兩種梧桐葉綠體基因組密碼子使用偏性分析

陸奇豐　駱文華　黃至歡

摘要：? 為了分析美麗梧桐、云南梧桐葉綠體基因組密碼子的使用偏性，該研究通過篩選美麗梧桐、云南梧桐葉綠體基因組中各52條蛋白編碼序列，并利用CodonW、CUSP和SPSS軟件對其密碼子使用模式及偏性進行了分析。結果表明：（1）美麗梧桐、云南梧桐的GC含量分別為38.12%、38.05%，表明葉綠體基因組內富含A/T堿基。（2）有效密碼子數（ENC）范圍為36.91～56.46、36.55～58.04，表明多數密碼子偏性較弱。（3）相對同義密碼子（RSCU）分析顯示，RSCU>1的密碼子各有29個，其中28個以A、U結尾。（4）中性繪圖顯示，GC3與GC12的相關性不顯著，回歸曲線斜率分別為0.195和0.304，說明密碼子偏好性主要受到自然選擇的影響。（5）ENC-plot分析中大部分基因分布于曲線的周圍和下方，ENC比值多分布于-0.04～0.10之間，表明突變會影響密碼子偏性的形成。此外，17、18個密碼子分別被鑒定為美麗梧桐、云南梧桐的最優(yōu)密碼子。以上結果說明美麗梧桐、云南梧桐葉綠體基因組的密碼子使用偏性可能受選擇和突變共同作用，且使用模式較為相似，但具有一定的差異，可能與適應環(huán)境的進化機制有關。

關鍵詞： 美麗梧桐， 云南梧桐， 葉綠體基因組， 密碼子偏性， 最優(yōu)密碼子

中圖分類號：? Q943.2文獻標識碼：? A

文章編號：? 1000-3142（2020）02-0173-11

Abstract：? In order to analyze the codon usage patterns of the chloroplast genome of Firmiana pulcherrima and F. major. Fifty-two genes selected from chloroplast genome （Cp genome）? of these two species? were analyzed using CodonW， CUSP and SPSS software. The results showed that： （1） GC content in Firmiana pulcherrima was 38.12%， and that in F. major was 38.05%， suggesting that A/T base was rich in chloroplast genome. （2） The effective number of codons in F. pulcherrima ranged from 36.91 to 56.46， and that in F. major ranged from 36.55 to 58.04， meaning the codon bias was weak in F. pulcherrima and F. major. （3） Both F. pulcherrima and F. major? had 29 codons with relative synonymous codon usage （RSCU） greater than 1 and 28 codons ending with A and U base. （4） Neutrality plot showed that there was not significant correlation between GC3 and GC12， and the regression slope was 0.195 in F. pulcherrima， and 0.304 in F. major， suggesting that codon bias was mainly affected by natural selection. （5） ENC-plot analysis showed that most of genes fell below and followed the standard curve， and ENC ratio of most genes ranged from -0.04 to 0.10， suggesting that the mutation also affected the formation of codon bias in F. pulcherrima and F. major. In addition， 17 codons were identified as optimal codons in F. pulcherrima， and 18 codons in F. major. We suggest that the codon usage bias of F. pulcherrima and F. major are formed under effect of mutation and selection. Although the codon usage pattern of F. pulcherrima and F. major are very similar， there are some differences， which may be related to the evolutionary me-chanism of adaptive environment.

Key words： Firmiana pulcherrima， F. major， chloroplast genome， codon usage bias， optimal codons

自然界中，基因序列根據三聯密碼子法則翻譯成氨基酸序列，并進一步組裝修飾形成具有特定空間結構和功能活性的蛋白質。密碼子由3個相連的核苷酸堿基所組成，一共存在64個密碼子，除去3個終止密碼子 （UAA、UAG、UGA），61個密碼子對應特定的氨基酸。天然氨基酸有20種，除了甲硫氨酸（AUG）、色氨酸（UGG）對應單一密碼子編碼以外，其余18種氨基酸還均對應2～6個編碼密碼子。編碼相同氨基酸的不同密碼子又稱為同義密碼子，同義密碼子使用頻率在基因內不是隨機的，而是優(yōu)先使用其中一些密碼子，這一現象被稱為密碼子使用偏性（Gustafsson et al.， 2004;Li et al.， 2017）。影響密碼子偏性的因素較多，如自然選擇下DNA的變異（Ashesh， 2002;Suzuki， 2011）、tRNA豐度（Buchan et al.， 2006）、基因序列長度（Gabriel et al.， 2001;Stoletzki et al.， 2011;Ribeiro et al.， 2012）、蛋白質翻譯效率（Haupt et al.， 2009;Li et al.， 2017）等。研究密碼子偏性不僅有助于解釋物種間進化規(guī)律，而且還對基因表達、載體構建、未知功能基因的分析具有重要意義。

葉綠體屬于半自主性細胞器，是進行光合作用和固定CO2的主要場所，參與植物生長環(huán)境脅迫（干旱、鹽、光等）相關的重要代謝過程（Liu et al.， 2018）。此外，葉綠體具有母系遺傳、結構穩(wěn)定和基因組較小等特性，從而廣泛運用于植物多樣性、系統(tǒng)發(fā)育、DNA 條碼開發(fā)、植物適應性和遺傳工程研究中（Sajjad et al.， 2017;Liu et al.， 2018）。不同物種葉綠體基因組密碼子使用偏性存在一定差異（Liu & Xue， 2005;鄭薇瑋等，2016）。密碼子使用模式對基因功能和表達有一定的影響作用，基因的密碼子偏性越強，其表達水平越高（Zhou et al.，2016）。因此，為提高葉綠體遺傳轉化效率及目的基因表達水平，很有必要開展葉綠體全基因組密碼子使用模式的研究。

美麗梧桐（Firmiana pulcherrima）、云南梧桐（F. major）是梧桐屬內的重要物種，具有較高的研究價值和經濟價值。但是，由于生態(tài)環(huán)境的破壞，美麗梧桐、云南梧桐野外資源日益減少，已被列為瀕危樹種（中國科學院，1984;余志祥等，2013;周亞東等，2013）。目前，對美麗梧桐、云南梧桐的研究主要集中于資源調查（黎國運等，2011;Yang et al.， 2018）、種苗繁育（黎國運等，2011;余志祥等，2013;周亞東等，2013）等方面，兩種梧桐葉綠體全基因組雖已完成測序 （Wang et al.， 2018;Ya et al.， 2018），但關于兩者的葉綠體基因組編碼基因的密碼子使用模式比較的研究卻尚未見有報道。因此，本研究在前人研究的基礎上，對美麗梧桐和云南梧桐的葉綠體基因組中52個基因的密碼子堿基組成特點及使用偏性進行比較分析，揭示其密碼子偏性的影響因素，并分析最優(yōu)密碼子，旨在為美麗梧桐、云南梧桐制定全面的保育策略以及為梧桐科葉綠體基因組學研究提供參考。

1材料與方法

1.1 葉綠體基因序列數據

從NCBI 分別檢索下載美麗梧桐、云南梧桐葉綠體全基因組序列信息，登錄號分別為NC_036395.1（F. pulcherrima 美麗梧桐）、NC_037242.1（F. major 云南梧桐），分別獲得82條和85條編碼基因。對所獲得的編碼基因按以下條件進行篩選：基因長度大于300 bp，以ATG為起始密碼子，以TAA、TAG、TGA為終止密碼子，并剔除重復的編碼基因，最終獲得各52條編碼基因進行后續(xù)分析。

1.2 方法

1.2.1 密碼子相關參數的計算分別利用軟件CodonW（http：//codonw.sourceforge.net/）和CUSP（http：//imed.med.ucm.es/EMBOSS/）分析CDS的有效密碼子數（ENC）、密碼子第3位堿基組成特性，以CT3、CC3、CA3、CG3表示，統(tǒng)計密碼子第1位、第2位、第3位堿基的GC含量及52個基因總GC含量，分別用CGC1、CGC2、CGC3、GC表示。

1.2.2 中性繪圖分析計算各CDS的CGC1、CGC2的平均值，記為CGC12，以此為縱坐標，以CGC3為橫坐標繪制散點圖，分析CGC3與CGC12的相關性，并推測影響密碼子偏性的因素。若CGC3與CGC12呈顯著相關，表明密碼子對堿基使用無差異，突變是密碼子偏性的主要影響因素;若CGC3與CGC12相關性不顯著，且斜率接近0，表明密碼子第1位、第2位堿基與第3位堿基使用存在差異，密碼子偏性與第3位堿基顯著相關，選擇壓力對密碼子偏性的影響較強（尚明照等，2011; 秦政等，2018）。

1.2.3 PR2-plot繪圖分析PR2-plot分析是考察突變和自然選擇對密碼子偏性影響的方法之一（尚明照等，2011;劉慧等，2017）。為避免密碼子第3位堿基上的A/T和G/C突變的不平衡，通過統(tǒng)計兩種梧桐葉綠體52條基因中編碼丙氨酸、甘氨酸、亮氨酸（CTT、CTC、CTA、CTG）、脯氨酸、精氨酸（CGT、CGC、CGA、CGG）、絲氨酸（TCT、TCC、TCA、TCG）、蘇氨酸、纈氨酸的密碼子第3位堿基的T3、C3、A3、G3的組成情況，并以A3/（A3+T3）為縱坐標，以G3/（G3+C3）為橫坐標繪制散點圖。

1.2.4 ENC-plot繪圖分析為進一步了解兩種梧桐堿基組成對密碼子偏性的影響，以兩種梧桐葉綠體中各基因的ENC、GC3值為縱、橫坐標做散點圖，并與ENC期望值（ENC =2+GC3+29/（[GC32+ （1-GC3） 2]） 進行比較，期望值代表密碼子偏性僅受堿基組成的影響。若基因分布于期望值曲線的上方，其密碼子偏性僅受突變影響;若基因分布于曲線下方較遠位置，表明選擇是影響密碼子偏性的主要因素（牛元等，2018）。

1.2.5 相對同義密碼子使用度分析為考察同義密碼子偏好性情況，以相對同義密碼子使用度（RSCU）表示特定密碼子在編碼對應氨基酸的同義密碼子間的相對使用概率（楊國鋒等，2015）。當RSCU>1時，表示該密碼子使用頻率較高，偏好性較強;當RSCU<1時，表示該密碼子使用頻率較低，偏好性較弱;當RSCU=1時，該密碼子無偏好性。

1.2.6 最優(yōu)密碼子分析對CDS的ENC值進行排序，從兩極各選出5個基因作為高、低表達組，分別計算對應的密碼子RSCU值，篩選高低表達組內對應密碼子△RSCU之差大于0.08作為優(yōu)越高表達密碼子，并與整體密碼子RSCU進行結合比較，將△RSCU≥0.08，且整體RSCU>1的密碼子定義為最優(yōu)密碼子（秦政等，2018;石元豹等，2018 ）。

2結果與分析

2.1 密碼子組成分析

通過CodonW和在線CUSP對美麗梧桐、云南梧桐葉綠體編碼基因組的52條CDS進行分析，結果如表1所示，美麗梧桐、云南梧桐葉綠體編碼基因密碼子CT3和CA3的含量分別為46.56%、46.67%與43.04%、43.17%，表明兩種梧桐葉綠體編碼基因第3位堿基以A/T結尾為主。密碼子上不同位置堿基GC含量有所差異，第1位堿基的GC含量最高，分別為46.10%、46.17%;其次為第2位，分別為38.14%、38.06%;最低為第3位堿基，分別為30.11%、29.92%，且兩種梧桐葉綠體基因組GC含量分別為38.12%、38.05%，表明葉綠體編碼基因富含A/T堿基。ENC值可反映密碼子偏性程度，其取值范圍為20～61，ENC值越小表明偏性越強，ENC值越大則密碼子偏性越弱，一般以ENC的值為35時區(qū)分密碼子偏性強弱（Jiang et al.，2008）。本研究中，兩種梧桐葉綠體基因組的ENC值為50左右，大于35表明其密碼子偏性較弱。

利用在線CUSP對各基因密碼子不同位置堿基的GC含量進行分析，結果如表2所示，不同基因的GC含量存在一定的差異，CGC1、CGC2與CCG3差異較大，兩種梧桐葉綠體編碼基因ENC范圍分別為36.91～56.46、36.55～58.04，且大部分基因的ENC大于44，表明葉綠體編碼基因密碼子偏性較弱。美麗梧桐、云南梧桐中atpE基因的ENC值最大，分別為56.46和58.04，說明美麗梧桐中編碼atpE基因密碼子偏性強于云南梧桐，同時兩種梧桐葉綠體編碼基因GC含量、ENC值之間也存在差異，但差異不大。此外，本研究還發(fā)現，美麗梧桐中不存在clpP基因及云南梧桐中的ndhK基因為假基因，表明兩種梧桐葉綠體基因組具有較高的保守性，但種間卻存在一定的差異。

CGC1、CGC2、CCG3、GC、ENC及序列長度（sequence length， SL）相關性分析結果如表3所示，CGC1與CGC2極顯著相關，CGC1、CGC2均與CCG3相關性不顯著，表明兩種梧桐葉綠體CDS密碼子的第1位、第2位堿基組成相似，且與第3位堿基組成存在較大差異，GC與CGC1、CGC2、CCG3均呈極顯著相關，SL與CGC2呈負相關。此外，美麗梧桐的ENC與CCG3呈顯著相關，與CGC1、CGC2、GC、SL均未達到顯著水平，表明美麗梧桐葉綠體編碼基因密碼子第3位堿基組成對密碼子偏性影響較大。云南梧桐中ENC與CCG1、CGC3顯著相關，相關值分別為0.29、0.32，與CGC2、GC、SL相關性較低，表明CCG3對云南梧桐葉綠體密碼子偏性的影響強于CGC1。兩種梧桐密碼子參數的相關性分析結果存在差異，其中 CGC1與云南梧桐葉綠體基因組密碼子偏性顯著相關，而美麗梧桐葉綠體基因組密碼子偏性與CGC1相關不顯著，進一步說明兩種植物葉綠體基因組密碼子偏性的影響因素有所差異。

2.2 中性繪圖分析

如圖1所示，美麗梧桐的葉綠體CDS的CGC3與CGC12含量分布范圍分別為0.223 0～0.370 5、0.329 2～0.568 4，云南梧桐為0.223 0～0.369 7、0.328 8～0.564 8，兩者的分布范圍幾乎重合，說明兩種梧桐葉綠體基因組較為保守。兩種梧桐的CGC3與CGC12的Pearson相關系數分別為0.121和0.206，進一步說明CGC1和CGC2均與CCG3相關性不顯著，密碼子的第1位、第2位堿基與第3位堿基組成存在顯著差異，密碼子偏性與第3位堿基顯著相關。同時，回歸曲線斜率分別為0.195和0.304，表明選擇壓力對兩種梧桐屬葉綠體基因組密碼子偏性的影響較強。此外，突變對密碼子偏性也有一定的影響，且云南梧桐葉綠體密碼子偏性受到突變的影響高于美麗梧桐。

2.3 PR2-plot繪圖分析

PR2-plot繪圖分析是指通過對密碼子第3位堿基組成進行分析，探討突變和自然選擇對密碼子使用偏性的影響，當密碼子第3位堿基表現為A=T和C=G時，表明DNA兩條互補鏈上不存在選擇效應。突變是影響密碼子偏性的唯一因素（Sueoka， 2001;Zhang et al.， 2018）。本研究中，兩種梧桐大部分基因分布在左下方區(qū)域（圖2），T、C堿基頻率高于A、G堿基，說明密碼子第3位堿基偏愛使用嘧啶堿基，表明兩種梧桐葉綠體編碼基因密碼子使用偏性不僅受到突變的影響，而且還受到其他因素的影響，如自然選擇壓力等。

2.4 ENC-plot繪圖分析

從圖3可以看出，兩種梧桐的大部分基因較集中分布于標準曲線的兩側，說明其ENC值與ENC期望值較為接近，而rps8、rps14、rps18、petD、rpl16、psbA基因偏離標準曲線較遠，且ENC值較小，密碼子偏性較強。根據公式（ENC期望-ENC實際）/ENC期望統(tǒng)計基因ENC的分布頻數（表4），結果顯示大部分基因的ENC頻數集中于-0.04～0.10之間，進一步表明大部分基因的ENC值與ENC期望值差異較小，表明這部分基因密碼子偏性主要受到突變的影響。rps8、rps14、rps18、petD、rpl16、psbA分布于0.18～0.33之間，與0點相差較遠，表明這部分基因密碼子偏性主要受到選擇壓力的影響。

2.5 RSCU分析

利用CondonW程序對兩種梧桐葉綠體基因組52個編碼基因進行RSCU分析，結果如表5所示，兩種梧桐的高頻密碼子（RSCU>1）各有29個，除了UUG以外，其余密碼子均以A/U結尾，表明兩種梧桐密碼子偏好使用以A/U結尾的密碼子，且兩種梧桐植物對應密碼子RSCU值極為接近，進一步說明其葉綠體基因組密碼子使用偏性較為接近，葉綠體基因組較為保守，種間差異較小。

2.6 最優(yōu)密碼子分析

對兩種梧桐植物葉綠體基因組基因的ENC值進行排序，選出兩極的10%基因作為高、低表達基因庫，其中兩種梧桐屬葉綠體基因組高表達基因為rps8、rps14、petD、rps18、rpl16，平均ENC值分別為38.41（F. pulcherrima）、38.02（F. major）;F. pulcherrima低表達基因為ycf2、petA、 ycf3、ndhJ、atpE，圖 3ENC-plot繪圖分析

Fig. 3Analysis of ENC-plot （ENC value against CGC3）而F. major為ycf2、clpP、petA、ycf3、ndhJ、atpE，平均ENC值分別為55.21（F. pulcherrima）、55.24（F. major）。分別計算高、低表達基因庫的RSCU值，并計算對應密碼子的△RSCU值（高表達庫RSCU值-低表達庫RSCU值），同時與整體密碼子的RSCU值結合比較，篩選出△RSCU值≥0.08，且整體RSCU>1的密碼子，定義為優(yōu)越密碼子。最終分別確定了17、18個表達優(yōu)越密碼子（表4），分別為GCA、UGU、GAA、UUU、GGA、GGU、CAU、AUU、AAA、UUA、CAA、CGA、CGU、AGU、ACA、ACU（為F. major優(yōu)越密碼子）、GUA、UAU，這些優(yōu)越密碼子均以A/U結尾。此外， 我們觀察到兩種梧桐植物葉綠體基因組使用的優(yōu)越密碼子基本相同，但其△RSCU值存在一定的差異，F. pulcherrima 中的GAA、 CGA密碼子△RSCU>0.08且<0.30， 而F.

3討論與結論

密碼子是遺傳信息的基本單位，是核酸與蛋白質的聯系紐帶，研究其使用情況對了解物種基因組進化具有重要意義（李平等，2011）。密碼子使用偏性是物種不斷進化適應的結果，其形成機制受多種因素的影響，其中突變作用和自然選擇壓力是其重要影響因素（王鵬良等， 2018）。不同物種、基因家族中密碼子使用偏性存在一定的差異，因此密碼子使用偏性是研究物種基因組進化關系及影響的重要指標之一。

堿基組成差異對密碼子的使用有重要的影響。密碼子在第1位、第2位堿基上的突變通常會導致編碼氨基酸的改變，第3位堿基存在簡并性，其突變對編碼氨基酸的改變通常無影響（尚明照等，2011）。因此，密碼子第3位堿基的使用模式與密碼子偏性密切相關。有研究表明，植物葉綠體基因組中密碼子第3位堿基偏好使用A/T（Zhou et al.， 2008;秦政等，2018 ）。本研究中，兩種梧桐植物CT3和CA3高于CG3、CC3，且CGC1、CGC2均與CCG3相關性不顯著，CCG3比例最低，說明梧桐屬植物葉綠體基因組密碼子偏好使用A/T堿基結尾，與大花香水月季（Rosa odorata var. gigantea）、表 5兩種梧桐密碼子RSCU及最優(yōu)密碼子樟樹（Cinnamomum camphora）、甜蕎（Fagopyrum esculentum） （羅洪等，2015;牛元等，2018;秦政等，2018）等植物的研究結果一致。

自然選擇和突變是影響密碼子使用偏性的重要因素（Sharp et al.，2010;Rao et al.，2011）。本研究通過對兩種梧桐葉綠體基因組52個編碼基因CGC3與CGC12相關分析表明，密碼子第3位堿基GC含量與第1位、第2位堿基相關性弱，且線性回歸斜率較小，表明兩種梧桐密碼子的使用受到選擇壓力因素較強。此外，PR2-plot分析發(fā)現，密碼子第3位堿基上A/T堿基和C/G堿基使用頻率存在差異，更偏好使用T、C堿基，進一步表明兩種梧桐葉綠體基因組密碼子使用不僅與堿基突變的有關，而且還更多受到選擇的影響。ENC-plot分析顯示：大部分基因的ENC值與期望ENC值較為接近，其分布頻數集中于-0.04～0.10之間，表明這部分基因受密碼子偏性與第3位堿基的GC含量相關，突變是主要影響因素;而rps8、rps14、rps18、petD、rpl16、psbA分布于標準曲線的下方較遠位置，自然選擇影響其密碼子偏性的主要因素。綜合中性繪圖分析、ENC-plot、PR2-plot等分析發(fā)現，突變和自然選擇等多重因素共同影響著兩種梧桐葉綠體密碼子使用偏性。這與柿屬植物、普通油茶、苦蕎、甜蕎等物種的葉綠體基因組密碼子偏性研究結果相似（羅洪等，2015;胡莎莎等，2016;傅建敏等，2017;王鵬良等，2018）。

本研究發(fā)現，兩種梧桐中29個高頻密碼子（RSCU>1）第3位堿基主要以A/U結尾，與前人在其他植物中的研究結果相似（尚明照等，2011;秦政等，2018）。與高表達密碼子進行綜合分析，最終確定美麗梧桐的最優(yōu)密碼子為17個，云南梧桐18個，分別為GCA、UGU、GAA、UUU、GGA、GGU、CAU、AUU、AAA、UUA、CAA、CGA、CGU、AGU、ACA、ACU（為F. major優(yōu)越密碼子）、GUA、UAU，這些最優(yōu)密碼子以A/U結尾，與大多植物葉綠體基因組最優(yōu)密碼子相似，表明梧桐與其他雙子葉植物葉綠體基因組密碼子第3位堿基偏愛使用A/U結尾（Kawabe & Miyashita， 2003）。有研究表明，物種間的親緣關系越近，其密碼子使用模式越相似（張?zhí)龋?017;張孟偉等，2018）。本研究中，兩種梧桐葉綠體基因組密碼子使用偏性極為相似，但存在一定的差異。此外，本研究還發(fā)現，美麗梧桐中葉綠體clpP編碼基因丟失，云南梧桐的ndhK為假基因，推測兩種梧桐適應環(huán)境改變的進化趨勢有所不同，有待深入研究。

本研究分析了美麗梧桐、云南梧桐葉綠體基因組編碼基因的密碼子偏性形成的影響因素和特點，以及兩種梧桐葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子，為外源基因密碼子改造及梧桐屬葉綠體基因組進化機制研究提供一定的理論基礎。

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（責任編輯 蔣巧媛）