柚皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的人牙周膜成纖維細(xì)胞增殖及炎癥因子表達(dá)的影響

劉 景，袁 媛

牙周炎(periodontitis)是口腔常見的慢性炎癥性疾病，多由以革蘭陰性厭氧菌(如內(nèi)毒素脂多糖)為主的病原微生物引起，以牙周組織破壞為基本特征，是成人缺失牙的主要原因之一[1-2]。有研究表明[3]，病原微生物對(duì)牙周組織的直接破壞作用有限，而破壞牙周組織的主要原因是由病原微生物激發(fā)的宿主免疫反應(yīng)，影響牙周防御細(xì)胞增殖、分化，而牙周防御細(xì)胞在抵抗病原微生物的同時(shí)釋放可導(dǎo)致牙周組織破壞的炎癥因子，最終導(dǎo)致牙周組織損傷。

柚皮苷(naringin，NRG)是一種雙氫黃酮類化合物，是傳統(tǒng)中藥骨碎補(bǔ)、枳殼、枳實(shí)和化橘紅等的主要藥效成分，亦存在于葡萄柚、橘、橙等蕓香科植物的果皮和果肉中。有研究表明，柚皮苷具有抗炎、抗氧化、抗菌、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化和調(diào)節(jié)血糖等多種生物活性和藥理作用[4-6]，且可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化、調(diào)節(jié)骨誘導(dǎo)生長因子，促進(jìn)骨損傷部位的骨質(zhì)生長，從而增強(qiáng)牙周組織的成骨能力[7-8]。為了明確柚皮苷對(duì)牙周再生治療的作用機(jī)制，本研究從細(xì)胞水平研究柚皮苷對(duì)內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)下人牙周膜成纖維細(xì)胞(human periodontal ligament fibroblast，HPDLF)增殖及白介素(interleukin，IL)-6、IL-8、IL-1β表達(dá)的影響，為臨床應(yīng)用柚皮苷防治牙周炎提供基礎(chǔ)性理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

HPDLF細(xì)胞株(上海拜力生物科技有限公司)，柚皮苷(含量：98.28%，批號(hào)：MUST-16041912，成都曼思特生物科技有限公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，批號(hào)：10099133，上海栩冉生物科技有限公司),DMEM培養(yǎng)基 (批號(hào)：12800017，上海江林生物科技有限公司)，噻唑藍(lán)(MTT，批號(hào)：146500700，美國Sigma 公司)，IL-6、IL-8、IL-1β ELISA試劑盒(美國R&D公司)，IL-6抗體、IL-8抗體、IL-1β抗體、GAPDH抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，BCA蛋白測(cè)定試劑盒(美國Thermo公司)，ECL發(fā)光液和硝酸纖維素膜(美國Millipoer公司)。

1.2 主要儀器

Roche Light Cycler 96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Roche公司)；SpectraMax iD5-多功能酶標(biāo)儀(中國上海美谷分子儀器有限公司)；H1650臺(tái)式高速離心機(jī)(湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理 HPDLF培養(yǎng)于含10%FBS、1×105U/L青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于95%空氣+5% CO2、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)HPDLF生長占培養(yǎng)瓶面積80%～90%時(shí)，常規(guī)傳代培養(yǎng)，選擇生長狀態(tài)良好的3～6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將生長良好的HPDLF培養(yǎng)至密度為90%左右，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以4×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)共分為5組，即空白對(duì)照(CON)組、脂多糖(LPS)組、脂多糖+柚皮苷高劑量(LPS+NRG 40 μg/mL)組、脂多糖+柚皮苷中劑量(LPS+NRG 20 μg/mL)組、脂多糖+柚皮苷低劑量(LPS+NRG 10 μg/mL)組。各組細(xì)胞置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后更換無血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)過夜后，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組分別加入相應(yīng)劑量藥物，LPS組、CON組加入等量的無血清DMEM低糖培養(yǎng)液；0.5 h后，除CON組外，其余各組均加入LPS(終濃度100 μg/mL)，CON組加入等量的無血清DMEM低糖培養(yǎng)液代替，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每孔加入MTT(5 g/L)20 μL，37 ℃ 孵育4 h，小心吸棄培養(yǎng)液，加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，震蕩10 min使形成的紫色甲瓚結(jié)晶完全溶解，用酶標(biāo)儀于570 nm處測(cè)定各孔吸光度值(A)，計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值×100%。

1.3.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 將生長良好的HPDLF培養(yǎng)至密度為90%左右，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以4×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)、處理及分組同1.3.2項(xiàng)。除CON組外，其余各組細(xì)胞最后經(jīng)LPS(終濃度100 μg/mL)刺激24 h后，1 000 r/min離心10 min，收集細(xì)胞。70%冰乙醇固定細(xì)胞，4 ℃過夜。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞的細(xì)胞周期。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)HPDLF培養(yǎng)液中炎癥因子的表達(dá) 將生長良好的HPDLF培養(yǎng)至密度為90%左右，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以4×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)、處理及分組同1.3.2項(xiàng)。除CON組外，其余各組細(xì)胞最后經(jīng)LPS(終濃度100 μg/mL)刺激24 h后，1 000 r/min離心10 min，取細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)樣品吸光度值，計(jì)算細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-6、IL-8和 IL-1β的含量。

1.3.5 Western blot法檢測(cè)HPDLF中炎癥因子蛋白的表達(dá) 將生長良好的HPDLF培養(yǎng)至密度為90%左右，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以4×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)、處理及分組同1.3.2項(xiàng)。除CON組外，其余各組細(xì)胞最后經(jīng)LPS(終濃度100 μg/mL)刺激24 h后，收集細(xì)胞，以Western blot法檢測(cè)HPDLF中炎癥因子的表達(dá)。具體步驟：將收集的細(xì)胞用預(yù)冷PBS沖洗3次，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白后，BCA法進(jìn)行蛋白定量，加5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min使蛋白變性，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳(電壓60 V至指示劑進(jìn)入分離膠，繼以120 V電泳至結(jié)束)，蛋白分離后采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(4℃，電壓100 V，1 h)，5%脫脂奶粉4 ℃條件下封閉1 h，IL-6、IL-8、IL-1β和GAPDH一抗(1∶1 000)稀釋液室溫孵育過夜，以 TBST溶液清洗3次，5 min/次，以辣根酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000)稀釋液室溫孵育1 h，以 TBST溶液清洗3次，5 min/次，將ECL試劑盒說中發(fā)光液均勻地滴在PVDF膜上，反應(yīng)1 min，再將PVDF膜放入暗室壓片成像。結(jié)果用目的蛋白的灰度值與內(nèi)參(GAPDH)的灰度值的比值表示，用Image J軟件分析成像結(jié)果，進(jìn)行IL-6、IL-8和IL-1β蛋白定量。

1.3.6 Real-time PCR法檢測(cè)HPDLF中炎癥因子的表達(dá) 將生長良好的HPDLF培養(yǎng)至密度為90%左右，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，以4×103個(gè)/孔細(xì)胞密度接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)、處理及分組同1.3.2項(xiàng)。除CON組外，其余各組細(xì)胞最后經(jīng)LPS(終濃度100 μg/mL)刺激24 h后，收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，去除DNA污染后，使用PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒處理，合成cDNA，按照TB Green Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說明方法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃(30 s)預(yù)變性后，95 ℃(5 s)→60 ℃(30 s)，40個(gè)循環(huán)；PCR引物序列為IL-6：Sense：5′-CAAATTCGGTACATCCTCG-3′，Antisense：5′-GCCTCTTTGCTGCTTTCA-3′；IL-8：Sense：5′-ACTCCAAACCTTTCCACC-3，Antisense：5′-CTTCTCCACAACCCTCTG-3′；IL-1β：Sense：5′-TGATGGCTTATTACAGTGGC-3′，Antisense：5′-TGTAGTGGTGGTCGGAGATT-3′；GAPDH：Sense：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′；Antisense：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′。采用2-ΔΔCt方法分析相關(guān)mRNA的表達(dá)量[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響

與CON組比較，LPS組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)；40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL的柚皮苷均可不同程度抑制LPS誘導(dǎo)的HPDLF損傷，與LPS組比較，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+ NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組細(xì)胞存活率均顯著提升(P<0.05)(圖1)。

與CON組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，#：P<0.05

圖1柚皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的牙周膜成纖維細(xì)胞增殖的影響

Fig.1Effect of naringin on proliferation of periodontalligament fibroblasts induced by lipopolysaccharide

2.2 柚皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HPDLF細(xì)胞周期的影響

與CON組比較，LPS組HPDLF細(xì)胞周期進(jìn)程減慢，S期、G2/M期細(xì)胞百分率顯著降低，但G0/G1期細(xì)胞百分率明顯增加；與LPS組比較，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組HPDLF細(xì)胞周期進(jìn)程減慢，S期和G2/M期細(xì)胞百分率均顯著增加，G0/G1期細(xì)胞百分率顯著降低，見圖2。

與CON組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，#：P<0.05

圖2柚皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HPDLF細(xì)胞周期的影響

Fig.2Effect of naringin on lipopolysaccharide-inducedcell cycle of HPDLF

2.3 柚皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HPDLF培養(yǎng)液中炎癥因子水平的影響

ELISA方法檢測(cè)結(jié)果顯示，與CON組比較，LPS組HPDLF培養(yǎng)液中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子含量顯著升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子含量顯著降低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1柚皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HPDLF培養(yǎng)液中炎癥因子水平的影響

組別劑量/(μg/mL)IL-6/(pg/mL)IL-8/(pg/mL)IL-1β/(pg/mL)CON組—21.06±2.2424.08±2.4930.26±3.16LPS組—66.23±6.64?#70.25±7.06?#88.21±9.02?#LPS+NRG組4032.05±5.56?33.05±3.82?36.05±3.81?2030.25±3.05?32.21±3.41?34.08±3.52?1029.21±3.21?32.03±3.32?33.51±3.41?

與CON組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，#：P<0.05

2.4 柚皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HPDLF中炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

Western blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示，與CON組比較，LPS組HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子蛋白表達(dá)顯著升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子蛋白表達(dá)水平顯著降低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

2.5 柚皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HPDLF中炎癥因子基因表達(dá)的影響

Real-time PCR方法檢測(cè)結(jié)果顯示，與CON組比較，LPS組HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子mRNA表達(dá)顯著升高，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與LPS組比較，LPS+NRG 40 μg/mL組、LPS+NRG 20 μg/mL組、LPS+NRG 10 μg/mL組HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥因子mRNA表達(dá)水平顯著降低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。

與CON組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，#：P<0.05

圖3柚皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HPDLF中炎癥因子蛋白表達(dá)的影響

Fig.3Effect of naringin on the expression of inflammatoryfactors in lipopolysaccharide-induced HPDLF

與CON組比較，*：P<0.05；與LPS組比較，#：P<0.05

圖4柚皮苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的HPDLF中炎癥因子基因表達(dá)的影響

Fig.4Effect of naringin on expression of inflammatory factor gene in lipopolysaccharide-induced HPDLF

3 討 論

HPDLF是一組具有多向分化潛能的異質(zhì)性多能干細(xì)胞，作為牙周組織的主要細(xì)胞之一，其具有牙周組織再生能力，可分化形成牙骨質(zhì)、牙周膜、牙槽骨[10-11]。在牙周組織再生過程中，如存在牙周炎癥微環(huán)境，可影響牙周炎患者HPDLF促進(jìn)組織再生的過程[12]。因此，抑制炎癥因子的產(chǎn)生，可有效阻斷牙周炎癥對(duì)牙周組織的過度破壞。

LPS是革蘭陰性厭氧菌外膜主要成分，被公認(rèn)為牙周病致病因子。有研究表明[13-15]，LPS可通過破壞牙齦結(jié)合上皮進(jìn)入牙周組織，與HPDLF的磷脂相互結(jié)合，發(fā)揮細(xì)胞毒作用，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，影響HPDLF生長、合成代謝，使細(xì)胞溶酶體酶大量釋放，激活緩激肽系統(tǒng)，并刺激巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等分泌IL-6、TNF-α等多種炎癥細(xì)胞因子，而齦溝液中的炎癥細(xì)胞因子，可介導(dǎo)局部炎癥反應(yīng)，從而參與牙周炎的發(fā)生和發(fā)展過程。Liu等[16]研究結(jié)果顯示，LPS可通過TLR4調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路及其與CD14的相互作用，激活宿主細(xì)胞HPDLF表達(dá)多種前炎癥細(xì)胞因子，從而始動(dòng)牙周組織的破壞過程?；谏鲜鲅芯砍晒装Y微環(huán)境是牙周炎患者牙周組織的主要微環(huán)境，亦是影響牙周組織再生的關(guān)鍵因素，如在藥物作用下克服牙周組織局部的炎癥環(huán)境，可有效促進(jìn)牙周組織再生。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)LPS刺激后的HPDLF存活率顯著降低，細(xì)胞周期進(jìn)程減慢，S期、G2/M期細(xì)胞百分率顯著降低，但G0/G1期細(xì)胞百分率明顯增加；而40 μg/mL、 20 μg/mL、10 μg/mL的柚皮苷均可不同程度抑制LPS誘導(dǎo)的HPDLF損傷，細(xì)胞存活率均顯著提升，細(xì)胞周期進(jìn)程減慢，S期和G2/M期細(xì)胞百分率均顯著增加，G0/G1期細(xì)胞百分率顯著降低。

IL-1β、IL-8等炎癥細(xì)胞因子是來源于單核-巨噬細(xì)胞的多功能生物活性物質(zhì)，因單核細(xì)胞是機(jī)體抵御病原生物感染的主要效應(yīng)細(xì)胞，因此，IL-1β、IL-8等細(xì)胞因子水平高低決定單核細(xì)胞參與抗感染和炎癥反應(yīng)的能力[17-18]。有研究表明[19]，炎癥損傷級(jí)聯(lián)反應(yīng)中，炎癥組織細(xì)胞將釋放過量的IL-6、IL-8、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子入血，成為神經(jīng)毒性因子，彼此之間相互作用，形成惡性循環(huán)，從而使組織損傷加重。其中，IL-1β屬于IL-1家族成員之一，是由單核-巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子，由于其本身就是內(nèi)源性的致熱源，可以自我激活表達(dá)，促使一些炎癥因子的活化及異常表達(dá)，從而刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，使更多的粘附分子表達(dá)，啟動(dòng)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，致使白細(xì)胞聚集、浸潤，與牙周組織破壞密切相關(guān)。IL-8由單核-巨噬細(xì)胞分泌，中性粒細(xì)胞、多形核白細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生，其主要功能是趨化并活化嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等，參與炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答過程。IL-8的異常分泌會(huì)造成局部組織的炎癥反應(yīng)，在低氧、缺血等條件下可引導(dǎo)合成和釋放具有白細(xì)胞趨化活性的多源性細(xì)胞因子，引導(dǎo)中性粒細(xì)胞進(jìn)入齦溝液，在中性粒細(xì)胞的選擇性補(bǔ)充和激活過程中有重要作用。IL-6屬促炎癥細(xì)胞因子，是由活化的成纖維細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴細(xì)胞因子，在正常健康的生理狀態(tài)下，IL-6生理性存在于齦溝內(nèi)，在血液及組織中的含量比較低，但是在炎癥反應(yīng)過程中大量表達(dá)使其濃度升高，可協(xié)同集落刺激因子，促進(jìn)原始骨髓細(xì)胞分化和增殖。所以 IL-6的含量可以作為炎癥反應(yīng)程度的指標(biāo)，IL-6在血液及組織細(xì)胞中的水平越高則表示炎癥反應(yīng)程度越重，一定程度上反應(yīng)了牙周炎的嚴(yán)重程度[13]。另有研究表明，IL-6可以誘導(dǎo)免疫反應(yīng)過程中的T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌，在成骨細(xì)胞的形成過程中IL-6大量表達(dá)[20]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)LPS刺激后的HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白表達(dá)顯著升高，而經(jīng)不同濃度(40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL)的柚皮苷預(yù)處理后，HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白表達(dá)水平顯著降低，提示柚皮苷可通過調(diào)節(jié)HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β分泌及其相互級(jí)聯(lián)作用，降低牙周組織炎癥反應(yīng)，拮抗LPS作用。

本研究結(jié)果表明，NRG對(duì)LPS誘導(dǎo)的HPDLF損傷具有保護(hù)作用，并可通過抑制LPS誘導(dǎo)的HPDLF中IL-6、IL-8、IL-1β的蛋白及基因表達(dá)水平，促進(jìn)HPDLF增殖，即柚皮苷可通過拮抗LPS對(duì)HPDLF增殖的抑制作用，減弱LPS對(duì)HPDLF及牙周組織破壞程度。以上研究結(jié)果為開發(fā)以柚皮苷為藥效成分治療牙周病提供了基礎(chǔ)理論依據(jù)。但上述作用機(jī)制可能僅僅是一方面，有關(guān)柚皮苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的HPDLF增殖作用的具體機(jī)制，尚需進(jìn)一步研究探討。