高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定對(duì)氨磺酰苯甲酸3種有關(guān)物質(zhì)

李金鳳，楊祥龍，李 廣，李秀梅，李慶娟

（瑞陽制藥有限公司，山東 淄博 256100）

對(duì)氨磺酰苯甲酸（對(duì)羧基苯磺酰胺），是制備抗風(fēng)濕藥物丙磺舒的重要中間體，其制備主要是在不同條件下，對(duì)甲苯磺酰胺被氧化劑重鉻酸鉀或高錳酸鉀氧化得到[1-2]。謝建英[3]報(bào)道可在微波輻射下，以雙氧水氧化對(duì)甲苯磺酰胺獲得。作為重要中間體，對(duì)其質(zhì)量控制對(duì)最終產(chǎn)品質(zhì)量有著至關(guān)重要的作用，特別是有關(guān)物質(zhì)貫穿于整個(gè)藥品研究的始終。根據(jù)其化學(xué)性質(zhì)、合成路線確立了本品中可能存在雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C。建立高效液相色譜同時(shí)對(duì)對(duì)氨磺酰苯甲酸中可能存在3種雜質(zhì)的定量檢測(cè)方法，并對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的方法學(xué)研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

島津LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津），梅特勒電子天平（瑞士梅特勒XS205）

1.2 試藥

對(duì)氨磺酰苯甲酸原料（來源：AOCS；批號(hào)：ONS-007-29；含量：w=97.61%）；雜質(zhì)A（來源：中國食品藥品檢定研究院；批號(hào)：100131-201603；w=100%）；雜質(zhì) B（來源：SINCO PHARMACHEM； 批 號(hào) :17-07-1601； w=98.43%）；雜質(zhì) C（來源：SINCO PHARMACHEM；批號(hào)17-07-2201；w=96.76%）；雜質(zhì)A,B,C的結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 對(duì)氨磺酰苯甲酸及各個(gè)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液配制

稱取約12mg對(duì)氨磺酰苯甲酸原料，精密稱定，置25mL容量瓶中，用2.1項(xiàng)中流動(dòng)相A溶解，定容搖勻，配制成濃度為0.48mg/mL的溶液，作為供試品溶液。

表1 兩種不同溶液梯度洗脫表

2.2.2 雜質(zhì)儲(chǔ)備溶液配制

分別稱取雜質(zhì)A、雜質(zhì)B及雜質(zhì)C對(duì)照品各適量，精密稱定，置于不同容量瓶中，用2.1項(xiàng)中流動(dòng)相A溶解，定容搖勻，配制成各雜質(zhì)濃度0.08mg/mL的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2.3 系統(tǒng)性試驗(yàn)溶液

稱取約12mg對(duì)氨磺酰苯甲酸對(duì)照品，精密稱定，置于25mL容量瓶中，先加少量流動(dòng)相A溶劑溶解，加0.750mL對(duì)雜質(zhì)A儲(chǔ)備液，加0.30mL雜質(zhì)B、雜質(zhì)C儲(chǔ)備液，稀釋、定容搖勻（雜質(zhì)A 為2.4μg/mL、雜質(zhì)B、C為0.96μg/mL）。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取系統(tǒng)適用性溶液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖（圖2）。對(duì)氨磺酰苯甲酸、間氨磺酰苯甲酸、鄰氨磺酰苯甲酸、對(duì)甲基苯磺酰胺依次出峰，對(duì)氨磺酰苯甲酸與相鄰峰之間的最小分離度為2.099＞1.5，故該方法的專屬性比較強(qiáng)。

圖2 系統(tǒng)適用性圖譜

2.4 檢測(cè)限和定量限

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋后檢測(cè)，當(dāng)信噪比S/N不小于3且重復(fù)6次進(jìn)樣精密度的RSD≤15.0%時(shí)，確定次濃度為L(zhǎng)OD，當(dāng)信噪比S/N不小于10且重復(fù)6次進(jìn)樣精密度的RSD≤15.0%時(shí)，確定次濃度為L(zhǎng)OQ。雜質(zhì)A、B、 C 的 LOD（μg/mL） 結(jié) 果 ： 0.13、 0.068、0.044；雜質(zhì) A、B、C的 LOQ（μg/mL） 結(jié)果：0.18、0.11、0.060。雜質(zhì) A、B、C 的 RSD%（LOD，n=6） 分別為：4.26、11.11、11.04；雜質(zhì)A、B、C的RSD%（LOQ，n=6） 分別為：10.69、4.36、3.06。

2.5 線性和范圍

精密量取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液配制成不同濃度的溶液，使?jié)舛赛c(diǎn)在LOQ120%濃度范圍內(nèi)。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，用R2來證實(shí)良好線性關(guān)系。

1） 雜質(zhì) A：線性范圍 0.18μg/mL～1.14μg/mL，線性方程 y=36813x-1828，R2=0.9962；

2） 雜質(zhì) B：線性范圍 0.11μg/mL～1.14μg/mL，線性方程 y=60392x-1092，R2=0.9990；

3） 雜質(zhì) C：線性范圍 0.26μg/mL～3.20μg/mL，線性方程 y=75085x+1951.4，R2=0.9982。

結(jié)果表明線性關(guān)系良好。

2.6 精密度

重復(fù)性精密量取供試品按“2.2.1”項(xiàng)下配制6批供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算6次樣品中雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、總雜相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 ，結(jié)果分別為：1.04%、0%、3.30%、0%。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

中間精密度精密量取供試品按“2.2.1”項(xiàng)下配制6批供試品溶液，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖，計(jì)算中間精密度與重復(fù)性共12次測(cè)定結(jié)果雜質(zhì)A、雜質(zhì)B、雜質(zhì)C、 和總雜的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果分別為：2.72%、0%、7.02%、4.21%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.7 準(zhǔn)確度

準(zhǔn)確度是在供試品中加入各雜質(zhì)對(duì)照品的80%、100%、120%三個(gè)不同濃度測(cè)得的回收率所得。精密量取供試品按“2.2.1”項(xiàng)下配制9份不同的供試品溶液，精密加入“2.2.2”項(xiàng)下雜質(zhì)A、B、C的對(duì)照品儲(chǔ)備液0.6/0.24/0.24mL、0.75/0.30/0.30mL、0.9/0.36/0.36mL共9份，定容，搖勻，配制成80%濃度 （1.92/0.768/0.768μg/mL）、100%濃度 （2.4/0.96/0.96μg/mL）、120%濃度（2.88/1.152/1.152μg/mL） 3個(gè)濃度的供試品溶液，另精密量取供試品按“2.2.1”項(xiàng)下配制供試品溶液一份作為本底校正溶液。分別進(jìn)樣，按面積歸一法計(jì)算雜質(zhì)A、B、C含量，扣除本底量后計(jì)算回收率。雜質(zhì)A：平均值為96.50%，RSD=0.17%（n=9）；雜質(zhì)B：平均值為98.68%，RSD=0.12%（n=9）；雜質(zhì)C：平均值為99.38%，RSD=0.09%（n=9）；結(jié)果表明準(zhǔn)確度良好。

2.8 樣品測(cè)定

精密量取不同批次（批號(hào)：20171106/20171120/20180105）供試品按“2.2.1”項(xiàng)下配制溶液，量取各有關(guān)物質(zhì)對(duì)照品按 “2.2.2”項(xiàng)與

“2.2.3”項(xiàng)下配制系統(tǒng)適用性試驗(yàn)溶液，按“2.1”方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄色譜圖。供試品溶液的色譜圖中如出現(xiàn)與對(duì)照品溶液中相應(yīng)已知雜質(zhì)保留時(shí)間一致的色譜峰，按面積歸一法計(jì)算，其中三批樣中均未檢出雜質(zhì)B、C；雜質(zhì)A的檢測(cè)結(jié)果分別為：0.31%、0.31%、0.31%；總雜分別為：0.31%、0.31%、0.30%。此方法適用于對(duì)氨磺酰苯甲酸的檢測(cè)。

3 結(jié)語

本試驗(yàn)建立了同時(shí)檢測(cè)對(duì)氨磺酰苯甲酸中3種有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜法，并對(duì)方法的有效性和檢出能力進(jìn)行了評(píng)價(jià)[4]。結(jié)果表明，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可有效分離3個(gè)雜質(zhì)并應(yīng)用于批量檢測(cè)，為以對(duì)氨磺酰苯甲酸為中間體的丙磺舒等原料提供質(zhì)量保障。