小麥高分子量谷蛋白亞基缺失品質(zhì)效應(yīng)研究進(jìn)展

張 曉 李 曼 陸成彬 吳宏亞 江 偉 高德榮 ，2

（1江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長江中下游小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，225007，江蘇揚(yáng)州；2揚(yáng)州大學(xué)/江蘇省糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，225009，江蘇揚(yáng)州）

小麥籽粒蛋白按功能可分為代謝蛋白和貯藏蛋白，代謝蛋白包括酶蛋白、水溶性的清蛋白、鹽溶性的球蛋白等；貯藏蛋白包括麥醇溶蛋白（gliadins）和麥谷蛋白（glutenins）2大類，約占籽粒蛋白總量的85%。麥谷蛋白分為高分子量麥谷蛋白亞基（high-molecular-weight glutenin subunit，HMW-GS）和低分子量麥谷蛋白亞基（low-molecular-weight glutenin subunit，LMW-GS）。HMW-GSs只占麥谷蛋白的7%～15%[1-2]，但可解釋45%～70%面包品質(zhì)的變異[3-5]。

HMW-GS由染色體1A、1B和1D長臂上的位點(diǎn)控制，總稱為Glu-1位點(diǎn)，分別用Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1表示[6-8]。其中每個(gè)位點(diǎn)都有2個(gè)緊密連鎖的基因，分別控制分子量較高的X-型亞基和分子量較低的Y-型亞基。理論上，每個(gè)小麥品種存在6個(gè)高分子量谷蛋白亞基，但1Ay亞基通常不表達(dá)，其他位點(diǎn)亞基也有不表達(dá)的情況，所以在六倍體小麥中一般存在3～5個(gè)HMW-GS[6-8]。然而人們普遍重視通過聚合優(yōu)質(zhì)HMW-GS進(jìn)行強(qiáng)筋小麥制品面包品質(zhì)的改良，卻對(duì)HMW-GS缺失在弱筋小麥制品餅干、糕點(diǎn)或其他特色食品品質(zhì)改良上可能具有的重要應(yīng)用價(jià)值重視不夠。本研究對(duì)小麥HMW-GS缺失的類型、機(jī)制和品質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行綜述，以期為不同HMW-GS位點(diǎn)品質(zhì)效應(yīng)的研究和HMW-GS缺失在小麥品質(zhì)改良中的應(yīng)用提供參考。

1 HMW-GS缺失類型及機(jī)制

1.1 HMW-GS的多態(tài)性

在普通小麥中，HMW-GS基因3個(gè)位點(diǎn)所編碼的亞基類型都存在著多態(tài)性。Glu-A1位點(diǎn)常見的有1、2*和 Null亞基；Glu-B1位點(diǎn)有 7、7+8、7+9、6+8、20、13+16、13+19、14+15、17+18、21和22等位變異組合，其中7+8、7+9、17+18、20和13+16等位變異較為常見；Glu-D1位點(diǎn)有2+12、3+12、4+12、5+10、2+10、2.2+12和2+11亞基。對(duì)于面包烘烤品質(zhì)[4，9-12]，Glu-A1位點(diǎn)l和2*優(yōu)于Null；Glu-B1位點(diǎn)7+8、17+18、13+16和14+15優(yōu)于其他亞基；Glu-D1位點(diǎn)5+10優(yōu)于2+12。

1.2 HMW-GS缺失類型

自然界天然存在的HMW-GS缺失材料很少。普通小麥中1Ay亞基通常不表達(dá)；Glu-D1編碼的HMW-GS僅有極少缺失。劉悅等[13]發(fā)現(xiàn)四川白麥子地方品種“奉節(jié)羅漢麥”Glu-D1x亞基缺失；董永梅等[14]在小麥地方品種紅花須須麥中檢測到了Glu-D1y亞基缺失；楊恩年等[15]在普通小麥中檢測到Glu-A1和Glu-B1編碼的HMW-GS共同缺失。Lawrence等[16]利用缺失系Olympic（GIu-B1位點(diǎn)缺失）和Gabo（Glu-A1和Glu-D1位點(diǎn)缺失）創(chuàng)造出HMW-GS表達(dá)數(shù)量由5到0的品系，形成了分別單獨(dú)缺少Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1，共同缺少Glu-A1和Glu-B1、共同缺少Glu-A1和Glu-D1以及同時(shí)缺少Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位點(diǎn)亞基的株系。Payne等[6]獲得了一套類似的缺失突變體材料，HMW-GS數(shù)量從5到2。國內(nèi)外研究人員陸續(xù)利用化學(xué)誘變、輻射處理、離子束輻射誘變或轉(zhuǎn)基因方式獲得了大量HMW-GS突變體。

1.3 HMW-GS缺失機(jī)制

正常表達(dá)的HMW-GS基因編碼區(qū)均無內(nèi)含子。HMW-GS的DNA編碼序列由4個(gè)區(qū)域組成：（1）信號(hào)肽序列，起始密碼子開始的一段63bp的核苷酸序列；（2）無重復(fù)的5?N-末端；（3）中央重復(fù)區(qū)，基因DNA序列長度的差異，主要由基因中部重復(fù)序列大小及重復(fù)次數(shù)不同引起，其變異由該區(qū)域內(nèi)DNA序列的插入或缺失造成[17]；（4）無重復(fù)的3'C-末端。2個(gè)緊密相連的終止密碼子TGATAG終止編碼。由HMW-GS的DNA序列推導(dǎo)出的氨基酸序列可以看出，成熟高分子量谷蛋白亞基包括3個(gè)區(qū)域：N-端非重復(fù)區(qū)，由81～104個(gè)氨基酸組成；高度重復(fù)的中央?yún)^(qū)，由400～670個(gè)氨基酸組成；C-端非重復(fù)區(qū)，由42個(gè)氨基酸組成[5]。

在HMW-GS基因編碼區(qū)，已報(bào)道3種方式可導(dǎo)致HMW-GS基因沉默。一是轉(zhuǎn)座子插入導(dǎo)致編碼失活，如Gu等[18]報(bào)道8.6kb LTR Retrotransposon的插入導(dǎo)致1Ay基因沉默。二是編碼區(qū)出現(xiàn)提前終止密碼子。普通小麥中1Ay基因沉默是終止密碼子提前出現(xiàn)的結(jié)果[19]。小偃54的1Bx14缺失后基因長度同野生型一致，但在1 402bp處C轉(zhuǎn)化為T，在基因的中間重復(fù)區(qū)引入1個(gè)終止密碼子[20]；小偃54的1By15缺失后基因長度同野生型一致，在核苷酸序列上與野生型有1個(gè)堿基的差異（C1780 T），在基因的中間重復(fù)區(qū)引入1個(gè)終止密碼子[21]。HMW-GS基因中C突變成T（CAA---TAA）會(huì)導(dǎo)致亞基發(fā)生沉默；在小麥高分子量麥谷蛋白基因中，由三聯(lián)體密碼CAA或CAG編碼的谷氨酰胺（Gln）殘基比例高達(dá)30%～35%，這2個(gè)三聯(lián)體密碼如發(fā)生C→T的單核苷酸替換都會(huì)突變成終止密碼子TAA或TAG。提前終止密碼子在小麥HMWGS基因沉默中扮演重要角色，而且該沉默機(jī)制都是由C→T單核苷酸替換造成。有些研究者也提出了其他的機(jī)制。Yuan等[22]研究表明，1By亞基缺失突變體云南鐵殼麥（AS332）和西藏半野生小麥（AS908）由于編碼Gln的三聯(lián)體密碼CAA缺失了1個(gè)A，導(dǎo)致核苷酸序列發(fā)生移碼突變，致使在編碼區(qū)的下游出現(xiàn)多個(gè)提前終止密碼子而使基因沉默。1Bx7亞基序列在55bp處缺失1個(gè)堿基A，導(dǎo)致在273bp處出現(xiàn)終止密碼子TGA，蛋白翻譯提前終止，進(jìn)而出現(xiàn)1Bx7亞基缺失[23]。鄭雯[24]發(fā)現(xiàn)野生二粒小麥D1的Ay基因的編碼區(qū)僅在N-末端出現(xiàn)唯一的提前終止密碼子，而非出現(xiàn)在中央重復(fù)區(qū)；野生二粒小麥D100的Ay基因序列編碼區(qū)451bp處卻發(fā)現(xiàn)提前終止密碼子是由A-T的單核苷酸替換所致，即三聯(lián)體密碼AAA突變成終止密碼子TAA。三是較大DNA片段缺失。李寧[25]研究表明，1Dx2+1Dy12亞基缺失突變體Glu-D1位點(diǎn)附近較大DNA片段缺失導(dǎo)致了1Dx2+1Dy12蛋白亞基完全缺失。

2 HMW-GS缺失對(duì)貯藏蛋白組分和蛋白體發(fā)育的影響

Uthayakumaran等[26]研究表明，HMW-GS三位點(diǎn)全缺失系的蛋白質(zhì)含量無顯著變化，但單體蛋白含量增加30%，不溶性蛋白含量下降。Don等[27]研究認(rèn)為谷蛋白大聚合體（glutenin macropolymer，GMP）含量和粒度隨HMW-GS亞基數(shù)目減少而降低。張平平等[28-29]和張紀(jì)元等[30]對(duì)多份HMW-GS單位點(diǎn)或雙位點(diǎn)缺失材料研究表明，Glu-1位點(diǎn)缺失小麥籽粒中不溶性谷蛋白聚合體（UPP）含量降低，HMW-GS/LMW-GS比率下降；同時(shí)利用EMS誘變處理寧麥9號(hào)獲得不同單亞基缺失突變體，結(jié)果表明，GMP含量、谷蛋白/醇溶蛋白和HMWGS/LMW-GS比值較野生型降低。Ma等[31]利用病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生了1Bx14亞基沉默材料，其總蛋白含量、谷蛋白含量和GMP含量均顯著降低。Zhu等[32]研究了HMW-GS與蛋白體形成的關(guān)系，表明HMWGS數(shù)量越多，蛋白體數(shù)量也越多，同時(shí)蛋白體直徑與HMW-GS表達(dá)水平有關(guān)，低HMW-GS含量材料的蛋白體顆粒較小，如HMW-GS全缺失材料中蛋白體直徑不大于6μm。Liu等[33]和劉會(huì)云等[34]研究表明，1Bx20和1By20缺失對(duì)胚乳蛋白體形成沒有明顯影響，但一定程度上刺激了多數(shù)蛋白質(zhì)合成和加工相關(guān)基因表達(dá)，保證了種子內(nèi)蛋白含量、蛋白體外形和大小基本不變，表現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)。Gao等[35]研究發(fā)現(xiàn)1Ax1或1Dx2缺失后谷蛋白聚合體積累率降低，導(dǎo)致谷蛋白聚合體快速積累時(shí)期至少推遲10d，最終成熟籽粒中不溶性谷蛋白大聚體百分比較低。Yang等[36]報(bào)道Glu-A1、Glu-B1或Glu-D1分別缺失后HMW-GS和LMW-GS含量均降低，而醇溶蛋白含量升高。

綜上所述，HMW-GS單亞基、單位點(diǎn)或多位點(diǎn)缺失后，谷蛋白聚合體合成積累延遲，蛋白體顆粒變小，谷蛋白聚合體數(shù)量和粒度均降低，谷蛋白/醇溶蛋白和HMW-GS/LMW-GS比例降低。谷蛋白主要以聚合體形式存在，HMW-GS和LMW-GS通過分子間二硫鍵形成聚合體，其中HMW-GS主要以線性主鏈結(jié)構(gòu)存在，而LMW-GS則以支鏈形式存在，在面團(tuán)形成過程中分子間二硫鍵進(jìn)一步交聯(lián)形成纖維狀大分子聚合體，成為面筋和面團(tuán)的骨架結(jié)構(gòu)[37-40]。由此推測，HMW-GS缺失后，形成谷蛋白聚合體的主鏈減少，進(jìn)而影響了HMW-GS聚合體形成，最終導(dǎo)致谷蛋白聚合體含量和粒度降低。

3 HMW-GS缺失對(duì)面粉和面團(tuán)品質(zhì)的影響

Uthayakumaran等[26]研究表明，與對(duì)照相比HMW-GS全缺失轉(zhuǎn)基因系的面筋強(qiáng)度顯著降低，揉混儀峰值高度和峰值寬度大幅下降，拉伸阻力和延伸度等拉伸儀參數(shù)也顯著降低。李寧[25]在冀92-3235幼胚組織培養(yǎng)過程中進(jìn)行輻射處理，篩選到1Dx2+1Dy12亞基缺失突變體，與對(duì)照相比其粗蛋白質(zhì)含量沒有明顯變化，濕面筋幾乎洗不到，只在網(wǎng)篩上有少量殘留，Zeleny沉降值下降一半。Ram等[41]研究了Glu-A1和Glu-D1位點(diǎn)雙缺失的印度小麥地方品種，其沉淀值降低、粉質(zhì)儀形成時(shí)間縮短。Yue等[42]和武茹[43]通過RNAi技術(shù)獲得1Dx5亞基完全不表達(dá)轉(zhuǎn)化株系，其HMW-GS含量、面筋指數(shù)、Zeleny沉淀值、粉質(zhì)儀形成時(shí)間和穩(wěn)定時(shí)間均顯著降低。Mondal等[44]研究認(rèn)為Glu-A1和Glu-D1兩位點(diǎn)共同缺失揉混儀峰值時(shí)間和峰值高度顯著降低，面團(tuán)彈性降低，延展性增加。含有1Bx7亞基種質(zhì)材料的吸水率、濕面筋、蛋白含量、穩(wěn)定時(shí)間、形成時(shí)間和沉降值等明顯高于1Bx7亞基缺失材料[23]。Zhang等[45]利用離子束誘變小偃81產(chǎn)生HMW-GS 3個(gè)位點(diǎn)Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1分別單獨(dú)缺失的材料，其中Glu-A1基因型SDS沉淀值、粉質(zhì)儀和揉混儀特性比對(duì)照小偃81略有增加，Glu-B1和Glu-D1基因型SDS沉淀值和面團(tuán)質(zhì)量比對(duì)照小偃81顯著降低，以Glu-D1下降幅度最大。張平平等[28-29]利用不同HMW-GS缺失突變體研究表明Glu-A1單缺失、Glu-D1單缺失以及Glu-A1和Glu-D1雙缺失顯著降低了面團(tuán)彈性，提高了面團(tuán)延展性；同時(shí)利用EMS誘變處理寧 麥 9號(hào) 產(chǎn) 生Glu-A1x、Glu-B1x、Glu-B1y、Glu-D1x和Glu-D1y缺失系，經(jīng)研究缺失材料的蛋白質(zhì)含量、籽粒硬度和溶劑保持力等籽粒品質(zhì)未顯著改變，但揉混儀形成時(shí)間、峰值高度和8min帶寬均顯著降低，以Glu-B1x和Glu-D1x缺失型表現(xiàn)最低。Zhang等[46]利用近等基因系研究表明，與野生型（1、7+8、2+12）和Glu-A1位點(diǎn)缺失（Null、7+8、2+12）基因型相比，Glu-D1位點(diǎn)缺失（1、7+8、Null）基因型SDS沉淀值、乳酸SRC、面筋指數(shù)、粉質(zhì)儀穩(wěn)定時(shí)間和吹泡儀P值顯著降低，但籽粒硬度、蛋白質(zhì)含量和水SRC均無顯著變化。

綜上所述，HMW-GS缺失后面團(tuán)強(qiáng)度和彈性降低。在HMW-GS不同位點(diǎn)缺失類型中，以Glu-D1位點(diǎn)缺失面團(tuán)強(qiáng)度和彈性下降最大，其次是Glu-B1位點(diǎn)，Glu-A1位點(diǎn)缺失面團(tuán)強(qiáng)度變化不大或略有增加，進(jìn)一步說明Glu-D1位點(diǎn)對(duì)品質(zhì)的貢獻(xiàn)最大。面團(tuán)形成過程中，面粉經(jīng)水化后HMW-GS和LMW-GS通過分子間二硫鍵作用形成纖維狀谷蛋白聚合體構(gòu)成面筋的骨架，醇溶蛋白則在分子內(nèi)二硫鍵的主要作用下形成球狀結(jié)構(gòu)，通過非共價(jià)鍵與麥谷蛋白結(jié)合，充填在纖維狀大分子聚合體中，谷蛋白和醇溶蛋白共同形成面筋，賦予面團(tuán)粘彈性[39，47]。由此推測，HMW-GS缺失后，用以形成谷蛋白聚合體的主鏈結(jié)構(gòu)減少，谷蛋白聚合體積累下降，面團(tuán)骨架結(jié)構(gòu)變?nèi)酰M(jìn)一步造成了面團(tuán)強(qiáng)度和彈性降低。

然而上述多個(gè)研究表明，HMW-GS缺失后蛋白質(zhì)含量、硬度和吸水特性并無顯著變化。蛋白質(zhì)含量無顯著變化可能與谷蛋白和醇溶蛋白的補(bǔ)償效應(yīng)有關(guān)，谷蛋白積累含量降低，醇溶蛋白含量補(bǔ)償增加，最終蛋白質(zhì)含量無顯著變化[36]。籽粒硬度無顯著變化，這可能是由于小麥硬度和HMW-GS屬于完全不同的基因，籽粒硬度由位于5D染色體短臂的主效基因控制，而HMW-GS由染色體1A、1B和1D長臂上的位點(diǎn)控制[48]。吸水特性與硬度密切相關(guān)，HMW-GS缺失后籽粒硬度無顯著變化，吸水特性也相應(yīng)變化較小[49]。

4 HMW-GS缺失對(duì)加工品質(zhì)的影響

Lawrence等[16]研究發(fā)現(xiàn)Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1單位點(diǎn)缺失、雙位點(diǎn)缺失或三位點(diǎn)缺失系的蛋白質(zhì)含量無變化或升高，面包烘烤品質(zhì)顯著下降。Beasley等[50]研究報(bào)道，隨著HMW-GS亞基缺失數(shù)目增加，面包高度極顯著下降，鮮面條穿刺力極顯著下降，但煮熟面條的剪切力和壓縮力無顯著變化。Uthayakumaran等[26]利用HMW-GS三位點(diǎn)缺失材料制作的面包體積非常??；墨西哥薄圓餅直徑顯著變大，可卷性和穿刺力下降。Mondal等[44]利用Glu-A1和Glu-D1兩位點(diǎn)共同缺失且Glu-B1位點(diǎn)為17+18亞基的材料制作的墨西哥薄圓餅直徑比HMW-GS不缺失親本顯著增大，但產(chǎn)品貨架穩(wěn)定性差、易碎；Glu-B1位點(diǎn)缺失，Glu-D1位點(diǎn)具5+10亞基或同時(shí)Glu-A1位點(diǎn)具有1亞基材料可改善墨西哥薄圓餅直徑，同時(shí)具有較好的貨架穩(wěn)定性。Zhang等[51]研究表明，部分HMW-GS缺失類型（2*，17+_，5+_）和（2*，17+_，2+12）表現(xiàn)中等面團(tuán)強(qiáng)度和強(qiáng)延展性，制作的饅頭品質(zhì)好；同時(shí)發(fā)現(xiàn)HMW-GS單亞基缺失系糖酥餅干直徑較野生型顯著增加[30]。Liu等[33]和劉會(huì)云等[34]報(bào)道1Bx20和1By20缺失引起面團(tuán)和面包加工品質(zhì)下降。Zhang等[46]利用近等基因系群體研究表明，與Glu-A1缺失和野生型（1，7+8，2+12）相比，Glu-A1、Glu-D1位點(diǎn)雙缺失和Glu-D1位點(diǎn)單缺失均顯著增加曲奇餅干直徑和酥脆性。

綜上所述，單個(gè)或多個(gè)HMW-GS位點(diǎn)缺失后面包烘烤品質(zhì)均顯著下降；Glu-A1和Glu-D1位點(diǎn)雙缺失材料制作的墨西哥薄餅直徑顯著增加，貨架穩(wěn)定性差，易碎，Glu-B1位點(diǎn)缺失且Glu-D1位點(diǎn)具5+10亞基可改善墨西哥薄餅直徑，同時(shí)具有較好的貨架穩(wěn)定性。Glu-B1x、Glu-B1y和Glu-D1y單亞基缺失或Glu-D1位點(diǎn)缺失顯著增加餅干直徑。Glu-B1或Glu-D1位點(diǎn)部分單亞基缺失材料制作饅頭品質(zhì)顯著改良。

5 研究展望

綜合上述研究，小麥HMW-GS缺失并未顯著改變蛋白質(zhì)含量和籽粒硬度；蛋白質(zhì)含量無顯著變化，可能與低分子量谷蛋白以及醇溶蛋白補(bǔ)償升高有關(guān)[36]；籽粒硬度無顯著變化，是由于小麥硬度和HMW-GS基因位于不同染色體[48]。小麥HMW-GS單亞基、單位點(diǎn)或多位點(diǎn)缺失后，GMP含量降低，谷蛋白/醇溶蛋白比例下降，HMW-GS/LMW-GS比率下降，面團(tuán)強(qiáng)度和彈性降低；Glu-D1位點(diǎn)缺失面團(tuán)強(qiáng)度和彈性下降幅度最大，其次是Glu-B1位點(diǎn)，Glu-A1位點(diǎn)缺失面團(tuán)強(qiáng)度變化不大或略有增加。單個(gè)或多個(gè)HMW-GS位點(diǎn)缺失后面包烘烤品質(zhì)均顯著下降；Glu-A1和Glu-D1位點(diǎn)雙缺失且Glu-B1位點(diǎn)攜17+18亞基材料制作的墨西哥薄餅直徑顯著增加，但貨架穩(wěn)定性差，易碎，Glu-B1位點(diǎn)缺失且Glu-D1位點(diǎn)具5+10亞基可改善墨西哥薄餅直徑，同時(shí)具有較好的貨架穩(wěn)定性；Glu-B1x、Glu-B1y和Glu-D1y單亞基缺失或者Glu-D1位點(diǎn)缺失顯著增加餅干直徑；Glu-B1或Glu-D1位點(diǎn)1或2個(gè)Glu-1y亞基缺失制作饅頭品質(zhì)顯著改良。

不同研究所用HMW-GS缺失材料的遺傳背景存在差異，在具體分析應(yīng)用時(shí)需要考慮到HMWGS缺失與其他品質(zhì)相關(guān)基因組合的影響。高分子量谷蛋白、低分子量谷蛋白和醇溶蛋白是面筋蛋白的主要成分，3種組分的亞基類型和含量，以及HMW/LMW和Glu/Gli比例與小麥加工品質(zhì)密切相關(guān)[39，47]。此外，籽粒硬度也是影響面團(tuán)和食品加工品質(zhì)的重要因素[48-49]。當(dāng)前多數(shù)HMW-GS缺失品質(zhì)效應(yīng)研究所用材料、遺傳背景和亞基缺失類型不同，不同亞基缺失的品質(zhì)效應(yīng)研究結(jié)果存在差異，尤其不同HMW-GS缺失在食品中應(yīng)用的探索較少，亞基缺失的品質(zhì)效應(yīng)及對(duì)食品品質(zhì)的改良作用需進(jìn)一步深入。因此，今后仍需在以下幾方面進(jìn)行研究：一是不同HMW-GS缺失在不同遺傳背景下的品質(zhì)效應(yīng)，構(gòu)建不同品質(zhì)類型遺傳背景和不同HMWGS缺失類型（單亞基、單位點(diǎn)和多位點(diǎn)）遺傳群體進(jìn)行品質(zhì)研究，探明不同HMW-GS缺失與不同低分子量谷蛋白亞基、醇溶蛋白亞基和不同硬度基因型組合的品質(zhì)效應(yīng)；二是重點(diǎn)進(jìn)行HMW-GS缺失對(duì)弱筋小麥制品品質(zhì)效應(yīng)的研究，篩選出對(duì)弱筋小麥制品品質(zhì)改良效應(yīng)最大的亞基缺失類型和遺傳背景組合；三是研究不同HMW-GS缺失的遺傳和生理機(jī)制，并開發(fā)相應(yīng)分子標(biāo)記；四是利用不同HMW-GS缺失基因型進(jìn)行新型特色食品的研發(fā)并進(jìn)行市場化開發(fā)。