豬流行性腹瀉病毒新型檢測方法的研究進展

李公美,李茂輝,錢愛東,單春蘭,馬紅霞*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學 教研基地管理處,吉林 長春 130118；3.云南農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，云南 昆明 650225)

豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是一種可引起出生仔豬嘔吐、腹瀉和脫水為主要臨床癥狀的高度傳染性腸道病毒。PEDV為套式病毒目、冠狀病毒科、α冠狀病毒屬成員，為有囊膜呈皇冠狀的單股正鏈RNA病毒，基因組長約2.8 kb，由3個非結(jié)構(gòu)蛋白(ORF1a、ORF1b和ORF3)和4個結(jié)構(gòu)蛋白(S、E、M和N)共同組成[1]。2010年后，PEDV突然在我國呈暴發(fā)性流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。隨后該病在韓國、泰國、越南、美國、加拿大和墨西哥等國也相繼暴發(fā)，致使數(shù)以萬計仔豬死亡[2-3]。研究表明，本次暴發(fā)流行的是一種新型PEDV毒株，該變異毒株相比2010年以前流行的以CV777為代表的經(jīng)典毒株在S基因有15個堿基的插入和6個堿基的缺失。然而，當前疫苗未能給豬群提供有效的免疫保護，因此，開發(fā)新型毒株疫苗和建立變異株快速準確的檢測方法迫在眉睫。本文針對當前PEDV的檢測方法進行綜述，以期為變異毒株的診斷和防控提供最新且高效的檢測方法。

1 分子生物學檢測技術(shù)

1.1 RT-PCRRT-PCR是PCR技術(shù)的一種變形應(yīng)用，廣泛應(yīng)用于RNA病毒的檢測。RT-PCR檢測技術(shù)作為最基礎(chǔ)的核酸檢測技術(shù)，比傳統(tǒng)的其他方法敏感。因此， PEDV RT-PCR是應(yīng)用最廣泛的檢測技術(shù)，被廣大研究人員相繼開展使用。胡麗萍等[4]為了實現(xiàn)對PEDV的實驗室診斷，用PEDV N基因設(shè)計了1對特異性引物，建立了PEDV 一步法RT-PCR檢測方法，該方法對常見豬病毒無交叉反應(yīng)、重復(fù)性好、穩(wěn)定高且最低可檢測1 pg RNA，同時應(yīng)用該方法對廣西25個豬場采集的共計506份病料進行了檢測分析，結(jié)果表明廣西豬場存在較為嚴重的PEDV感染。據(jù)報道，PEDV在美國存在3種類型毒株(original US virulent、S-INDEL和S-197DEL)共同流行的復(fù)雜態(tài)勢，LIU等[5]基于毒株在S基因S1區(qū)的差異設(shè)計3條上游引物和1條下游引物，建立了可區(qū)分檢測美國不同毒株的RT-PCR檢測方法，結(jié)果顯示該方法有較好的特異性和敏感性,可以檢測區(qū)分3種不同類型的美國毒株，證明其可應(yīng)用于未來的PEDV分子流行病學調(diào)查。為了提高RT-PCR的檢測敏感性及特異性，也有學者利用Nanoparticle加入RT-PCR反應(yīng)，建立了Nanoparticle-assisted RT-PCR。相比傳統(tǒng)RT-PCR方法，可提高10～100倍的敏感性，并且該方法可以有效區(qū)分野毒株和疫苗株[6]。隨著納米技術(shù)的應(yīng)用及檢測要求的不斷提高，多種PCR優(yōu)化及衍生方法被建立，如可同時檢測并區(qū)分PEDV經(jīng)典和變異毒株的Nano-nest-PCR方法及可實現(xiàn)PEDV與TGEV同時檢測的雙重nanoPCR等檢測方法[7-8]。以上多種衍生的新型PCR檢測方法，不僅顯著地提高了PCR檢測方法的敏感性，而且可對不同類型毒株進行鑒別及區(qū)分，為PEDV的診斷提供了可靠的檢測方法。

1.2 實時熒光定量RT-PCR 實時熒光定量RT-PCR(real-time RT-PCR)作為1996年開發(fā)的第2代PCR技術(shù)，是當前廣泛應(yīng)用的核酸定量方法。該方法擁有比普通PCR等多種檢測方法更好的敏感性和特異性，且可以進行核酸定量。因此，有學者建立了多種PEDV熒光定量PCR檢測方法，有效的提高了檢測的敏感性和時效性。當前PEDV在我國同時以經(jīng)典和變異毒株共同流行的復(fù)雜態(tài)勢，給PEDV的防控和精準診斷帶來巨大的挑戰(zhàn)。有研究根據(jù)此流行態(tài)勢和real-time RT-PCR的技術(shù)優(yōu)勢建立了雙重TaqMan real-time RT-PCR，該方法可同時擴增PEDV經(jīng)典和變異毒株，并可依據(jù)熒光集團鑒別毒株類型，有較好的特異性和重復(fù)性且最低可檢測10 copies/μL，是當前較為敏感且快速準確的PEDV檢測方法[9]。MILLER等[10]利用1 064份直腸拭子對建立的分別檢測N基因和S基因的real-time RT-PCR進行檢測評價分析，結(jié)果顯示N基因real-time RT-PCR在臨界值Cq≤34.99時是一種方便、快速且靈敏的檢測方法，證實real-time RT-PCR可以通過對豬直腸拭子的檢測實現(xiàn)對PEDV急性感染的動態(tài)檢測，為PEDV的早期診斷治療提供有效的診斷工具。在新型PEDV暴發(fā)的早期建立了多種real-time RT-PCR檢測方法，滿足了對PEDV變異和經(jīng)典毒株的檢測及對PEDV急性感染的早期診斷[11-12]。real-time RT-PCR相比常規(guī)PCR方法檢測靈敏度高10～100倍，交叉污染率低，動態(tài)檢測范圍大且具有高通量的擴增能力及精確的靶基因定量檢測能力。但是，real-time RT-PCR因需要昂貴的實驗儀器，高昂的檢測成本及專業(yè)的操作人員而不能大范圍推廣應(yīng)用。

1.3 RT-LAMP環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)是2000年由日本學者Notomi開發(fā)的一種簡便、快速、準確和低價的核酸恒溫擴增技術(shù)。LAMP檢測技術(shù)在短時間內(nèi)就應(yīng)用到多種病原檢測工作中，成為當前臨床診斷常用方法之一。王偉等[13]在PEDVM基因設(shè)計引物建立了RT-LAMP檢測方法，該方法在60℃下，60 min即可讀取結(jié)果，該方法特異性好，最低可檢測1×102copies/μL，同時在反應(yīng)結(jié)束后加入SYBR GreenⅠ，在紫外燈光下，陽性樣品呈綠色熒光，因此RT-LAMP方法因其快速簡便將在PEDV臨床檢測中獲得廣泛的應(yīng)用。YU等[14]為了在缺少設(shè)備的豬場實現(xiàn)快速檢測，建立了一種real-time RT-LAMP檢測方法，最低可檢測0.07 PFU，比一步法RT-PCR敏感100倍，與real-time RT-PCR敏感性相當，因此該方法應(yīng)用于臨床豬場進行大規(guī)模PEDV診斷有非常好的前景。然而，在LAMP試驗中與試劑一同孵育的染料如鈣黃綠素和Picogreen等常常會引起假陽性結(jié)果，且在反應(yīng)結(jié)束后開管添加SYBR GreenⅠ易引起交叉污染等問題，一直困擾LAMP的可視技術(shù)發(fā)展。因此，有學者針對以上問題，將RT-LAMP檢測技術(shù)與垂直流(VF)核酸檢測試紙條相結(jié)合，建立了RT-LAMP-VF PEDV檢測方法，該方法通過將垂直核酸檢測條置于可視化條帶盒的密封塑料裝置中以控制在擴增中的污染問題，該方法有較好的特異性，最低可檢測10 pg核糖核酸，可在PEDV臨床診斷中大范圍應(yīng)用[15]。

1.4 重組聚合酶擴增反應(yīng)重組聚合酶擴增反應(yīng)(RPA)是當前開發(fā)的最具前沿的恒溫核酸擴增技術(shù)(INAT)之一。RPA相比傳統(tǒng)PCR擴增方法差異在于其可在單一溫度下快速的核酸擴增，操作步驟簡便并可實現(xiàn)PON檢測，是當前臨床現(xiàn)場最快速的檢測方法。呂繼洲等[16]以PEDV M基因設(shè)計引物和探針建立了熒光RPA檢測方法，該方法可在39℃ 20 min讀取結(jié)果，敏感性可達10 copies /μL，可對血漿與血漿蛋白粉中的PEDV檢測，該方法不僅可適用于PEDV的預(yù)防也是臨床檢測的高效新型檢測方法。RPA可通過單鏈核酸重組酶、DNA單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶這3種酶，在無需儀器情況下利用體溫進行核酸擴增，因此該方法將是PEDV臨床現(xiàn)場檢測中最具時效性且簡便敏感的最新檢測方法。

2 免疫學檢測

2.1 ELISAELISA是免疫學檢測中應(yīng)用最廣的檢測方法之一，一直被作為血清學檢測的金標準。ELISA檢測方法是可進行大規(guī)模臨床檢測且價格低廉的檢測方法，被廣泛應(yīng)用于血清學調(diào)查和抗體效價評估。趙玉龍等[17]為了評價豬血清中PEDV抗體水平，使用純化的PEDV作為包被抗原，建立了檢測PEDV血清抗體的ELISA方法，該方法不僅可通過D450值作為感染評判標準且通過抗體效價進行疫苗免疫效果分析，不僅作為豬場PEDV抗原檢測方法也為PEDV疫苗免疫防控計劃提供指導(dǎo)。王麗珍等[18]利用最新、抗原匹配性更好的疫苗強毒株SCh作為全病毒包被抗原，建立了陽性率檢出更高，特異性更強的PEDV間接ELISA抗體檢測方法，該方法對來自福建、廣東和江西的74份血清樣品進行檢測，陽性率為84%，與商品化ELISA試劑盒的符合率為81%，因此該方法具備臨床檢測的可行性。當前，也有多種以PEDV S蛋白和N蛋白作為抗原建立的ELISA方法，但是相比以純化的PEDV作為包被抗原的方法，產(chǎn)量低，有時表達的蛋白為包涵體且抗原位點單一，影響檢測的特異性及陽性率的檢出[19-20]。雖然ELISA檢測方法不適用于急性感染的檢測，但是其可通過抗體效價作為豬群防控及疫苗免疫效價進行評估，也是PEDV血清學調(diào)查最有效的檢測工具。

2.2 免疫層析技術(shù)免疫層析技術(shù)是近些年國內(nèi)外較為流行的一種快速診斷技術(shù)，其可利用膠體金或免疫酶等物質(zhì)使抗體與抗原結(jié)合的特定區(qū)域顯示不一樣的顏色，從而實現(xiàn)特異性的診斷。該方法具有較好的特異性和敏感性且是一種簡便易行的可實現(xiàn)現(xiàn)場診斷的快速檢測方法，因此利用該技術(shù)開發(fā)的多種檢測試紙條已被廣泛應(yīng)用于寵物醫(yī)院、養(yǎng)殖場和檢疫等部門。為了實現(xiàn)對PEDV急性傳染病的早期快速檢測，LYOO等[21]研發(fā)了一種免疫層析試紙條(ICA)檢測豬糞便的拭子，該方法最低可檢測104.0TCID50/mL，且與real-time RT-PCR相比ICA特異性和敏感性分別為98.6%和95%，樣品檢測一致性達100%，因此該方法可適用于豬場PEDV的臨床診斷。汪懌旸等[22]通過對PH、抗體濃度和封閉時間等多種條件優(yōu)化也同樣建立了免疫膠體金試紙條檢測PEDV，該方法可在10 min內(nèi)判定結(jié)果，最低可檢測310個TCID50病毒量。然而，相比適用免疫膠體金檢測的PEDV抗原，有學者建立了可檢測血清中PEDV抗體的免疫膠體金檢測方法。LI等[23]利用純化重組的PEDV N蛋白建立了檢測豬血清中PEDV抗體的膠體金試紙條，且與商品化的ELISA試劑盒相比敏感性和特異性分別為96%和90.8%。綜上分析發(fā)現(xiàn)建立的多種PEDV免疫膠體金試紙條可用于PEDV臨床的快速診斷，并可協(xié)助PEDV感染的早期診斷及流行病學監(jiān)測等研究。然而，免疫膠體金試紙條檢測成本較高且不能區(qū)分當前流行的變異株，希望在未來的研究中能降低使用成本及開發(fā)出可檢測變異毒株的多重條帶免疫膠體金檢測試紙條。

2.3 熒光微球免疫熒光微球免疫分析(FMIA)是將特定病毒抗原偶聯(lián)至熒光微球，并通過使用生物素/鏈霉親和素/熒光團檢測系統(tǒng)(雙重激光儀)檢測抗原的特異性抗體，最終根據(jù)顯示的中值熒光強度(MFI)讀取血清中抗體的含量[24]。有研究利用PEDV N 蛋白建立了一種檢測血清中PEDV特異性抗體的FMIA檢測方法，并通過大量試驗和臨床樣品進行反復(fù)檢測評估，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FMIA獲得的結(jié)果與通過間接和阻斷ELISA以及IFA測試獲得的實驗結(jié)果呈高度相關(guān)性(kappa>0.91)，且該方法具有較高的敏感性(98.2%)和特異性(99.2%)，通過對實驗動物中血清IgG和IgM的動態(tài)監(jiān)測發(fā)現(xiàn)PEDV的抗體最早在感染的6 d后產(chǎn)生，21 d時達到頂峰并可持續(xù)監(jiān)測到43 d[24]。FMIA抗體檢測方法相比最常用的ELISA方法有較高的靈敏度、樣品檢測數(shù)量多及可同時檢測多種病原體抗體的優(yōu)勢，并且其在流體孵育中抗原包被的微球珠在溶液中呈三維空間暴露，抗體結(jié)合路徑變短且通過激光儀代替酶標儀，因此試驗及檢測時間明顯縮短。該方法也可根據(jù)疫苗株或野毒株蛋白的差異，開發(fā)出一種可區(qū)分疫苗株或野生毒株的檢測方法，總之，F(xiàn)MIA作為新興的抗體檢測方法，相比當前的多種抗體檢測方法具有明顯的優(yōu)勢，將成為最具前景的抗體檢測方法。

3 其他方法

隨著檢測技術(shù)的發(fā)展和臨床檢測試驗要求的不斷提高，研究者相繼建立了多種新型PEDV檢測方法滿足當前臨床及試驗需求。如可實現(xiàn)疾病早期診斷的恒溫隔絕式PCR(iiPCR)，采用靶向的PEDVS基因引物和探針建立了可臨床現(xiàn)場快速檢測的PEDV iiPCR檢測方法[25]；IFA被應(yīng)用于檢測PEDV抗體，評價豬群免疫狀態(tài)[26]；OKDA等[24]最近開發(fā)了一種使用熒光聚焦中和試驗(FFN)檢測PEDV，F(xiàn)FN可快速測量NAbs滴度，也有研究者使用優(yōu)化的FFN試驗可檢測初乳和乳汁中的NAbs滴度[27]。因此，可根據(jù)檢測的不同需要選擇最有效的檢測方法，并及時將最新的檢測技術(shù)應(yīng)用到PEDV臨床檢測及試驗中。

4 總結(jié)

當前，PEDV是豬群中流行最廣泛的腸道病毒，且同時存在經(jīng)典與變異2種類型毒株，給防控及診斷帶來嚴峻挑戰(zhàn)，嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。因此，科研人員不斷的開發(fā)新型PEDV檢測技術(shù)投入到實驗研究和臨床診斷，為PEDV的防控及發(fā)病機制研究提供最有效的檢測方法。分子生物學檢測方法可快速的實現(xiàn)鑒別診斷多種類型腸道病毒及區(qū)分PEDV經(jīng)典和變異毒株，但是該方法需要昂貴的機器且多為實驗室診斷技術(shù)，不能應(yīng)用到現(xiàn)場檢測。免疫學檢測方法不僅為PEDV早期感染提供有效信息且可通過抗體評價疫苗的免疫效果，為PEDV疫苗防控提供有效的免疫計劃。但是，免疫學檢測技術(shù)不能檢測到急性感染狀態(tài)且耗時費力。然而，近些年新興的RPA、免疫膠體金和FMIA檢測技術(shù)的廣泛應(yīng)用，不僅滿足了臨床快速的定點診斷而且實現(xiàn)了大規(guī)模樣品檢測，雖然還存在檢測成本高昂及技術(shù)復(fù)雜等問題，但為快速精準的PEDV診斷和控制病毒傳播提供了可靠的檢測技術(shù)。隨著新型技術(shù)的不斷運用，建立一種快速準確，價格低廉且可滿足多種檢測診斷需求的新技術(shù)，為PEDV的有效防控提供最有效的檢測方法勢在必行。