MiR-1303 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及生物信息學(xué)分析

韋懿宸，馮振博

（廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧）

0 引言

肝細(xì)胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是我國高發(fā)的惡性腫瘤之一，尤其在兩廣（廣東、廣西）地區(qū)。據(jù)廣西新聞網(wǎng)發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，HCC 是除肺癌外廣西人口中最高發(fā)的惡性腫瘤。HCC 的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段多因素積累連續(xù)復(fù)雜的過程。我國 HCC 的主要病因是乙肝病毒感染及黃曲霉毒素的攝入。目前推薦的治療手段仍以包括病灶切除以及肝移植在內(nèi)的手術(shù)治療為主[1]。但因其發(fā)病隱匿，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已為中晚期，臨床治療困難，手術(shù)切除率低，分子靶向治療正逐步成為腫瘤精準(zhǔn)治療的新途徑。MicroRNAs （miRNAs）是一類存在于動(dòng)植物體內(nèi)的，其長度為22 個(gè)nt 左右，內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過堿基對(duì)到信息的非翻譯區(qū)（UTRs）的部分互補(bǔ)位點(diǎn)，在mRNA 的翻譯和降解調(diào)控中發(fā)揮重要作用[2]。前期已有文獻(xiàn)報(bào)道了miR-1303在食管癌[3]、胃癌[4]、結(jié)腸癌[5]中的促癌作用，但miR1303 在肝癌中的作用及機(jī)制尚未見報(bào)道。因此本研究通過檢索篩選公共數(shù)據(jù)庫中肝癌及相應(yīng)癌旁組織miRNA 的芯片表達(dá)譜及高通量測序集，對(duì)miR1303 的數(shù)據(jù)進(jìn)行薈萃分析；利用3 種miRNA 靶基因預(yù)測網(wǎng)站獲得miRNA1303 的靶基因，并取交集，對(duì)重疊的靶基因進(jìn)行功能富集分析，初步探討這些靶基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)，為miRNA1303 在肝細(xì)胞癌中的調(diào)控機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 公共數(shù)據(jù)庫肝細(xì)胞癌相關(guān)數(shù)據(jù)集的篩選、提取和分析。

MiR1303 在肝細(xì)胞癌和癌旁表達(dá)譜數(shù)據(jù)來源為基因芯片表 達(dá) 譜 公 共 數(shù) 據(jù) 庫（Gene Expression Omnibus，GEO，https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢 索 式：（microRNA OR miRNA）AND （Hepatocellular Carcinoma OR HCC） 及TCGA，The Cancer Genome Atlas Program，（https：//www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga）。數(shù)據(jù)篩選納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）組織來源為人；（2）組織為原發(fā)性肝細(xì)胞癌，術(shù)前為接受放化療及免疫治療，或未接受任何藥物化學(xué)處理的人肝細(xì)胞癌細(xì)胞系及正常人肝細(xì)胞系；（3）需包含miRNA1303 表達(dá)數(shù)據(jù)；（4）肝細(xì)胞癌或非癌樣本例數(shù)≥3。數(shù)據(jù)提取包括第一作者、發(fā)表年份、國家、數(shù)據(jù)源、檢測方法或平臺(tái)、miR1303 的表達(dá)值、癌癥組和對(duì)照組的樣本量。

1.2 miRNA 靶基因預(yù)測及功能富集分析

我們使用miRDB（http：//www.mirdb.org/）、TargetScan Release 7.1（http：//www.targetscan.org/vert_71/）、miRWalk（http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）預(yù)測miR1303 的靶基因，并對(duì)獲得的三組靶基因集取交集。然后用Metascape（http：//metascape.org/gp/index.htmL#/main/step1）對(duì)靶基因進(jìn)行功能富集分析、蛋白互做分析及基因注釋分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，miRNA1303 在肝細(xì)胞癌和非癌組織或細(xì)胞的表達(dá)比較采用t 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用作圖軟件GraphPad Prism 7 制作GEO和TCGA 數(shù)據(jù)庫單個(gè)數(shù)據(jù)集散點(diǎn)圖；采用軟件Stata 12.0 合并GEO 和TCGA 數(shù)據(jù)庫中miR1303 表達(dá)值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)化均差SMD 并制作森林圖，分析異質(zhì)性和敏感性，計(jì)算sROC 曲線評(píng)估m(xù)iR1303 診斷價(jià)值。

2 結(jié)果

2.1 公共數(shù)據(jù)庫基因芯片匯總

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的6 組GEO 芯片和1 組TCGA 相關(guān)數(shù)據(jù)見表1。肝細(xì)胞癌樣本342 例，非癌組織樣本113 例。

2.2 公共數(shù)據(jù)庫中miR1303 在單個(gè)數(shù)據(jù)集中的表達(dá)水平

通過挖掘公共數(shù)據(jù)庫GEO 和TCGA，共篩選得到7 組數(shù)據(jù)集，這些數(shù)據(jù)集提供了miR1303 在肝細(xì)胞癌和非癌組織中的表達(dá)量。對(duì)單個(gè)獨(dú)立數(shù)據(jù)集進(jìn)行miR1303 表達(dá)量分析，結(jié)果顯示miR1303在多數(shù)數(shù)據(jù)集中肝細(xì)胞癌組織中相對(duì)高表達(dá)。見圖1。

2.3 公共數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)Meta 分析

由于每個(gè)研究數(shù)據(jù)集中樣本量有差別，本研究整合了所有GEO 基因芯片和TCGA 中miR1303 的表達(dá)值，并進(jìn)行Meta 分析。結(jié)果顯示7 組數(shù)據(jù)集之間的異質(zhì)性較大（I2=71.1%，P=0.002），選用隨機(jī)效應(yīng)模型。MiR1303 的合并標(biāo)準(zhǔn)均差SMD 為0.53（95%CI：-0.06，1.12）圖2A.表明miR1303 在肝細(xì)胞癌組織中明顯上調(diào)。漏斗圖顯示miR1303 在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)沒有發(fā)表偏倚，圖2B。sROC 曲線曲面下面積為0.79（95%CI：0.75，0.82）有較好的診斷價(jià)值，圖2C。

2.4 miR1303 靶基因預(yù)測及其功能富集分析、蛋白互做結(jié)果

圖1 公共數(shù)據(jù)庫分析miR1303 在肝細(xì)胞癌組織與非癌組織中的表達(dá)水平

表1 公共數(shù)據(jù)庫中miR1303 在肝細(xì)胞癌和非癌組織的表達(dá)數(shù)據(jù)匯總

使用miRDB、TargetScan Release 7.1、miRWalk 預(yù)測miR1303靶基因，分別得到3464、7900、810 個(gè)靶基因，取交集之后得到233個(gè)靶基因，如圖3A 所示。之后使用Metascape 對(duì)這233 個(gè)目標(biāo)基因進(jìn)行基因注釋、功能富集分析，結(jié)果如圖3B。PPI 蛋白互做網(wǎng)絡(luò)篩選出5 個(gè)樞紐基因，分別為RGPD4、RGPD8、NUP133、RGPD5、ERLIN2，結(jié)果如圖3C。

3 討論

原發(fā)性肝癌按照來源組織病理學(xué)分為肝細(xì)胞型，膽管細(xì)胞型和混合細(xì)胞型。其中肝細(xì)胞癌是世界上最常見的幾種惡性腫瘤之一，每年有近78 萬新發(fā)肝細(xì)胞癌病人同時(shí)有約75 萬肝細(xì)胞癌病人其中將近一半的肝細(xì)胞癌病人是發(fā)生在中國[6,7]。迄今為止，手術(shù)切除和肝臟移植仍然是肝癌治療最主要的手段。但是由于肝癌缺乏早期的診斷手段，90%的病人在確診時(shí)已經(jīng)處于肝癌中、晚期，此時(shí)手術(shù)切除治療的患者術(shù)后有高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，這嚴(yán)重影響患者的治療效果，帶來不良預(yù)后。因此，肝癌的早期發(fā)現(xiàn)并及早干預(yù)，將大大改善肝癌的治療效果和預(yù)后。

圖2 miR1303 在公共數(shù)據(jù)庫中的表達(dá)meta 分析結(jié)果

圖3 miRNA1303 靶基因預(yù)測及其功能富集、蛋白互做結(jié)果

目前認(rèn)為肝癌的發(fā)生發(fā)展是由內(nèi)外環(huán)境因素引起的癌基因激活、抑癌基因失活的多因素，多基因共同參與的復(fù)雜的病理過程[8]。miRNA 作為重要的基因調(diào)控分子，與腫瘤有著密切的關(guān)系。截至日前已經(jīng)有很多的miRNA 被報(bào)道，在癌癥發(fā)生過程中表達(dá)發(fā)生變化，而且其變化會(huì)引起下游靶基因的含量改變，進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展[9]。MicroRNA 在疾病的診斷、治療、預(yù)后判斷等有著一定價(jià)值。如Chen 等[10]發(fā)現(xiàn)了由十種miRNA 組成的非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)；Jin 等[11]發(fā)現(xiàn)，肝癌治療中，通過提高肝細(xì)胞miR-26 含量，降低下游靶基因ULK1 的表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)肝細(xì)胞對(duì)化療藥物Dox 的敏感性；胃癌患者中，血清中高含量的miR-451、miR-16 有著更高的總體生存率[12]。

我們通過數(shù)據(jù)挖掘miR1303 的表達(dá)量，并用meta 分析的方法進(jìn)行合并，發(fā)現(xiàn)其在肝細(xì)胞癌中相對(duì)于正常肝組織具有更高的表達(dá)水平，提示其可能是一個(gè)促癌因子。同時(shí)合并的sROC 曲面下面積達(dá)到0.79，具有較好的診斷肝細(xì)胞癌的價(jià)值。另外我們預(yù)測了miR1303 的潛在靶基因，發(fā)現(xiàn)這些基因功能上有：攜帶核定位信號(hào)（NLS）的蛋白質(zhì)從細(xì)胞質(zhì)到核膜的定向運(yùn)動(dòng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞蛋白定位、細(xì)胞分化負(fù)調(diào)控、胞質(zhì)運(yùn)輸、腫瘤細(xì)胞反應(yīng)、免疫球蛋白分泌、細(xì)胞微管骨架結(jié)構(gòu)的蛋白定位、肌發(fā)生、FGFR1 突變受體激活、膜運(yùn)輸、脾發(fā)育、蛋白質(zhì)泛素化、活性氧代謝過程、突觸后膜組織、類泛素化修飾；有關(guān)的通路有RIG-I 樣受體信號(hào)通路 、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白介導(dǎo)的信號(hào)通路、經(jīng)典Wnt 信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控，見圖3B。通過蛋白互做網(wǎng)絡(luò)分析得到RGPD4、RGPD8、NUP133、RGPD5、ERLIN2 這5 個(gè)樞紐基因，提示miR1303 可能通過結(jié)合這些靶基因在肝細(xì)胞癌的病理過程中發(fā)揮作用。