溫度和pH值條件對(duì)白魚(yú)內(nèi)源性蛋白酶活性的影響

劉小莉　王榮　王帆　崔晉　周劍忠

摘要：研究不同溫度和pH值條件對(duì)白魚(yú)內(nèi)源性蛋白酶活性及其降解肌原纖維蛋白的影響。結(jié)果表明，鈣蛋白酶殘余活性在不同溫度和pH值條件下差異較大，在溫度為4、10、20、37 ℃條件下放置20 h后殘余活性分別為94.5%、63.2%、43.9%、47.1%;在pH值為4.50、5.00、5.50、6.89條件下放置20 h后殘余活性分別為94.62%、77.86%、31.36%、60.04%。在不同溫度和pH值條件下組織蛋白酶D變化幅度次于鈣蛋白酶，而組織蛋白酶B、L殘余活性的差異不大。SDS-PAGE結(jié)果顯示，隨著溫度的升高，白魚(yú)肌肉肌球蛋白重鏈降解程度增加，而在pH值為5.00、5.50條件下肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白的降解均很明顯。綜合考慮生產(chǎn)實(shí)際，最佳操作環(huán)境溫度為10～20 ℃、腌制液pH值為4.5。

關(guān)鍵詞：白魚(yú);溫度;pH值;內(nèi)源酶;肌原纖維蛋白

中圖分類(lèi)號(hào)： TS254.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）02-0188-04

收稿日期：2018-10-10

作者簡(jiǎn)介：劉小莉（1981—），女，江蘇泰興人，博士，研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。E-mail：liuxljaas@hotmail.com。

通信作者：周劍忠，博士，研究員，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品加工。E-mail：zjzluck@126.com。

白魚(yú)（Culter alburnus）學(xué)名翹嘴紅鲌，別稱(chēng)翹白、白條等，隸屬鯉科鲌亞科紅鲌屬[1]，肉質(zhì)鮮嫩美味而不腥，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，為魚(yú)中上品，是我國(guó)南北水域常見(jiàn)的淡水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。白魚(yú)肉質(zhì)非常細(xì)嫩[2]，保鮮儲(chǔ)運(yùn)比較困難，因此白魚(yú)的加工對(duì)擴(kuò)大其消費(fèi)市場(chǎng)尤為重要。

淡水魚(yú)肌肉中水分含量高，蛋白豐富，宰殺僵直后魚(yú)肉新鮮度下降與很多復(fù)雜的因素有關(guān)，除了微生物引起的腐敗，還與其他生化、物理、結(jié)構(gòu)方面的改變有關(guān)[3]。在加工初期或冰藏過(guò)程中通常發(fā)生由內(nèi)源性蛋白酶催化的肌原纖維蛋白降解，導(dǎo)致肌肉軟化、品質(zhì)劣變等。肌原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)中重要結(jié)構(gòu)蛋白的水解以及肋節(jié)和中間絲蛋白的水解，都與組織軟化有關(guān)[4]。通常認(rèn)為，降解肌原纖維等蛋白的系統(tǒng)是鈣激活蛋白酶-鈣蛋白酶抑制蛋白系統(tǒng)和溶酶體組織蛋白酶-胱蛋白抑制系統(tǒng)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，肌肉組織蛋白降解過(guò)程中起主要作用的酶包括鈣蛋白酶和組織蛋白酶B、L、D，它們可誘導(dǎo)宰后機(jī)體肌原纖維蛋白發(fā)生變化，對(duì)結(jié)構(gòu)軟化和生物活性肽釋放具有很大的影響[6]。一般認(rèn)為，鈣蛋白酶主要在宰后儲(chǔ)藏的早期造成有限的肌原纖維蛋白降解，而組織蛋白酶具有在后期降解肌動(dòng)蛋白和肌漿球蛋白的能力。本研究以太湖白魚(yú)為研究對(duì)象，考察加工過(guò)程中不同操作環(huán)境溫度和腌制液pH值條件對(duì)白魚(yú)肌肉中內(nèi)源酶活性及其肌原纖維蛋白降解的影響，以期為白魚(yú)的加工研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

主要材料為鮮活白魚(yú)，購(gòu)于江蘇省南京市玄武區(qū)集貿(mào)市場(chǎng)，平均質(zhì)量為（500±50） g/條。

主要試劑為酶活性檢測(cè)試劑盒（Biovision，USA，鈣蛋白酶、組織蛋白酶B、組織蛋白酶D、組織蛋白酶L測(cè)定試劑盒貨號(hào)分別為K240-100、K140-100、K143-100、K142-100），其他試劑均為分析純，購(gòu)于上?；瘜W(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

主要設(shè)備有T25高速勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司）、infinite M200 PRO酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）、SDS-PAGE電泳儀（BIO-RAD公司）、離心機(jī)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）、全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）、pH值計(jì)[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]、低溫恒溫水浴鍋（南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理 參照Nie等的方法[7]對(duì)白魚(yú)肌肉中內(nèi)源酶及肌原纖維蛋白進(jìn)行提?。嘿?gòu)買(mǎi)鮮活白魚(yú)，30 min內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室宰殺，去頭尾、皮、大刺后，取背部肌肉20 g置于50 mL離心管中，加220 mL經(jīng)4 ℃預(yù)冷的去離子水，12 000 r/min勻漿30 s，靜置30 min后，在10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，留上清。向沉淀中再加入20 mL水，重復(fù)提取1次，合并2次上清，得到肌漿蛋白提取液，即內(nèi)源酶粗酶液。

向上述所得沉淀中加入20 mL 4 ℃預(yù)冷的 0.05 mmol/L 磷酸緩沖液（pH值=7.2）（向其中補(bǔ)充 0.6 mol/L NaCl），12 000 r/min 勻漿30 s，在 10 000 r/min、4 ℃下離心10 min，收集上清液。沉淀用上述步驟再重復(fù)提取1次，合并上清即為肌原纖維蛋白提取液。

1.3.2 不同處理對(duì)內(nèi)源酶活性的影響

1.3.2.1 溫度對(duì)內(nèi)源酶活性的影響 取10 mL內(nèi)源酶粗酶液置于試管中，分別在4、10、20、37 ℃條件下進(jìn)行水浴，分別于水浴0、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 h時(shí)取樣，測(cè)定酶活性;

1.3.2.2 pH值對(duì)內(nèi)源酶活性的影響 采用乙酸調(diào)節(jié)內(nèi)源酶粗酶液pH值至4.5、5.0、5.5，另外以不調(diào)節(jié)pH值（6、8P）的樣品作為對(duì)照，在37 ℃條件下進(jìn)行水浴，分別于水浴0、0.5、1.0、2.0、4.0、10.0、20.0 h取樣，測(cè)定酶活性;

1.3.3 肌原纖維蛋白的降解 采用“1.3.2”節(jié)中不同溫度和pH值處理后的肌漿蛋白提取液，與肌原纖維蛋白提取液按體積比1 ∶1進(jìn)行混合，37 ℃水浴2 h后進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis，簡(jiǎn)稱(chēng)SDS-PAGE），采用考馬斯亮藍(lán)R-250染色2 h后，用脫色液脫色過(guò)夜，觀察成像。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)肌原纖維蛋白降解及蛋白酶活性的影響

2.1.1 溫度對(duì)內(nèi)源酶殘余酶活性的影響 由圖1可知，與其他組織蛋白酶相比，鈣蛋白酶殘余活性受溫度影響最大，在溫度為4 ℃下存放初期（0.5 h內(nèi)）殘余活性有上升趨勢(shì)，其他溫度條件下殘余活性均總體呈下降趨勢(shì)，20 h后，4、10、20、37 ℃條件下鈣蛋白酶殘余活性分別為94.5%、63.2%、43.9%、47.1%。在4、10、20、37 ℃條件下，組織蛋白酶D活性變化幅度次于鈣蛋白酶，處理20 h后殘

余酶活性分別為72.6%、60.5%、55.3%、50.1%，而組織蛋白酶B、L殘余活性的差異不大，處理20 h后活性范圍分別為45.0～52.0%、49.0～55.0%。4 ℃低溫加工條件可以明顯抑制酶活性，當(dāng)恢復(fù)到最適測(cè)定溫度條件時(shí)測(cè)得的殘余酶活性反而較其他溫度條件下的殘余酶活性明顯增大。組織蛋白酶L也呈現(xiàn)類(lèi)似的趨勢(shì)。

2.1.2 溫度對(duì)肌原纖維蛋白降解作用的電泳圖譜 由圖2可知，隨著溫度升高，肌動(dòng)蛋白沒(méi)有發(fā)生明顯變化，但在37 ℃時(shí)，肌球蛋白重鏈逐漸模糊，說(shuō)明肌原纖維蛋白開(kāi)始降解。在4、10 ℃條件下肌原纖維蛋白未見(jiàn)明顯的降解，說(shuō)明低溫加工條件能有效抑制內(nèi)源酶對(duì)肌原纖維蛋白的降解作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了圖1中4種酶的殘余活性結(jié)果。溫度越低，對(duì)白魚(yú)肌肉中內(nèi)源酶活性的抑制效果越好，但考慮到生產(chǎn)實(shí)際條件，4～10 ℃的操作環(huán)境溫度不易實(shí)現(xiàn)，因此選擇10～20 ℃ 為最佳操作溫度范圍。

2.2 pH值對(duì)肌原纖維蛋白降解及蛋白酶活性的影響

2.2.1 pH值對(duì)內(nèi)源酶殘余酶活性的影響 由圖3可知，不同酶受pH值影響的變化趨勢(shì)與溫度類(lèi)似，不同pH值條件下鈣蛋白酶殘余酶活性差異最大，在pH值為4.50、5.00、5.50、6.89條件下處理20 h后殘余酶活性分別為94.62%、77.86%、31.36%、60.04%;其次是組織蛋白酶D，而組織蛋白酶B、L差異較小。鈣蛋白酶最適pH值為6.9～7.5，組織蛋白酶B、L屬于半胱氨酸蛋白酶，大多半胱氨酸蛋白酶的最適pH值為7.0～8.0[8]，而組織蛋白酶D是一種天冬氨酸蛋白酶，其最適pH值在5.0以下[9-10]。未經(jīng)過(guò)pH值調(diào)節(jié)的對(duì)照組pH值為6.89，在自然pH值條件下各種蛋白酶的活性下降相對(duì)較快。處理20 h后，B、D、L的殘余活性在pH值為5.50、4.50、6.89、5.50條件下鈣蛋白酶與組織蛋白酶最低。

2.2.2 pH值對(duì)肌原纖維蛋白降解作用的電泳圖譜 由圖4可知，在pH值為5.00、5.50條件下，肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白的降解均很明顯，結(jié)合殘余酶活性測(cè)定結(jié)果可以推斷組織蛋白酶D可能是引起肌原纖維蛋白降解的主要原因。在以往的研究報(bào)道中，對(duì)肌原纖維蛋白降解具有影響的蛋白酶種類(lèi)各不相同。李樹(shù)紅等研究了漂洗后鰱魚(yú)魚(yú)糜中組織蛋白酶的殘留情況，認(rèn)為溶酶體半胱氨酸組織蛋白酶在鰱魚(yú)魚(yú)糜凝膠軟化中起一定作用，其中組織蛋白酶L可能是重要的蛋白水解酶[11]。鐘嬋等研究發(fā)現(xiàn)，組織蛋白酶B參與藍(lán)圓鲹肌原纖維蛋白的降解，更可能參與在低pH值條件下魚(yú)糜凝膠劣化[12]。

3 結(jié)論

在不同溫度和pH值條件下對(duì)白魚(yú)內(nèi)源性蛋白酶殘余活性及其對(duì)肌原纖維蛋白降解的情況進(jìn)行研究，結(jié)果表明，低溫和低pH值加工條件可以明顯抑制內(nèi)源性蛋白酶的活性，特別是鈣蛋白酶殘余活性在不同溫度和pH值條件下差異較明顯，其次為組織蛋白酶D，組織蛋白酶B、L殘余活性的差異不大，低溫和低pH值條件能明顯延緩肌原纖維蛋白的降解，結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，最佳操作環(huán)境溫度為 10～20 ℃、腌制液 pH值為4.5。

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