薄層色譜-酶抑制反應(yīng)評價(jià)橄欖葉提取物的黃嘌呤氧化酶抑制活性

陳益勝，黃彩虹，徐學(xué)明*

（江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

治療痛風(fēng)的藥物多以黃嘌呤氧化酶為靶向[1]。不過，常見化學(xué)藥的使用伴隨較為嚴(yán)重的毒副作用。有鑒于此，研究發(fā)掘更加高效低毒的黃嘌呤氧化酶抑制劑意義重大。很多具有傳統(tǒng)藥用歷史的植物中含有豐富的活性物質(zhì)，不僅效果好而且毒副作用低，是新型藥物的寶庫[1-4]。近年來的研究表明，橄欖葉提取物中的活性成分對黃嘌呤氧化酶的抑制作用尤其明顯。本研究以薄層色譜為平臺，聯(lián)用黃嘌呤氧化酶催化黃嘌呤氧化反應(yīng)，以反應(yīng)產(chǎn)物 (尿酸)的紫外吸光特征變化為指標(biāo)建立了一種效率高、可靠性好的黃嘌呤氧化酶活性抑制能力定量評價(jià)方法，并應(yīng)用到橄欖葉提取物的非靶向活性評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

本研究所使用的試劑均為分析純；黃嘌呤氧化酶：活性90μ/mg，中國國藥集團(tuán)；分析型硅膠板：青島海洋化工；橄欖葉：市售；薄層色譜工作站。

1.2 方法

1.2.1 樣品制備

精確稱取10mg別嘌呤標(biāo)準(zhǔn)品到10mL棕色容量瓶，甲醇定容得到1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用移液管吸取別嘌呤標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.5mL轉(zhuǎn)移至10mL容量瓶，甲醇定容，得到0.05mg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度。10g橄欖葉粉碎后與50mL提取液混合，30℃超聲水浴 30min，取 2mL液體5000r/min離心5min；取上清液2mL，經(jīng)0.45μm過濾，用甲醇適當(dāng)稀釋。稱取100mg黃嘌呤氧化酶，溶于10mL磷酸緩沖液 (pH=7.8)中，得到酶溶液，使用前適當(dāng)稀釋。稱取100 mg黃嘌呤，溶于10mL磷酸緩沖液中，得到底物溶液，使用前適當(dāng)稀釋。

1.2.2 色譜條件

用薄層點(diǎn)樣儀將別嘌呤標(biāo)準(zhǔn)工作液和橄欖葉提取液以條帶的形式吹掃到薄層板上。10cm×10cm薄層板上可以容納10個(gè)條帶，包括別嘌呤2個(gè)平行內(nèi)標(biāo)，核8個(gè)待測樣液條帶。色譜流動相：v（乙酸乙酯）/v（甲酸）/v（氨水）(7/3/0.5)，展開距離為70mm。

1.2.3 酶反應(yīng)顯色

將展開后的薄層板浸入黃嘌呤氧化酶溶液。取出后立即陰涼處避光靜置5min；然后浸入黃嘌呤溶液；取出后陰涼避光靜置反應(yīng)10min。

1.2.4 光密度掃描測定

用光密度儀對經(jīng)過生物顯影的分離軌道進(jìn)行掃描測定。儀器參數(shù)設(shè)置：反射—熒光模式，鎢燈，激發(fā)光波長290nm，不用濾光片。光密度掃描結(jié)果通過工作站軟件處理。

1.2.5 酶活抑制指數(shù)計(jì)算

按照公式（1） 計(jì)算2個(gè)別嘌呤平行內(nèi)標(biāo)斑點(diǎn)峰面積的平均值P標(biāo)均

按照公式（2） 計(jì)算每個(gè)橄欖葉提取物樣品軌道斑點(diǎn)峰面積P樣

式中：i為酶活抑制斑點(diǎn)編號；n為酶活抑制斑點(diǎn)數(shù)量；Pi為第i個(gè)酶活抑制斑點(diǎn)峰面積。

按照公式（3） 計(jì)算2個(gè)橄欖葉提取物平行樣品平均斑點(diǎn)峰面積P樣均

按照公式（4） 計(jì)算橄欖葉提取物樣品的酶活抑制指數(shù)EI

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測參數(shù)優(yōu)化

酶催化反應(yīng)底物黃嘌呤和產(chǎn)物尿酸分別在265nm和290nm處有較強(qiáng)的紫外吸收。經(jīng)過酶催化反應(yīng)，在薄層板的背景區(qū)域，由于沒有物質(zhì)對酶催化活性進(jìn)行抑制，大部分的黃嘌呤被轉(zhuǎn)化為尿酸；而在有酶活性抑制物存在的斑點(diǎn)內(nèi)，黃嘌呤-尿酸的轉(zhuǎn)化過程被抑制，抑制效應(yīng)在一定濃度范圍內(nèi)與抑制劑的濃度和種類高度相關(guān)且呈線性關(guān)系?？紤]到樣品中大量基質(zhì)物質(zhì)的特征紫外光吸收在250nm左右，選用尿酸的最佳吸收波長290nm作為光密度計(jì)入射光的波長，降低樣品基質(zhì)對測試結(jié)果的干擾。不過，由于薄層板的背景區(qū)域尿酸含量高，吸光度強(qiáng)，造成吸光光密度掃描得到的信號峰為倒峰，無法用軟件對其進(jìn)行積分。為了解決這一問題，我們將光密度檢測模式改為熒光模式，激發(fā)波長設(shè)定為290nm，取消濾光片，使得光密度計(jì)的感應(yīng)光纖能夠接收相近波長反射光。這一變化可以有效避免倒峰信號對后續(xù)信號積分計(jì)算的影響。

2.2 顯色條件優(yōu)化

顯色反應(yīng)的發(fā)生必須由酶催化實(shí)現(xiàn)，因此酶的濃度對顯色結(jié)果有重要影響。因此首先使用別嘌呤作為指示物，優(yōu)化酶濃度。固定底物溶液濃度為0.1mg/mL，研究了0.01，0.02，0.04，0.06，0.08和0.1mg/mL 6個(gè)質(zhì)量濃度梯度的酶溶液對顯色效果的影響。結(jié)果表明，當(dāng)黃嘌呤氧化酶質(zhì)量濃度在0.01～0.08mg/mL范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)物別嘌呤的信號峰面積隨著黃嘌呤氧化酶濃度的上升而增高。進(jìn)一步增加黃嘌呤氧化酶的質(zhì)量濃度到0.1mg/mL，對應(yīng)的峰面積沒有明顯上升，這可能是因?yàn)槊傅姆磻?yīng)催化能力在0.08mg/mL水平達(dá)到了最高點(diǎn)，因此固定使用0.01mg/mL的黃嘌呤氧化酶溶液作為顯色用途。此后，研究了不同底物濃度對顯色結(jié)果的影響。這里選取0.01，0.05，0.1，0.2和0.5mg/mL的黃嘌呤溶液作為底物參與反應(yīng)。光密度掃描結(jié)果顯示，在0.01～0.1mg/mL范圍內(nèi)，內(nèi)標(biāo)別嘌呤的峰面積隨著底物濃度的上升而增高。進(jìn)一步增加黃嘌呤質(zhì)量濃度到0.1mg/mL不會引起內(nèi)標(biāo)峰面積的上升。而當(dāng)黃嘌呤質(zhì)量濃度增加到0.5mg/mL水平，內(nèi)標(biāo)峰面積反而下降，這可能是因?yàn)槊复呋磻?yīng)后多余的黃嘌呤殘留引起了吸光特征的變化。由此，用于酶反應(yīng)顯色的底物溶液質(zhì)量濃度選定為0.1mg/mL[5]。

2.3 酶抑制活性評價(jià)應(yīng)用

隨后將方法應(yīng)用到5種橄欖葉樣品的黃嘌呤氧化酶活性抑制能力的評價(jià)。為了方便定量比較，這里我們使用酶活抑制指數(shù)的概念來規(guī)范光密度掃描結(jié)果的計(jì)算。數(shù)據(jù)匯總結(jié)果如表1所示。很明顯，對同一種橄欖葉樣品來說，經(jīng)過不同提取液得到的提取物的酶活抑制能力表現(xiàn)出顯著的差異?？偟膩碚f，隨著提取溶液極性的降低，提取物總的酶活抑制指數(shù)也下降，這可能是因?yàn)殚蠙烊~中具有酶抑制能力的成分通常是生物堿、多酚、黃酮等親水化合物，因此在極性溶液中提取率更高。此外，我們可以看到橄欖葉提取物的酶活抑制能力也表現(xiàn)出顯著的地區(qū)差異。地中海地區(qū)的橄欖葉提取物酶活抑制能力最高（6～7），廣東次之 （4～5），云南最低 （＜4）。這說明必須慎重使用來自不同產(chǎn)地的橄欖葉作為黃嘌呤氧化酶抑制劑原料。這也從側(cè)面證明了本方法的實(shí)際意義。

表1 橄欖葉樣品酶活抑制指數(shù)測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了一種高效可靠的橄欖葉提取物黃嘌呤氧化酶活性抑制評價(jià)方法。在方法建立過程中，重點(diǎn)研究了光密度檢測參數(shù)、酶濃度、底物濃度和顯色時(shí)間對方法優(yōu)化的影響，同時(shí)提出了一種以抑制指數(shù)為定量評價(jià)計(jì)算方法的評價(jià)模式。本方法不僅可以避免提取物樣品中背景基質(zhì)對評價(jià)可信度的影響，同時(shí)也能消除相似活性物質(zhì)的互相干擾，因此可以很好地替代目前常用的吸光光度法，極大地簡化從天然產(chǎn)物中非靶向篩選黃嘌呤氧化酶抑制劑的過程。