時(shí)鐘基因Bmal1對(duì)鼻咽癌移植瘤放療敏感性的影響*

孟熙 李媛媛 蔣孑慶 陳越 黎小梅 賀前勇 張蓬新 趙朝芬 唐雅雪 甘加應(yīng) 周建獎(jiǎng)周定安 金風(fēng)

鼻咽癌治療失敗的主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致局部復(fù)發(fā)的常見(jiàn)原因是腫瘤輻射抗性細(xì)胞的產(chǎn)生，如何增強(qiáng)鼻咽癌放療敏感性為當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。Elshazley 等［1］研究發(fā)現(xiàn)惡性胸膜間皮瘤細(xì)胞Bmal1 基因（brain and muscle arnt-like1）是一個(gè)促癌基因。然而Jung 等［2］發(fā)現(xiàn)Bmal1 基因在肺癌和膠質(zhì)瘤細(xì)胞是抑癌基因。Zeng 等［3］研究發(fā)現(xiàn)Bmal1基因在結(jié)直腸癌細(xì)胞是抑癌基因，并且可增加結(jié)直腸癌對(duì)化療藥物奧沙利鉑的敏感性。以上研究表明，Bmal1 基因與腫瘤的關(guān)系復(fù)雜，具有促癌作用或抑癌作用。針對(duì)Bmal1 基因在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中產(chǎn)生何種作用，能否增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞的放療敏感性等問(wèn)題，本課題組前期體外細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)［4］，鼻咽癌細(xì)胞株過(guò)表達(dá)Bmal1（H-ARNTL）基因能抑制腫瘤生長(zhǎng)，增加腫瘤細(xì)胞的放射敏感性。Bmal1基因可能通過(guò)降低S期比例、增加G2/M 期阻滯，從而增加放療后細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)放射敏感性。然而，體外環(huán)境與體內(nèi)環(huán)境差別較大，本研究采用慢病毒感染方法，研究Bmal1基因過(guò)表達(dá)和低表達(dá)時(shí)對(duì)鼻咽癌CNE1裸鼠移植瘤生長(zhǎng)及放療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系 鼻咽癌細(xì)胞CNE1 來(lái)自于中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院。

1.1.2 主要試劑 PCR 試劑Primer 購(gòu)自上海生工公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒GK2042-500購(gòu)自上海Generay 公司；T4DNA ligase 購(gòu)自立陶宛Fementas公司；瓊脂糖購(gòu)自上海前塵公司；Positive clone 測(cè)序由美國(guó)Invitrogen公司完成。高純度質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN 公司。限制性?xún)?nèi)切酶（BamH I、EcoR I）購(gòu)自立陶宛Fermentas公司。兔多抗Bmal1購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，兔多抗GAPDH 購(gòu)自杭州賢至生物公司，兔多抗P53、P21 購(gòu)自武漢三鷹生物公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗購(gòu)自武漢博士德生物公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)BALB/c 裸鼠，雌性，4～6 周齡，共20 只，購(gòu)自江蘇集萃藥康生物科技有限公司。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008。本實(shí)驗(yàn)符合國(guó)家有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)規(guī)范和管理?xiàng)l例。

1.2 方法

1.2.1 Bmal1基因過(guò)表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建 根據(jù)NCBA中Bmal1基因序列，設(shè)計(jì)合成引物。引物序列為：上游引物：5'-CCGGAATTCGCCACCATGGCAGACCAGAGA ATGGACATTTCTTC-3'；下游引物：5'-CCGGGATCCTT ACAGCGGCCATGGCAAGTC-3'。在T4DNA連接酶的作用下，將慢病毒載體PGMLV-PA6與Bmal1片段進(jìn)行連接；將連接產(chǎn)物加入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，熱休克促進(jìn)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)后送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.2.2 Bmal1基因慢病毒干擾載體的構(gòu)建 針對(duì)目的基因Bmal1基因序列，設(shè)計(jì)合成shRNA寡聚單鏈DNA，序列為（5'to 3'）：Bmal1sh3T：GATCCGCACGCGATAGA TGGAAAGTTCTCGAGAACTTTCCATCTATCGCGTGCTT TTTT；Bmal1sh3B：AATTAAAAAAGCACGCGATAGATG GAAAGTTCTCGAGAACTTTCCATCTATCGCGTGCg。將其退火形成雙鏈結(jié)構(gòu)，在T4DNA連接酶作用下，將RNAi慢病毒載體PGMLV-SB3與引物連接；后續(xù)步驟同1.2.1。

將HEK293T細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；凍存病毒液冰浴融化，用細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)宦《鞠♂屢壕鶆虻渭拥紿EK293T細(xì)胞進(jìn)行感染；慢病毒感染成功后，提取細(xì)胞RNA行RT-PCR；PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性，95℃，45 s；PCR循環(huán)95℃、15 s，60℃、60 s，40個(gè)循環(huán)；融解曲線：60℃→95℃。

1.2.4 慢病毒感染目的細(xì)胞 接種CNE1 細(xì)胞于培養(yǎng)皿中，將凍存病毒原液冰浴融化，按合適的MOI值稀釋病毒原液，吸出對(duì)照組和處理組原有培養(yǎng)基，將慢病毒稀釋液及慢病毒陰性對(duì)照稀釋液分別滴加到處理組和對(duì)照組細(xì)胞中。用嘌呤霉素進(jìn)行穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞篩選。

1.2.5 Western blot 驗(yàn)證穩(wěn)轉(zhuǎn)CNE1 細(xì)胞中Bmal1 蛋白的表達(dá) 將Bmal1 基因過(guò)表達(dá)、Bmal1 基因干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，去除培養(yǎng)液，IP裂解液冰上裂解細(xì)胞，提取蛋白后將蛋白樣品上樣至SDS-PAGE膠加樣孔，按電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、化學(xué)發(fā)光、顯影、定影步驟進(jìn)行。

1.2.6 裸鼠飼養(yǎng)及接種 裸鼠飼養(yǎng)在貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)研究中心SPF級(jí)飼養(yǎng)室。裸鼠的飲水、飼料、墊料均高壓滅菌，12 h光照、12 h黑夜交替；20只裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為4組，5只/組。每組裸鼠分別接種細(xì)胞CNE1OE（Bmal1基因過(guò)表達(dá)組）、CNE1OENC（過(guò)表達(dá)對(duì)照組）、CNE1sh3（低表達(dá)組）、CNE1shNC（低表達(dá)對(duì)照組）。用接種細(xì)胞命名相應(yīng)的裸鼠組別。細(xì)胞活力98%，細(xì)胞密度為2.5×107個(gè)/mL，每只裸鼠接種PBS細(xì)胞懸液0.2 mL，接種細(xì)胞個(gè)數(shù)為5×106個(gè)，接種部位右上肢腋下皮下注射。裸鼠成瘤率100%，無(wú)自然死亡。

1.2.7 腫瘤體積測(cè)量與計(jì)算 裸鼠移植瘤接種后3天開(kāi)始用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤大小，每3 天測(cè)量1次。測(cè)量移植瘤長(zhǎng)徑a和短徑b。根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積［5-6］。腫瘤體積縮小比例=（V放療前-V放療后）/V放療前×100%。

1.2.8 裸鼠移植瘤放療 移植瘤種植后第23天CNE1OE組裸鼠移植瘤最大長(zhǎng)徑為10.94 mm，CNE1sh3組最大長(zhǎng)徑為19.20 mm，予放療。采用瑞典醫(yī)科達(dá)Synergy型醫(yī)用直線加速器行裸鼠移植瘤放療。用自制裝置固定裸鼠，給予6-MeV電子線照射，放療劑量為15 Gy；劑量率600 cGy/min；源皮距（SSD）100 cm；用1.0 cm鉛塊遮擋裸鼠正常組織，照射野2.5 cm×2.0 cm；瘤體表面墊0.5 cm蠟塊作為補(bǔ)償；放療后第12 天CNE1OE 組最大長(zhǎng)徑為7.70 mm，CNE1sh3組最大長(zhǎng)徑為21.22 mm，次日采用頸椎脫位處死裸鼠。

1.2.9 RT-PCR檢測(cè)裸鼠移植瘤Bmal1、P53、P21 mRNA表達(dá)水平 用Trizol法提取移植瘤組織RNA，用微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度及純度。將總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。每個(gè)待測(cè)樣品設(shè)置3個(gè)平行樣。RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃、2 min、95℃、10 min；95℃、30 s、60℃、30 s，40個(gè)循環(huán)。引物序列：GAPDH上游5'-TCAAGAAGGT GGTGAAGCAGG-3'，下游5'-TCAAAGGTGGAGGAG TGGGT-3'；Bmal1上游5'-GGATGTGACCGAGGGAAGA T-3'，下游5'-ATAATCGAGATGGCCCAGGG-3'；P53上游5'-AGGTTGGCTCTGACTGTACC-3'，下游5'-GATTC TCTTCCTCTGTGCGC-3'；P21 上游5'-CACCGAGACAC CACTGGAG-3'，下游5'-AGGCACAAGGGTACAAGAC A-3'。

目前國(guó)內(nèi)快遞企業(yè)有兩種不同的經(jīng)營(yíng)模式，一種是EMS、順豐、宅急送所采用的直營(yíng)體系，另一種就是“通達(dá)系”以及其他中小快遞企業(yè)采用的加盟模式，圓通采用的是加盟加直營(yíng)混合的經(jīng)營(yíng)模式。圓通在這種經(jīng)營(yíng)模式下把人力和成本都轉(zhuǎn)移給了網(wǎng)點(diǎn)的加盟商，總部對(duì)網(wǎng)點(diǎn)的管控力度不夠，因此就用返點(diǎn)和罰款等方式對(duì)加盟網(wǎng)點(diǎn)進(jìn)行管控，這樣一來(lái)，總部把成本和風(fēng)險(xiǎn)都轉(zhuǎn)移給了網(wǎng)點(diǎn)的加盟商。

1.2.10 Western blot檢測(cè)裸鼠移植瘤Bmal1、P53、P21蛋白表達(dá) 處死裸鼠后剝離移植瘤組織，提取組織蛋白后把蛋白樣品上樣至SDS-PAGE膠加樣孔，余步驟同1.2.5行Western blot檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)多組樣本均數(shù)間比較行方差分析，數(shù)據(jù)用表示。方差齊者組間兩兩比較采用LSD 法，方差不齊者組間兩兩比較采用Dunnett's T3法。每組裸鼠放療前后體積變化行自身配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot 驗(yàn)證CNE1 細(xì)胞Bmal1 基因過(guò)表達(dá)及干擾效果

CNE1OE 組Bmal1 蛋白免疫印跡條帶較CNE1OENC組明顯增強(qiáng)，說(shuō)明細(xì)胞感染后CNE1OE組能高效表達(dá)Bmal1 mRNA 和蛋白；CNE1sh3 組Bmal1蛋白免疫印跡條帶較CNE1shNC組顯著減弱，說(shuō)明細(xì)胞感染后CNE1sh3 組Bmal1 mRNA 和蛋白的表達(dá)受到明顯抑制（圖1）。

圖1 Western blot驗(yàn)證細(xì)胞感染后Bmal1蛋白表達(dá)

2.2 構(gòu)建移植瘤模型后腫瘤生長(zhǎng)情況

CNE1OE、CNE1OENC、CNE1sh3、CNE1shNC組移植瘤體積在第12天分別為（2.47±2.40）、（7.17±8.81）、（49.17±23.19）、（20.75±8.67）mm3；第15 天分別為（10.34±7.21）、（44.71±26.30）、（211.84±27.36）、（40.16±17.63）mm3，第18 天分別為（28.16±13.75）、（142.91±94.23）、（372.05±110.72）、（109.91±49.63）mm3；第21天分別為（54.90±26.47）、（240.80±81.43）、（868.49±294.54）、（269.18±52.88）mm3；第23 天分別為（151.00±81.69）、（413.32±220.27）、（1 291.14±686.10）、（451.38±117.29）mm3。結(jié)果表明，與對(duì)照組CNE1OENC、CNE1shNC組相比，CNE1OE組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)最慢、體積最小（F=20.06，P＜0.05）；CNE1sh3組生長(zhǎng)最快、體積最大（F=19.60，P＜0.05）。CNE1OENC與CNE1shNC組腫瘤體積比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 造模后移植瘤生長(zhǎng)曲線

2.3 放療后裸鼠移植瘤生長(zhǎng)情況

CNE1OE、CNE1OENC、CNE1sh3、CNE1shNC組移植瘤體積在放療后第4天分別為（106.62±90.71）、（518.74±320.97）、（1 394.00±557.23）、（421.83±99.00）mm3，第7天分別為（64.45±37.22）、（403.19±281.38）、（1 108.75±431.32）、（339.25±102.95）mm3，第10天分別為（37.52±23.91）、（301.14±222.35）、（1 103.26±471.56）、（294.36±93.16）mm3，第12 天分別為（34.93±23.23）、（312.84±220.74）、（1 218.34±649.92）、（304.13±105.67）mm3。結(jié)果表明，CNE1OE組（t=4.32，P＜0.05）、CNE1OENC組（t=5.38，P＜0.05）、CNE1shNC組（t=5.16，P＜0.05）放療后腫瘤體積均縮小，CNE1OE 組縮小比例最大，為77.2%±7.4%，CNE1OENC、CNE1shNC組縮小比例分別為29.2%±18.5%、33.8%±14.4%（F=17.45，P＜0.05）。然而，CNE1sh3組放療前后自身體積變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.63，P＞0.05）。提示CNE1OE組放療敏感性增強(qiáng)，而CNE1sh3組表現(xiàn)為輻射抗拒（圖3）。

2.4 RT-PCR檢測(cè)Bmal1、P53、P21 mRNA的相對(duì)表達(dá)

處死裸鼠后剝離移植瘤，行RT-PCR檢測(cè)結(jié)果提示，CNE1OE、CNE1OENC、CNE1sh3、CNE1shNC 組Bmal1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為4.38±1.04、1.07±0.28、0.56±0.12、1.05±0.25，行單因素方差分析（F=50.03，P＜0.05）；P53 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為3.90±0.79、1.12±0.23、0.63±0.16、1.18±0.27（F=56.28，P＜0.05）；P21 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為2.74±0.41、1.10±0.24、0.63±0.16、1.12±0.21，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=57.77，P＜0.05）。CNE1OENC組與CNE1shNC組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CNE1OE組移植瘤Bmal1、P53、P21 mRNA表達(dá)上調(diào)，CNE1sh3組則下調(diào)（圖4）。

2.5 Western blot檢測(cè)移植瘤Bmal1、P53、P21蛋白的相對(duì)表達(dá)

剝離移植瘤行Western blot檢測(cè)，結(jié)果提示CNE1OE、CNE1OENC、CNE1sh3、CNE1shNC組Bmal1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.74±0.07、0.50±0.07、0.32±0.04、0.48±0.08，行單因素方差分析（F=36.08，P＜0.05）；P53蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.63±0.06、0.41±0.06、0.30±0.09、0.44±0.04（F=21.39，P＜0.05）；P21蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.39±0.04、0.25±0.02、0.16±0.03、0.25±0.02，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=51.94，P＜0.05）。CNE1OENC組與CNE1shNC組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。上述結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，CNE1OE組移植瘤Bmal1、P53、P21蛋白表達(dá)上調(diào)，CNE1sh3組則下調(diào)（圖5）。

圖3 放療后移植瘤生長(zhǎng)曲線

圖4 RT-PCR檢測(cè)移植瘤Bmal1、P53、P21 mRNA表達(dá)

圖5 Western blot檢測(cè)移植瘤Bmal1、P53、P21蛋白表達(dá)

3 討論

時(shí)鐘基因是有機(jī)體調(diào)控系統(tǒng)多反饋環(huán)的基本組成元件［7］，與有機(jī)體的各種生命活動(dòng)如激素分泌、細(xì)胞代謝等密切相關(guān)［8］。目前已發(fā)現(xiàn)的時(shí)鐘基因有Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、Clock、Bmal1、TIM、CKIε、NPAS2、REVERBs、Dec1、Dec2 和RORs［4，9-10］。Bmal1 基因又稱(chēng)為ARNTL（aryl hydrocarbon receptor nuclear translocatorlike）基因，是哺乳動(dòng)物生命活動(dòng)中重要的中央時(shí)鐘元件，位于11 號(hào)染色體短臂，編碼蛋白質(zhì)Bmal1，屬于bHLH-PAS結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族［11］。Bmal1基因在生物節(jié)律中起著重要的調(diào)控作用，其發(fā)生突變或缺失時(shí)可導(dǎo)致機(jī)體節(jié)律紊亂，并引起一系列的病變。敲除小鼠視交叉上核中Bmal1基因，其晝夜節(jié)律會(huì)喪失［12］。

研究表明，Bmal1基因與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。Elshazley等［1］研究發(fā)現(xiàn)，在惡性胸膜間皮瘤的發(fā)生發(fā)展中，Bmal1 基因起著促癌作用。然而，He等［13］研究發(fā)現(xiàn)，鼻咽癌組織中Bmal1基因的表達(dá)量明顯低于正常組織，表明Bmal1基因可能抑制鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展。Jung 等［2］發(fā)現(xiàn)Bmal1 基因可抑制肺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展。Hsu 等［14］發(fā)現(xiàn)頭頸鱗癌組織中Bmal1 基因表達(dá)水平明顯低于正常組織，Bmal1 基因在頭頸鱗癌可能是一個(gè)抑癌基因。Jiang等［16］發(fā)現(xiàn)Bmal1基因在胰腺癌組織中呈低表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)采用慢病毒感染方法，構(gòu)建了Bmal1基因過(guò)表達(dá)、過(guò)表達(dá)對(duì)照、低表達(dá)、低表達(dá)對(duì)照4株鼻咽癌CNE1細(xì)胞，Western blot驗(yàn)證Bmal1蛋白表達(dá)量提示細(xì)胞感染成功，成功構(gòu)建裸鼠移植瘤模型。剝離移植瘤行RT-PCR及Western blot檢測(cè)結(jié)果提示，CNE1OE組Bmal1 mRNA及蛋白表達(dá)量高于CNE1OENC組，CNE1sh3組則低于CNE1shNC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示CNE1OE組裸鼠移植瘤Bmal1表達(dá)明顯上調(diào)，CNE1sh3組裸鼠移植瘤Bmal1表達(dá)明顯下調(diào)。

裸鼠移植瘤生長(zhǎng)過(guò)程顯示，與對(duì)照組相比，CNE1OE組腫瘤成瘤時(shí)間最晚，生長(zhǎng)最慢，移植瘤種植后第15天，CNE1OE組腫瘤體積為（10.34±7.21）mm3，CNE1OENC組腫瘤體積為（44.71±26.30）mm3，CNE1OE組腫瘤體積小于CNE1OENC組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CNE1sh3組移植瘤生長(zhǎng)最快，第15天其體積為（211.84±27.36）mm3，CNE1shNC組體積為（40.16±17.63）mm3，CNE1sh3組腫瘤體積大于CNE1shNC 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。CNE1OENC組與CNE1shNC組體積相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造移植瘤模型后腫瘤生長(zhǎng)情況表明，Bmal1基因過(guò)表達(dá)能抑制鼻咽癌CNE1移植瘤的生長(zhǎng)，而低表達(dá)則促進(jìn)其生長(zhǎng)，這證明在鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展中，Bmal1基因是一個(gè)抑癌基因，與He等［13］研究結(jié)果一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，放療后CNE1OENC 組、CNE1shNC組縮小比例分別為29.2%±18.5%、33.8%±14.4%，CNE1OE 組腫瘤縮小比例為77.2%±7.4%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CNE1OE 組腫瘤縮小最明顯。然而CNE1sh3組腫瘤體積放療前后自身配對(duì)t檢驗(yàn)提示差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究推測(cè)，CNE1OE組腫瘤由于Bmal1 基因過(guò)表達(dá)，抑制放射線所致DNA 損傷的修復(fù)，進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性。表明CNE1sh3 組腫瘤呈現(xiàn)輻射抗拒。推測(cè)CNE1sh3 組由于Bmal1 基因低表達(dá)，導(dǎo)致放療后DNA損傷修復(fù)較快，腫瘤對(duì)放射線的損傷敏感性較差。

Zeng 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1 基因可增加結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物奧沙利鉑的敏感性，可能的機(jī)制是Bmal1 基因通過(guò)ATM 信號(hào)通路調(diào)控G2/M 期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Jung 等［2］發(fā)現(xiàn)，Bmal1 可能通過(guò)阻斷PI3K-Akt-MMP-2途徑，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2的表達(dá)，進(jìn)一步抑制肺癌和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

Slat等［16］研究發(fā)現(xiàn)，替莫唑胺誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的活性依賴(lài)于Bmal1基因。Sakamoto等［17］研究發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌中Bmal1 基因能夠通過(guò)促進(jìn)p53 基因表達(dá)、增加癌細(xì)胞凋亡起到抑癌基因的作用。Zeng等［3］研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因過(guò)表達(dá)直腸癌細(xì)胞株中，ATM、p53、Wee1的表達(dá)明顯上調(diào)。

p53基因全長(zhǎng)約20 kb，定位于人類(lèi)染色體17p13.1，人類(lèi)腫瘤約50%以上與p53基因變異有關(guān)［18-20］。p21基因是位于p53基因下游的細(xì)胞周期素依賴(lài)性激酶抑制因子［15，21-23］。本研究處死裸鼠后剝離移植瘤進(jìn)行RT-PCR及Western blot 檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CNE1OE 組P53、P21 mRNA及蛋白表達(dá)量明顯高于CNE1OENC組，CNE1sh3組明顯低于CNE1shNC 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；CNE1OENC組與CNE1shNC組相比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Mullenders等［24］采用大規(guī)模的shRNA測(cè)序，表明Bmal1可正調(diào)控p53基因。Jiang等［15］研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1過(guò)表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞P21表達(dá)增加，發(fā)生了G2/M期阻滯，該研究探索了Bmal1基因誘導(dǎo)p53依賴(lài)性細(xì)胞凋亡和G2/M期細(xì)胞周期阻滯的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，Bmal1基因過(guò)表達(dá)時(shí)P53、P21 mRNA及蛋白表達(dá)上調(diào)，推測(cè)Bmal1基因抑制腫瘤生長(zhǎng)、增強(qiáng)放療敏感性的機(jī)制可能與P53、P21蛋白表達(dá)上調(diào)有關(guān)，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)揭示了Bmal1基因與鼻咽癌CNE1生長(zhǎng)及與放射敏感性的初步關(guān)系，為進(jìn)一步研究Bmal1基因如何通過(guò)其反饋環(huán)及通路對(duì)腫瘤的影響奠定了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上所述，Bmal1 基因與鼻咽癌細(xì)胞CNE1 的生長(zhǎng)有密切關(guān)系，且能增強(qiáng)鼻咽癌細(xì)胞CNE1對(duì)放療的敏感性，將為鼻咽癌復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移治療靶點(diǎn)的研究提供一定的實(shí)驗(yàn)理論及數(shù)據(jù)。