轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4在先天性心臟病產(chǎn)前診斷中的研究

江敏　梁燕華　林麗虹

【摘要】 目的 研究轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4在先天性心臟?。–HD）產(chǎn)前診斷中的臨床價值。方法 50例超聲心動圖確診胎兒為先天性心臟病的孕婦， 抽取孕婦羊水、臍血或引產(chǎn)胎兒臍血， 采用多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)（MLPA）檢測， 分析其染色體核型、 MLPA檢測結(jié)果。結(jié)果 50例先天性心臟病胎兒中6例染色體核型分析異常， 其中3例為21-三體綜合征， 2例為18-部分三體綜合征， 1例為46， XX，der（6） （q16q22）;剩余44例先天性心臟病胎兒染色體核型分析結(jié)果正常。50例先天性心臟病胎兒進(jìn)行Nkx2.5、GATA4基因的突變篩查， 結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何突變。1例先天性心臟病患兒通過染色體微陣列分析（CMA）在染色體8p23.2位置檢出一段約859 kb的拷貝數(shù)變異（CNV）， 涉及OMIM基因CSMD1等， 可能為多態(tài)改變。結(jié)論 先天性心臟病胎兒不存在Nkx2.5、GATA4基因異常， 這可能一方面是由于所選樣本量過小， 有待于擴(kuò)大樣本量， 以便進(jìn)行更廣泛的篩查;另一方面也可能因?yàn)槲覈蛧獾娜朔N差異， 因此需進(jìn)一步擴(kuò)大先天性心臟病的樣本數(shù)量進(jìn)行更深入的研究， 以進(jìn)一步揭示先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】 先天性心臟病;Nkx2.5;GATA4;產(chǎn)前診斷

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.04.091

先天性心臟病（congenital heart disease， CHD）近十年是我國出生缺陷的首位， 發(fā)病率在活產(chǎn)嬰兒占8‰～12‰。我國每年大約10萬～20萬先天性心臟病新生兒出生， 廣東省每年新增先天性心臟病新生兒至少7000例， 是我國城市0～5歲嬰幼兒死亡的首要原因[1-3]。其遺傳學(xué)病因有染色體病、單基因病、多基因病、線粒體病等。先天性心臟病的發(fā)病率占新生兒的0.4%～5.0%， 病因迄今仍不清楚。但研究認(rèn)為， 先天性心臟病是由遺傳因素和環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致心臟血管發(fā)育異常所引起的， 遺傳度為55%～65%， 并證實(shí)多種轉(zhuǎn)錄因子與心臟發(fā)育緊密相關(guān)， 包括GATA4、Nkx2.5、TBX5、AP2b等[4， 5]。本研究從分子水平觀察了先天性心臟病患者的Nkx2.5、GATA4基因突變情況， 初步探討兩種轉(zhuǎn)錄因子與先天性心臟病發(fā)病的關(guān)系， 為先天性心臟病的產(chǎn)前診斷和基因治療提供依據(jù)?，F(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月～2017年12月本院超聲心動圖確診胎兒為先天性心臟病的孕婦50例， 包括心臟擴(kuò)大、室間隔缺損（VSD）、房間隔缺損（ASD）、單心房、法洛四聯(lián)癥（TOF）、心內(nèi)膜墊缺損、右心室雙出口、永存動脈干、大動脈轉(zhuǎn)位、主動脈弓狹窄、肺動脈狹窄、主肺動脈窗等， 經(jīng)過遺傳咨詢自愿行介入性產(chǎn)前診斷。孕婦年齡20～44歲， 平均年齡（26.5±2.8）歲;孕周20+4～33周， 平均孕周（26.5±2.2）周。所有孕婦均簽署產(chǎn)前診斷知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 標(biāo)本提取 經(jīng)知情同意抽取孕婦的羊水或臍帶血。妊娠18～24周孕婦：B超引導(dǎo)下經(jīng)腹壁行羊膜穿刺抽取18～22 ml羊水， 使用2個無菌刻度離心管分裝， 離心后棄上清， 每管留下約2 ml的細(xì)胞懸液， 加入培養(yǎng)基7 ml， 使用2個細(xì)胞培養(yǎng)瓶分別接種， 置恒溫37℃， 5%CO2培養(yǎng)箱中， 培養(yǎng)9～10 d后換液， 細(xì)胞生長情況需要每天觀察， 貼壁細(xì)胞生長旺盛時可作為收獲節(jié)點(diǎn)， 出現(xiàn)較多透明圓形細(xì)胞時為明顯標(biāo)志， 常規(guī)制片、G顯帶。妊娠25～37周孕婦：B超引導(dǎo)下經(jīng)腹壁行臍血細(xì)胞穿刺術(shù)， 循常規(guī)操作染色體制片， 在1640培養(yǎng)基中注入1 ml肝素鈉抗凝的血標(biāo)本以行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)， 大約60～75 h后即可收獲， 取常規(guī)G顯帶（400條帶）制成所需染色體片。每例計數(shù)35個以上核型， 并對5～7個核型進(jìn)行分析， 發(fā)現(xiàn)異常者可增加至17個核型分析。

1.2.2 DNA提取方法 ①羊水DNA提?。喝? ml羊水， 3000 r/min離心10 min， 棄上清， 用1 ml生理鹽水漂洗2次， 12000 r/min離心5 min， 棄上清。根據(jù)基因組DNA提取試劑盒說明書抽提羊水基因組DNA， 并計算DNA的濃度。②臍帶血DNA提?。喝√耗殠а?～2 ml（EDTA抗凝）， 全基因組DNA可采用酚-氯仿法提取， DNA在260 nm和280 nm處的吸光值需用分光光度計法測定并提取， 從而得出濃度及純度值， 并用TE溶液稀釋終濃度至50 ng/?l。

1.2.3 MLPA檢測方法 采用荷蘭MRC-Holland公司生產(chǎn)的P311試劑盒， 包含了檢測GATA4所有7個外顯子及GATA4基因上下游序列、Nkx2.5基因所有2個外顯子的探針。按MLPA試劑盒所提供的操作流程進(jìn)行探針的雜交和擴(kuò)增。檢測擴(kuò)增產(chǎn)物需在ABI3500遺傳分析儀（Applied Biosystems）上進(jìn)行， 并通過Genemapper3.7獲取結(jié)果， 最后通過Coffalyser v9.4（MRC-Holland）進(jìn)行分析得出基因相對拷貝數(shù)比值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 所得結(jié)果通過GenemarkerV 1.80 軟件進(jìn)行定量分析， 將獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物峰的峰面積進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化， 并得到反映樣本DNA片段擴(kuò)增數(shù)目變化的比值， 以便于分析DNA片段變化的情況。

2 結(jié)果

2.1 染色體核型結(jié)果 50例先天性心臟病胎兒中6例染色體核型分析異常， 其中3例為21-三體綜合征， 2例為18-部分三體綜合征， 1例為46， XX， der（6） （q16q22）;剩余44例先天性心臟病胎兒染色體核型分析結(jié)果正常。

2.2 MLPA結(jié)果 50例先天性心臟病胎兒進(jìn)行Nkx2.5、GATA4基因的突變篩查， 結(jié)果未發(fā)現(xiàn)任何突變。1例先天性心臟病患兒通過染色體微陣列分析（chromosome microarray analysis， CMA）在染色體8p23.2位置檢出一段約859 kb的拷貝數(shù)變異， 涉及OMIM基因CSMD1等， 可能為多態(tài)改變。

3 討論

先天性心臟病簡稱先心病， 是胎兒期心血管發(fā)育異常引起的血管畸形， 也是最為常見的血管畸形之一， 其發(fā)病率占出生活產(chǎn)嬰兒的比例很高， 是新生兒致死致殘的一個主要原因。先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜， 臨床表現(xiàn)明顯不同， 可能與遺傳、宮內(nèi)感染、大劑量放射性物質(zhì)接觸和藥物等因素有關(guān)[6]。一些患兒癥狀明顯， 一般在 0～15 歲的幼兒期即可發(fā)現(xiàn);一些患兒可能無明顯癥狀， 直至出現(xiàn)癥狀時才發(fā)現(xiàn)其患有先天性心臟病。根據(jù)先天性心臟病的嚴(yán)重程度， 外科修補(bǔ)或內(nèi)科封堵手術(shù)都能有效的控制先天性心臟病。由于遺傳基因突變導(dǎo)致的先天性心臟病， 即使做了心臟修補(bǔ)手術(shù)也可能出現(xiàn)一些其他的并發(fā)癥， 如心律失常、心內(nèi)膜炎和心力衰竭， 因此還需要注意觀察， 有可能還需要額外的外科手術(shù)。值得一提的是， 先天性心臟病中的心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)異常是可以伴隨患者終生的十分危險的致死病因， 且癥狀會隨著年齡增加而呈現(xiàn)逐漸加重的趨勢。因此， 對先天性心臟病患者進(jìn)行遺傳基因檢測， 找出致病基因， 對患者術(shù)后的生活質(zhì)量和生存率都至關(guān)重要。近期心臟發(fā)育中的一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控回路的研究也發(fā)現(xiàn)心臟轉(zhuǎn)錄因子在先天性心臟病發(fā)生發(fā)展中也起著重要作用， 如轉(zhuǎn)錄因子 Nkx2.5、GATA4 和 TBX5 在心臟的早期發(fā)育中就都起著重要作用[7， 8]。因此， 本文旨在討論心臟轉(zhuǎn)錄因子 Nkx2.5和GATA4在早期產(chǎn)前診斷中對心臟產(chǎn)生的重要作用及其突變導(dǎo)致的先天性心臟病表型， 并討論其導(dǎo)致先天性心臟病的可能機(jī)制。

人類在胚胎期的心血管系統(tǒng)是在第3周開始發(fā)育的， 直到第8周結(jié)束。心臟發(fā)育起始于前面?zhèn)劝逯信邔觾?nèi)心臟祖細(xì)胞的分化。心臟的胚胎發(fā)育可分為分段發(fā)育、融合連接、扭曲旋轉(zhuǎn)和順序分隔4步。人類胚胎發(fā)育到第16～17天， 血管母細(xì)胞增殖形成鼓勵的內(nèi)皮細(xì)胞團(tuán);到第18～19天， 生心板形成;胚胎發(fā)育到第23天， 單個心管形成， 開始低效率的收縮;第26天， 單個心房心臟形成;第29天， 開始發(fā)育成兩個心房;第30天血液循環(huán)系統(tǒng)開始運(yùn)行， 第49天心臟四個腔室基本形成， 但要到出生才會發(fā)育為成熟的心臟。其中主要的發(fā)育包括心管的形成、心臟的扭轉(zhuǎn)、心臟的環(huán)化、房室分隔、傳導(dǎo)系統(tǒng)和血管的發(fā)育以及流出通道的形成。

研究表明[9]， Nkx2.5是心臟前體細(xì)胞分化的最早期標(biāo)志之一， 參與心臟前體細(xì)胞分化、房室分隔、房室流出道的形成和傳導(dǎo)系統(tǒng)的成熟;在發(fā)育成熟的心臟中， Nkx2.5表達(dá)局限在房室肌細(xì)胞中， 但對成熟心臟發(fā)揮正常功能卻不可缺少。人類Nkx2.5基因定位于染色體5q34上， 有2個外顯子， 編碼324個氨基酸， 在進(jìn)化上高度保守。其突變與多種先天性心臟病的形成有關(guān)， 如房間隔缺損、室間隔缺損、法洛四聯(lián)癥和伴有傳導(dǎo)系統(tǒng)病變的三尖瓣下移畸形。有研究表明[10]， 幾乎所有類型的先天性心臟病都存在Nkx2.5基因的突變， 國外已經(jīng)發(fā)現(xiàn)41種突變報道， 其中33種單核苷酸置換， 6種核苷酸缺失， 2種核苷酸插入。McElhinney等[11] 報道NK2.5基因外顯子1的突變存在于各種先天性心臟病中， 但國內(nèi)卻少有發(fā)現(xiàn)報道。2005年， 石琳等[12]對包括室間隔缺損、法樂四聯(lián)癥、房間隔缺損、完全性肺靜脈畸形引流、完全性大動脈轉(zhuǎn)位在內(nèi)的110例中國先天性心臟病患兒及110例正常對照者的NK2.5基因外顯子1及其側(cè)翼進(jìn)行突變檢測， 結(jié)果任何突變位點(diǎn)都未被發(fā)現(xiàn)， 但是發(fā)現(xiàn)了1個新的SNP位點(diǎn)63A>G（rs2277923）。對其基因型和等位基因頻率變化的分析發(fā)現(xiàn)， 對照組和病例組都顯示G基因型高于基因庫中所標(biāo)示的基因型A， 對照組中G基因型達(dá)到了62%， 而病例組中的室間隔缺損和法樂四聯(lián)癥組中G基因型則均達(dá)到了87%， 該SNP在兩組病例與對照組之間明顯存在著顯著的相關(guān)性。韓增強(qiáng)等[13]對81例單純性先天性心臟病患者的研究發(fā)現(xiàn)， Nkx2.5基因突變與我國單純性先天性心臟病之間無明顯相關(guān)。國內(nèi)簡永遠(yuǎn)等[14]對30名廣西壯族ASD患者及30例廣西壯族對照病例進(jìn)行Nkx2.5基因的突變篩查中， 結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)任何突變。關(guān)于散發(fā)先天性心臟病人群的突變研究， 張為民等[15]篩查了120例維吾爾族ASD患者， 也并未檢測出任何Nkx2.5基因突變。

GATA4基因定位于8p23.1-p22， 是心臟發(fā)生調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中重要的蛋白， 是在心臟早期發(fā)育中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子之一， 并且相互作用于其他轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子， 是心臟細(xì)胞胚胎發(fā)育過程中的早期標(biāo)志， 并調(diào)控心肌細(xì)胞的分化增生及心臟的形態(tài)發(fā)生過程[16-18]。首先在心前期中胚層表達(dá)， 隨后在心內(nèi)膜與心肌中表達(dá)， 并參與調(diào)節(jié)表達(dá)心臟結(jié)構(gòu)基因， 主要包括心臟肌球蛋A重鏈-α（α-Myhc）、心肌鈣蛋白C、心房利鈉肽因子（ANF）等， 也通過其鋅指結(jié)構(gòu)與其他心臟特異性的轉(zhuǎn)錄因子（如Nkx2.5、TBX5等）相互作用共同發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[19-21]。該基因單個或多個突變及異常表達(dá)均會導(dǎo)致心臟結(jié)構(gòu)畸形， 如室間隔缺損、房間隔缺損、房室間隔缺損、心內(nèi)膜墊缺失、右心室雙流出道、左心發(fā)育不全綜合征、肺動脈縮窄、動脈導(dǎo)管未閉等。自2003年Garg等首次證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子GATA4突變是導(dǎo)致人類先天性心臟病的致病原因之一。隨后有多個研究報道GATA4突變與人類先天性心臟病相關(guān)[17， 18， 20]。汪希珂等[16]對198例先天性心臟病患者研究發(fā)現(xiàn)2例GATA4位點(diǎn)雜合突變。

本研究未發(fā)現(xiàn)先天性心臟病胎兒存在Nkx2.5、GATA4基因異常， 這可能一方面是由于所選樣本量過小， 因此有待于擴(kuò)大樣本量， 以便進(jìn)行更廣泛的篩查;另一方面也可能因?yàn)槲覈蛧獾娜朔N差異。同種疾病可能有不同類型的基因突變， 即由遺傳的異質(zhì)性決定， 可能Nkx2.5、GATA4基因并非是我國先天性心臟病的主效基因。同時進(jìn)一步提示先天性心臟病有著復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制， 并提示可能的多基因相互作用、可能的環(huán)境一遺傳因素的相互作用， 需進(jìn)一步擴(kuò)大先天性心臟病的樣本數(shù)量進(jìn)行更深入的研究， 以進(jìn)一步揭示先天性心臟病的發(fā)病機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

[1] 賈安琪， 邱海燕， 吳軍華， 等. 新生兒危重先天性心臟病篩查研究進(jìn)展. 臨床薈萃， 2017， 32（1）：89-92.

[2] 黃國英. 我國開展新生兒先天性心臟病篩查的重要性. 中華兒科雜志， 2017， 55（4）：241-243.

[3] 徐金玉. 先天性心臟病發(fā)病機(jī)制中遺傳因素的研究進(jìn)展. 中華婦幼臨床醫(yī)學(xué)雜志（電子版）， 2017， 13（5）：611-615.

[4] 孫慧超， 田杰. 先天性心臟病遺傳機(jī)制研究進(jìn)展. 中華實(shí)用兒科臨床雜志， 2019， 34（13）：970-975.

[5] 朱耀斌， 李志強(qiáng)， 丁楠， 等. 先天性心臟病患兒術(shù)后心臟康復(fù)研究進(jìn)展. 中華實(shí)用診斷與治療雜志， 2019（4）：410-413.

[6] 蘇晗， 朱華， 朱華， 等. GATA家族基因突變與先天性心臟病的研究進(jìn)展. 國際兒科學(xué)雜志， 2019， 46（3）：194.

[7] 許展毓， 馮旭， 鄭寶石， 等. 先天性心臟病與同源蛋白NKX2.5基因突變的關(guān)系. 中華實(shí)驗(yàn)外科雜志， 2018， 35（1）：149-151.

[8] 陳樂陶， 楊土保， 王婷婷， 等. 中國人群心臟轉(zhuǎn)錄因子的單核苷酸多態(tài)性與先天性心臟病關(guān)系的Meta分析. 中國當(dāng)代兒科雜志， 2018， 20（6）：63-69.

[9] 王佼， 朱善良， 楊世偉， 等. NKX2.5、GATA4、TBX5基因突變與散發(fā)性先天性心臟病的相關(guān)性研究. 中國循環(huán)雜志， 2014（z1）：33-34.

[10] 黃雄， 仇小強(qiáng)， 曾小云， 等. Nkx2.5、GATA4和TBX5基因多態(tài)性與廣西壯族、漢族兒童室間隔缺損的關(guān)系研究. 中國婦幼保健， 2016（31）：2513.

[11] McElhinney DB， Geigere， E， Blingder J， et al. Nkx2.5 mutations in patients with congenital heart disease. J Am Coll cardiol， 2003（42）：1650-1655.

[12] 石琳， 申阿東， 李曉峰， 等. 中國先天性心臟病NK2. 5基因突變篩查及關(guān)聯(lián)研究. 首都醫(yī)科大學(xué)學(xué)報， 2005， 26（5）：525-528.

[13] 韓增強(qiáng)， 唐胤， 陳彧， 等. 81例單純性先天性心臟病患者Nkx2.5基因突變篩查及關(guān)聯(lián)研究. 中國循環(huán)雜志， 2011， 26（6）：461-464.

[14] 簡永遠(yuǎn)， 許展毓， 馮旭， 等. Nkx2.5基因突變與廣西壯族人群先天性房間隔缺損的關(guān)系研究. 微創(chuàng)醫(yī)學(xué)， 2018， 13（4）;417-419.

[15] 張為民， 拜合提亞爾·克然木， 阿不都沙拉木·吐爾遜， 等. 新疆維吾爾族房間隔缺損患者Nkx2.5基因突變研究. 中國優(yōu)生與遺傳雜志， 2016（12）：13-16.

[16] 汪希珂， 王予川， 吳悅， 等. 轉(zhuǎn)錄因子GATA-4， -5， -6在中國人群先天性心臟病患兒中的突變篩查. 中華實(shí)用兒科臨床雜志，?2016， 31（1）：55-58.

[17] 劉漢婕， 李霞， 梁亞男， 等. 心臟發(fā)育中重要轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA-4和Tbx5與先天性心臟病的致病性. 國際遺傳學(xué)雜志， 2018， 41（5）：403-413.

[18] 李開如. 先天性心臟病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5、GATA4的初步研究. 東南大學(xué)， 2009.

[19] 許耘紅， 何穗镕， 李麗青. 心肌轉(zhuǎn)錄因子和鋅指轉(zhuǎn)錄因子在先天性心臟病中的相互作用. 中國臨床藥理學(xué)雜志， 2017（18）：1773-1775.

[20] 孫穎. 心臟發(fā)育相關(guān)基因Nkx2.5和GATA4突變與先天性心臟病的研究. 蘇州大學(xué)， 2010.

[21] 方翔， 丁建東. 轉(zhuǎn)錄因子Nkx2.5和GATA-4在心臟發(fā)育中的作用. 醫(yī)學(xué)綜述， 2009， 15（22）：3366-3369.

[收稿日期：2019-12-10]