不同濃度鹽存儲(chǔ)液對(duì)純鈦表面碳累積效應(yīng)的影響

唐愷洺，邱 憬

種植義齒是一種比較理想的缺失牙修復(fù)方式，具有美觀舒適、不損傷鄰牙等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的缺牙患者將其作為首選治療方案。目前臨床常用的口腔種植系統(tǒng)均采用純鈦種植體。體內(nèi)外研究表明，鈦的生物相容性與其表面特性密切相關(guān)，如表面形貌、親水性、表面能、電荷、化學(xué)組成等。這些特性在鈦種植體/骨界面發(fā)揮著關(guān)鍵作用，包括蛋白質(zhì)吸附，成骨細(xì)胞的粘附、增殖、分化，硬組織形成等[1-3]。為此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)鈦種植體的表面處理進(jìn)行了大量研究，以提高其成骨活性，促進(jìn)骨結(jié)合[4-6]。

鈦種植體在制作完成后，需經(jīng)存儲(chǔ)、運(yùn)輸、入庫(kù)環(huán)節(jié)再進(jìn)入臨床應(yīng)用。有研究發(fā)現(xiàn)，鈦表面經(jīng)過(guò)不同處理后，其生物相容性隨時(shí)間延長(zhǎng)出現(xiàn)衰退[7]，提示鈦表面活性存在老化現(xiàn)象。而該現(xiàn)象與保存過(guò)程中鈦表面的碳污染有關(guān)。Lu等[8]和Hayashi等[9]研究證實(shí)，暴露在空氣中的鈦表面會(huì)吸附空氣中的碳?xì)浠衔?，由此形成的碳累積可進(jìn)一步抑制鈦表面的成骨細(xì)胞行為。目前，臨床應(yīng)用的種植體成品通常保存在含空氣的無(wú)菌包裝瓶或包裝袋中，保存期最長(zhǎng)可達(dá)5年之久。長(zhǎng)久的空氣存儲(chǔ)，使得幾乎所有種植體均存在不同程度的碳污染與生物活性老化。

針對(duì)這一問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者通過(guò)研究提出了諸多抗老化方法，如紫外線照射、化學(xué)緩沖劑浸泡、含活性離子的水溶液浸泡、惰性氣體存儲(chǔ)等[10-12]。其中，鹽存儲(chǔ)液最為方便、經(jīng)濟(jì)，已開始逐漸進(jìn)入臨床應(yīng)用。然而，鹽存儲(chǔ)液抗種植體老化的內(nèi)在機(jī)理，即對(duì)鈦表面碳污染的影響尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)擬采用鹽存儲(chǔ)液作為存儲(chǔ)介質(zhì)，通過(guò)掃描電鏡觀察、接觸角測(cè)試、X射線光電子能譜分析等方法，探究不同濃度鹽存儲(chǔ)液對(duì)純鈦表面碳累積效應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與設(shè)備

純鈦片(99.5%，寶雞鈦業(yè)，中國(guó))，SiC砂紙(天津南景，中國(guó))，無(wú)水乙醇、氯化鈉(分析純，國(guó)藥，中國(guó))，超聲清洗機(jī)(PS-20，DURADSONIC，中國(guó))，掃描電子顯微鏡(1530VP，LEO，德國(guó))，標(biāo)準(zhǔn)型光學(xué)接觸角儀(SL200B，科諾，美國(guó))，X射線光電子能譜儀PHI 5000(VersaProbe, Ulvac-Phi，日本)。

1.2 鹽存儲(chǔ)液及試件制備

鹽存儲(chǔ)液的制備：定量稱取氯化鈉粉末，雙蒸水依次稀釋為0.45%、0.9%、10%的氯化鈉溶液。試件制備：選用直徑5 mm、厚1 mm規(guī)格的純鈦圓片，SiC砂紙(320目、600目、800目、1200目)逐級(jí)打磨拋光，雙蒸水、無(wú)水乙醇、雙蒸水中依次超聲清洗10 min，置于60 ℃烘箱中干燥后備用。將試件隨機(jī)分為五組，分別密閉保存于空氣、雙蒸水(ddH2O)、0.45% NaCl、0.9% NaCl、10% NaCl溶液中2周，其中，空氣組和雙蒸水(ddH2O)組為對(duì)照組，三種鹽存儲(chǔ)液組為實(shí)驗(yàn)組。

1.3 鈦表面微形貌觀察

隨機(jī)選取五種介質(zhì)中存儲(chǔ)14 d后的試件各1枚，超凈臺(tái)下自然晾干后，采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)觀察試件的表面微形貌。

1.4 接觸角和表面能測(cè)定

檢測(cè)接觸角和表面能評(píng)價(jià)各組試件的表面親水性。隨機(jī)選取五種介質(zhì)中存儲(chǔ)14 d后的試件各3枚，在超凈臺(tái)下自然晾干。隨后將2 μL蒸餾水滴在試件表面，采用標(biāo)準(zhǔn)型光學(xué)接觸角儀測(cè)量試件的接觸角及表面能，每枚試件隨機(jī)測(cè)量5個(gè)點(diǎn)，記錄平均值。

1.5 表面元素分析

采用X射線光電子能譜(X-ray photoelectron spectroscopy，XPS)分析五種介質(zhì)中存儲(chǔ)14 d后的試件表面元素組成和化學(xué)態(tài)。入射X線：Al靶，電壓15 kV，功率25 W，入射角45°。元素廣譜分析：160 eV，元素高像素窄譜分析：40 eV。解析元素結(jié)合能參考數(shù)據(jù)庫(kù)：National Institute of Standards and Technology XPS Online Database。根據(jù)峰面積和原子靈敏度因子進(jìn)行表面元素含量和化學(xué)狀態(tài)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組試件的接觸角和表面能檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，顯示數(shù)據(jù)方差齊，進(jìn)行單因素方差分析和S-N-K多重比較，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 鈦表面微形貌

掃描電鏡觀察純鈦試件在五種介質(zhì)中存儲(chǔ)14 d后的表面微形貌見圖1。各組試件表面均可見微小整齊的機(jī)械劃痕?？諝饨M和ddH2O組試件表面較為潔凈，后者偶見微量晶體吸附，而三種鹽存儲(chǔ)液組試件表面可見散在分布的氯化鈉晶體。該結(jié)果表明，鹽存儲(chǔ)液存儲(chǔ)14 d后，純鈦試件表面會(huì)吸附部分氯化鈉晶體，但試件的表面微形貌無(wú)明顯改變。

2.2 接觸角和表面能

五組純鈦試件的接觸角和表面能測(cè)量結(jié)果見圖2，3。對(duì)照組(空氣組和ddH2O組)之間無(wú)顯著差異。與對(duì)照組相比，鹽存儲(chǔ)液組的接觸角明顯減小，表面能亦隨之增大，提示鈦表面的親水性得到了更好的留存。此外，該結(jié)果顯示，鹽存儲(chǔ)液的濃度越高，鈦表面的親水性越好。10% NaCl組的表面能較0.45% NaCl組提高了約20 mN/m。

2.3 表面元素分析

五組純鈦試件表面元素的XPS分析結(jié)果見圖4，5。圖4-a的XPS廣譜分析顯示，各組試件表面均表達(dá)鈦(Ti)、氧(O)、碳(C)信號(hào)，元素的化學(xué)態(tài)無(wú)區(qū)別，但各元素峰值隨儲(chǔ)存介質(zhì)的不同而變化。碳高像素譜(圖4b)及元素組成分析(圖5)顯示，空氣組試件表面的碳含量最高(43.97%)，而鈦含量(15.47%)和氧含量(36.80%)則最低，提示空氣存儲(chǔ)環(huán)境中，鈦表面對(duì)二氧化碳及碳?xì)浠衔锏奈捷^多。相對(duì)于對(duì)照組，鹽存儲(chǔ)液組試件表面的碳含量顯著減少。10% NaCl組的碳含量降至最低的25.67%，同時(shí)鈦和氧含量顯著提高。該結(jié)果表明，純鈦試件在鹽存儲(chǔ)液中保存能有效減少碳累積，且鹽存儲(chǔ)液濃度越高，鈦表面的碳累積越少。

圖1 掃描電鏡觀察純鈦試件在空氣、雙蒸水(ddH2O)、0.45% NaCl、0.9% NaCl、10% NaCl溶液中存儲(chǔ)14 d后的表面形貌

*：a，b,c,d,e代表5組，標(biāo)注字母表示與該組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

圖2純鈦試件在五種介質(zhì)中存儲(chǔ)14 d后的接觸角和表面能

Fig.2Contact angle and surface energy of pure titanium samples under five storage conditions after14days

圖3 純鈦試件在五種介質(zhì)中存儲(chǔ)14 d后的接觸角圖像

3 討 論

種植體骨結(jié)合是種植義齒成功與否的關(guān)鍵。具有良好親水性的鈦種植體表面能為骨結(jié)合創(chuàng)造更有利的生物學(xué)基礎(chǔ)。親水性鈦表面能夠誘導(dǎo)血液迅速擴(kuò)散，形成生物活性因子的整體包覆，進(jìn)而通過(guò)調(diào)節(jié)吸附蛋白的結(jié)合強(qiáng)度、總量和構(gòu)象影響成骨細(xì)胞的早期粘附、增殖和分化[13]。因此，國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛致力于鈦金屬的表面改性，期望通過(guò)不同的表面處理提高鈦表面的親水性，從而促進(jìn)骨結(jié)合。Tallarico等[14]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，親水性種植體相比傳統(tǒng)噴砂酸蝕處理的種植體更具優(yōu)勢(shì)，可以有效緩解種植體周圍骨重建階段的ISQ值下降。得益于此，親水性種植體開始逐步取代傳統(tǒng)種植體。然而，Wael等[15]研究發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，鈦表面存在生物活性向生物惰性的老化過(guò)程，表現(xiàn)為親水向疏水轉(zhuǎn)變。Hayashi等[9]通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，與新鮮制備的鈦表面相比，保存4周后鈦表面的蛋白吸附以及成骨細(xì)胞粘附、分化能力顯著降低。因此，如何有效保存鈦種植體活性以延緩其自然老化成了近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

Wennerber等[16]研究指出，保持生物材料表面活性的一種有效方法是減少大氣中的碳?xì)浠衔镂廴尽Ｌ細(xì)浠衔镂廴?，即碳累積現(xiàn)象，會(huì)改變鈦表面的元素組成和表面能，進(jìn)而干擾蛋白質(zhì)吸附和成骨細(xì)胞的粘附、增殖、分化，最終影響骨結(jié)合。近年來(lái)，有學(xué)者提出利用紫外線照射鈦表面，還原鈦表面的碳?xì)浠衔?，保持其表面活性[17]，但也有研究認(rèn)為，隨著時(shí)間的推移和能量的自然釋放，由紫外線誘導(dǎo)的超親水性表面難以長(zhǎng)期維持[18]。因而，有學(xué)者提出將紫外線處理的新鮮鈦表面置于ddH2O[19]或阿侖膦酸鹽[20]中保存，使鈦表面活性獲得有效存留。上述研究表明，液體存儲(chǔ)的抗老化作用較其他方式更為長(zhǎng)久、有效。作為一種基礎(chǔ)溶液，鹽溶液是最經(jīng)濟(jì)的存儲(chǔ)介質(zhì)，在種植體存儲(chǔ)方面具有良好的應(yīng)用前景。因此，闡明其抗老化的作用機(jī)理，探索其濃度與抗老化效應(yīng)之間的量效關(guān)系，可為新型種植體存儲(chǔ)介質(zhì)的研發(fā)提供重要參考依據(jù)。

圖4 純鈦試件在五種介質(zhì)中存儲(chǔ)14 d后的XPS廣譜(a)和高像素譜(b)分析

圖5 純鈦試件在五種介質(zhì)中存儲(chǔ)14 d后的表面元素組成

為探究鹽存儲(chǔ)液抗鈦表面老化的作用機(jī)理，我們選用三種不同濃度的氯化鈉存儲(chǔ)液，并以空氣和ddH2O為對(duì)照組。五種存儲(chǔ)條件保存純鈦試件14 d后，進(jìn)行理化性質(zhì)檢測(cè)。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，空氣組和ddH2O組鈦表面相對(duì)潔凈，三種氯化鈉存儲(chǔ)液組的鈦表面可見散在分布、大小不一的氯化鈉晶體附著。五組試件表面均可見方向一致的機(jī)械劃痕，其微形貌無(wú)明顯區(qū)別，提示不同存儲(chǔ)條件不會(huì)改變光滑鈦表面的微形貌，該結(jié)果與Lu等[12]的研究結(jié)果一致。隨后我們測(cè)量了五組試件的接觸角，發(fā)現(xiàn)空氣組和ddH2O組無(wú)明顯差異，而三種鹽存儲(chǔ)液組的接觸角顯著減小。更加有趣的是，隨著鹽存儲(chǔ)液濃度的升高，接觸角逐漸遞減，提示鹽存儲(chǔ)液的濃度會(huì)影響鈦表面親水性的存留，五組試件表面能的測(cè)定進(jìn)一步驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)。為了闡明該現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)理，我們對(duì)五組試件的表面元素進(jìn)行了XPS分析。五組試件表面的主要元素一致，均為Ti、O、C。不同的是，三種鹽存儲(chǔ)液組的碳含量更少，而鈦和氧含量相對(duì)較多。在三種鹽存儲(chǔ)液中，隨著濃度的增加，碳含量依次減少。該結(jié)果與親水性測(cè)試相一致。以上結(jié)果說(shuō)明，鹽存儲(chǔ)液通過(guò)減少鈦表面的碳累積，保存了其親水性，且濃度越高，這種抗老化效應(yīng)越明顯。

新鮮制備的鈦表面在液體中帶正電荷[15]，按照電化學(xué)理論，當(dāng)金屬電極與電解質(zhì)溶液接觸時(shí)，在界面因素的作用下，電極和溶液相之間形成一個(gè)在結(jié)構(gòu)和性質(zhì)上與本體溶液不同的過(guò)渡相，形成界面雙電層。緊靠電極表面的內(nèi)層為吸附的水分子偶極層和特性吸附離子(如氯離子等)，這些離子部分或全部去水化，外層為水化離子層，通過(guò)靜電作用吸附至表面。由Boltzman公式可知，電解質(zhì)濃度越高，雙電層離子濃度越高[21]?；诖死碚摽芍?，低濃度氯化鈉存儲(chǔ)液中，界面雙電層的水化鈉離子密度較小，溶液中的碳?xì)浠衔锟梢源┻^(guò)雙電層吸附至鈦表面。當(dāng)鹽存儲(chǔ)液濃度升高時(shí)，雙電層水化鈉離子密度增加，碳?xì)浠衔镫y以穿過(guò)而被隔離在雙電層之外(圖6)，從而減少了鈦表面的碳累積，有效保留了親水性。

圖6 鹽存儲(chǔ)液濃度影響鈦表面碳累積效應(yīng)的作用機(jī)理示意圖

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)鹽存儲(chǔ)液通過(guò)減少鈦表面的碳累積，有效保存了鈦表面的親水性，提出鹽存儲(chǔ)液的濃度會(huì)對(duì)鈦表面的碳累積效應(yīng)產(chǎn)生影響，并對(duì)其內(nèi)在機(jī)理進(jìn)行了推理解釋。將種植體存儲(chǔ)在鹽溶液環(huán)境中具有抗老化的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，但鹽存儲(chǔ)液的最優(yōu)濃度仍需進(jìn)一步結(jié)合生物相容性實(shí)驗(yàn)予以確定。在此基礎(chǔ)上，新型種植體存儲(chǔ)液的溶劑、溶質(zhì)種類及其濃度有待于深入而廣泛的探索。