溶液滴于組織表面,在顯微鏡下觀察,水沖洗5 min。(9)蘇木精復(fù)染:浸泡5 min,水沖洗3 min。(10)HCl分化:放入1% HCl溶液中5 s,水沖洗2 min。(11)脫水、透明,封片、鏡檢、采集。

1.2.8 結(jié)果判定 應(yīng)用免疫組織化學(xué)和形態(tài)計量方法,用CD31標(biāo)記微血管,置于顯微鏡下,計數(shù)采用微血管金標(biāo)準(zhǔn)法[7]。陽性細(xì)胞數(shù)評定法:采用9分評分制,按照陽性細(xì)胞率和染色強(qiáng)度分別計分。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0(SPSSInc,Chicago,USA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)性檢驗采用單樣本K-S擬合優(yōu)度法。計量資料以表示,兩樣本間比較采用t檢驗。多個樣本間不同時間點的數(shù)據(jù)比較采用重復(fù)測量資料的方差分析,多組之間兩兩比較采用P值修正的方法。計數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示,數(shù)據(jù)間比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組肺癌A549裸鼠移植瘤體積的變化(mm3,)

表1 各組肺癌A549裸鼠移植瘤體積的變化(mm3,)

注:NIM為尼美舒利;DDP為順鉑;與對照組比較,a P＜0.001;與NIM組比較,b P＜0.001;與DDP組比較,c P＜0.001

組別 鼠數(shù)移植瘤體積1 d 5 d 9 d 13 d 17 d 21 d對照組 8 34.73±10.10 112.58±36.94 273.63±76.67 393.43±114.59 502.82±150.84 598.78±157.79 NIM組 8 33.31±8.45 102.95±34.95 220.02±68.33 313.45±66.17 400.49±71.61 460.88±89.10 DDP組 8 32.45±12.58 104.87±42.33 157.01±43.18 225.37±67.23 283.04±79.84 314.51±94.09 NIM+DDP組 8 34.97±8.92 83.28±14.09 114.24±20.55abc 150.68±26.29abc 185.35±28.21abc 208.19±33.90abc F值 0.111 1.088 12.232 15.656 17.435 21.723 P值 0.953 0.371 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建肺癌A549裸鼠移植瘤模型 裸鼠條件、細(xì)胞生長條件統(tǒng)一,荷瘤過程順利。移植瘤生長過程中,開始裸鼠背部皮下形成圓形、橢圓形、不規(guī)則形結(jié)節(jié),早期腫瘤呈灰白色,表面光滑,之后腫瘤逐漸增大。

2.2 各組肺癌A549裸鼠移植瘤體積變化 各組裸鼠移植瘤生長快慢依次為對照組＞NIM組＞DDP組＞NIM+DDP組。第9天后各時間點NIM+DDP組移植瘤體積分別與DDP組、NIM組、對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＜0.05),見表1。

2.3 各組肺癌A549裸鼠移植瘤的體積抑瘤率 用藥期間各組肺癌A549裸鼠移植瘤的體積抑瘤率見表2。各組裸鼠移植瘤的體積抑瘤率總體表現(xiàn)為NIM+DDP組＞DDP組＞NIM組＞對照組,NIM+DDP組對肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤生長的抑制作用最強(qiáng)。

表2 各組肺癌A549裸鼠移植瘤的體積抑瘤率的變化(%)

2.4 各組肺癌A549裸鼠移植瘤MVD 各組肺癌A549裸鼠移植瘤MVD的表達(dá)情況見圖1。NIM+DDP組MVD較DDP組低(P＜0.05),各組之間與對照組相比較(P值均＜0.05),見表3。

2.5 各組肺癌A549裸鼠移植瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá) VEGF在各組肺癌A549移植瘤中的陽性表達(dá)呈對照組＞NIM組＞DDP組＞NIM+DDP組(圖2)。4組肺癌A549移植瘤中VEGF的表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=36.271,P＜0.001),對照組與NIM組VEGF表達(dá)比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.687,P＞0.05);NIM+DDP組與DDP組VEGF表達(dá)比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.055,P＜0.001),見表4。

圖1 各組肺癌A549裸鼠移植瘤細(xì)胞中微血管密度的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色 ×400 A:對照組;B:尼美舒利組;C:順鉑組;D:尼美舒利+順鉑組

表3 各組肺癌A549移植瘤微血管密度的比較()

表3 各組肺癌A549移植瘤微血管密度的比較()

注:NIM為尼美舒利;DDP為順鉑;與對照組比較,a P＜0.05;與NIM組比較,b P＜0.05;與DDP組比較,c P＜0.05

組別 鼠數(shù) 微血管密度對照組 8 36.75±6.139 NIM組 8 27.25±5.142a DDP組 8 20.25±4.323ab NIM+DDP組 8 13.88±3.723abc F值 27.861 P值 ＜0.001

表4 各組肺癌A549移植瘤中血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)

3 討論

任何腫瘤生長與增殖都離不開新生血管,腫瘤生長需要血管來提供所需的營養(yǎng)物質(zhì)[8]。腫瘤血管的形成過程分2個期:非血管期——處于無血管的浸潤前期,此時主要靠彌散獲得營養(yǎng);血管期——在多種血管調(diào)節(jié)因子的作用下,新生血管長入腫瘤組織使腫瘤細(xì)胞呈指數(shù)生長,腫瘤細(xì)胞分裂率與血供呈正比。新生血管形成的整個過程是受新生血管調(diào)節(jié)因子的嚴(yán)密調(diào)控,腫瘤細(xì)胞自身分泌的生長因子作用于其自身的生長受體,形成自分泌循環(huán),刺激新生血管的不斷增殖,保持腫瘤細(xì)胞無休止的生長與浸潤[9]。塞來昔布是一種選擇性COX-2抑制劑。有研究報道,DDP和塞來昔布通過下調(diào)LRP m RNA和VEGF蛋白水平,協(xié)同作用于TW03/DDP細(xì)胞的增殖抑制和凋亡誘導(dǎo)[10]。

腫瘤的生長必須依賴足夠的血供,有學(xué)者認(rèn)為切斷腫瘤血供,采用 “饑餓療法”則可抑制腫瘤生長,導(dǎo)致腫瘤死亡[11]。因此,抗腫瘤新生血管形成環(huán)節(jié)成為治療腫瘤的一個重要靶點,VEGFA和ANGPT2的聯(lián)合檢測可能是有價值的預(yù)后生物標(biāo)志物,血管內(nèi)皮生長因子A和血管生成素的雙阻斷可能改善治療結(jié)果?？寡苌莎煼☉?yīng)運而生,聯(lián)合傳統(tǒng)化療法成為研究熱點。

COX-2是前列腺素合成過程中的限速酶[12],正常生理狀態(tài)未見其表達(dá),在血管生長因子分泌過多、癌基因刺激下,機(jī)體COX-2表達(dá)增強(qiáng),并通過前列腺素、血栓素途徑,刺激VEGF表達(dá)增強(qiáng),抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。CD34+血管形成(新生血管)。COX-2抑制劑的抗轉(zhuǎn)移作用表明,這些分子可能在晚期癌癥的治療中具有臨床應(yīng)用價值。

圖2 各組肺癌A549裸鼠移植瘤細(xì)胞中的血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色 ×400 A:對照組;B:尼美舒利組;C:順鉑組;D:尼美舒利+順鉑組

選擇性COX-2抑制劑可以通過抑制VEGF的m RNA的轉(zhuǎn)錄過程來抑制結(jié)腸癌血管形成,進(jìn)而抑制結(jié)腸癌。在塞來昔布處理的LSQCC細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)了幾個重要的分子,如VEGFA、ATF4、FN1、COX-2,這些分子可能增強(qiáng)了塞來昔布對LSQCC的抗癌作用[13]。有研究證實,在體外,COX-2抑制劑聯(lián)合傳統(tǒng)化療藥能使其半數(shù)抑制濃度最高減少至7%[14];在體內(nèi),COX-2抑制劑聯(lián)合奧沙利鉑在治療腸癌中不僅具有抗細(xì)胞增殖,而且具有抑制新生血管的作用,發(fā)揮協(xié)同抗腫瘤作用[15]。本實驗結(jié)果顯示NIM組、DDP組、NIM+DDP組體積抑瘤率分別為23.03%、47.48%、65.23%。NIM組體積抑瘤率與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),說明NIM具有抑瘤作用。4組體積抑瘤率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),且NIM+DDP組體積抑瘤率最高,表明NIM對肺癌A549裸鼠移植瘤有抑制作用,NIM+DDP對腫瘤生長的抑制作用更強(qiáng),推測NIM單獨應(yīng)用有抑制肺癌生長的作用,而且NIM有增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對DDP的細(xì)胞毒作用,即協(xié)同化療藥物發(fā)揮抑制肺癌A549裸鼠移植瘤生長的作用。

抗血管生成藥物可以抑制腫瘤血管結(jié)構(gòu)和功能,促進(jìn)化療藥物進(jìn)入腫瘤內(nèi)部,造成腫瘤組織缺氧狀態(tài)并且增強(qiáng)化療藥物的細(xì)胞毒作用。抑制COX-2和表皮生長因子受體可以通過正常腫瘤血管和程序性死亡1配體下調(diào)改善程序性死亡1檢查點阻斷治療。通過影響血管和免疫細(xì)胞,可能是治療人類肺癌的一種有前途的聯(lián)合策略[16]。目前我們雖然不能通過檢測腫瘤缺氧情況來判定腫瘤狀態(tài)和治療效果,但可以通過新生血管生成來間接評價腫瘤的氧供狀態(tài),MVD是最常用的測量新生血管密度的指標(biāo)之一[17]。為了判斷NIM單獨以及聯(lián)合DDP對肺癌新生血管的影響,本研究成功建立肺癌A549裸鼠移植瘤模型,結(jié)果顯示NIM組MVD與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),4組MVD比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。MVD的變化趨勢與腫瘤體積大小變化趨勢一致,可能隨著MVD的增加,血管生成越多,肺癌腫瘤生長越旺盛。有研究表明,聯(lián)合使用COX-2抑制劑和奧沙利鉑,可以降低MVD,顯著增強(qiáng)奧沙利鉑對結(jié)腸癌新生血管的抑制,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡[18]。因此,筆者推測選擇性COX-2抑制劑聯(lián)合鉑類化療藥物可以通過抑制腫瘤的MVD,從而達(dá)到抑制腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移。

VEGF是一種典型的外分泌蛋白,它可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞的膜受體結(jié)合,從而發(fā)揮促血管形成功能,是腫瘤組織生長和轉(zhuǎn)移的必要條件之一。本研究的免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示,各組肺癌A549裸鼠移植瘤細(xì)胞均有VEGF陽性染色位于胞漿,呈棕黃色彌漫著色。4組陽性表達(dá)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),NIM組的陽性表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),提示NIM單獨使用對VEGF的下調(diào)作用不明顯,當(dāng)與DDP聯(lián)合作用于肺癌A549裸鼠移植瘤時,明顯抑制VEGF的表達(dá),且抑制效果優(yōu)于NIM組及DDP組。Kim等[19]研究表明COX-2是一種酶,其表達(dá)受多種刺激(如炎癥)誘導(dǎo);塞來昔布觸發(fā)COX-2外泌體負(fù)載。塞來昔布在肺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)COX-2的表達(dá),并且外泌體中高表達(dá)的COX-2可以轉(zhuǎn)移到其他細(xì)胞中。選擇性COX-2抑制劑通過下調(diào)膽道腫瘤細(xì)胞VEGF的蛋白表達(dá)起到抑制膽道腫瘤生長的作用。另有研究表明,選擇性COX-2抑制劑可以通過抑制PG的產(chǎn)生,能夠減少毛細(xì)血管再生,降低VEGF、b-FGF的表達(dá),從而起到抑制腫瘤血管形成,進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用,血管生成的抑制是癌癥的一個典型特征,在包括非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種人類惡性腫瘤中,血管生成的抑制已被證明是有效的[15]。因此,筆者推測選擇性COX-2抑制劑聯(lián)合化療藥物對腫瘤的抑制作用,可能與選擇性COX-2抑制劑聯(lián)合化療藥物對腫瘤VEGF的下調(diào)有關(guān),并抑制腫瘤生長的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)NIM對肺癌A549裸鼠移植瘤的新生血管有抑制作用,進(jìn)而抑制肺癌的生長、增殖。NIM和DDP聯(lián)合抑制肺癌的生長,可能與下調(diào)血管生長因子VEGF,降低肺癌MVD,減少肺癌的血液供應(yīng)等因素有關(guān)。結(jié)合國內(nèi)外研究,筆者推測選擇性COX-2抑制劑聯(lián)合鉑類藥物對肺癌的抑制作用與其抑制肺癌細(xì)胞增殖生長、促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡、提高機(jī)體免疫以及逆轉(zhuǎn)耐藥等機(jī)制有關(guān)。選擇性COX-2抑制劑與DDP聯(lián)合對肺癌新生血管的抑制效應(yīng),也可能為其抗腫瘤的機(jī)制之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突