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    重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌

    2020-04-16 12:55:39凌莉席靜王瑩周廣彪劉婧文魏霜李志勇
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年4期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    凌莉 席靜 王瑩 周廣彪 劉婧文 魏霜 李志勇

    摘要:為建立創(chuàng)傷弧菌的重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)檢測(cè)方法,根據(jù)編碼創(chuàng)傷弧菌DNA促旋酶的B亞單位蛋白(Gyrase Beta Subunit,gryB)的基因保守序列,設(shè)計(jì)RPA特異性引物,建立創(chuàng)傷弧菌gryB基因的RPA檢測(cè)方法并測(cè)試其特異性、靈敏度和應(yīng)用效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn),建立的RPA檢測(cè)方法特異性好,能夠從創(chuàng)傷弧菌中檢測(cè)到234 bp的特異性條帶,僅需在37 ℃下恒溫反應(yīng)40 min,不需要特殊的儀器設(shè)備;該方法的靈敏度與PCR相當(dāng),可達(dá)到0.1 ng/μL,應(yīng)用檢測(cè)結(jié)果也表明該方法與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法相當(dāng)。因此,本研究建立的RPA方法檢測(cè)gryB特異性強(qiáng)、靈敏度高,無(wú)需特殊的儀器設(shè)備,適合實(shí)驗(yàn)室快速檢測(cè)。

    關(guān)鍵詞:創(chuàng)傷弧菌;gryB基因;RPA;檢測(cè)

    中圖分類號(hào):S182?文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2020)04-0073-04

    收稿日期:2018-12-06

    基金項(xiàng)目:廣東省基金團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(編號(hào):S2012030006235);廣東省科技計(jì)劃(編號(hào):2016A050503031);廣東出入境檢驗(yàn)檢驗(yàn)局科技計(jì)劃(編號(hào):2017GDK48);廣東省汕頭市科技計(jì)劃(編號(hào):汕府科[2017]166號(hào)-38)。

    作者簡(jiǎn)介:凌?莉(1978—),女,廣東人,碩士,高級(jí)工程師,主要從事食品安全研究。E-mail:joiceling@163.com。

    通信作者:李志勇,博士,研究員,主要從事食品安全研究。E-mail:lizy@iqtc.cn。

    創(chuàng)傷弧菌是一種帶有莢膜的革蘭氏陰性嗜鹽弧菌,在海水養(yǎng)殖的牡蠣、蝦和蟹等貝類、甲殼類水生動(dòng)物中分布廣泛,是流行程度、危害程度最高的食源性致病菌之一[1-2]。人食用生的或未經(jīng)充分加工的海產(chǎn)品,以及通過(guò)皮膚創(chuàng)口接觸海水入血均可感染,并在短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)敗血癥“蜂窩組織炎”出血性大疤,半數(shù)以上患者可因多臟器功能衰竭而死亡,因此創(chuàng)傷弧菌又被稱為“海洋中的無(wú)聲殺手”[3]。當(dāng)下世界上大部分沿海國(guó)家均有創(chuàng)傷弧菌的致病報(bào)道,我國(guó)江浙、閩粵沿海及臺(tái)灣地區(qū)亦有較多的感染報(bào)道,更有數(shù)例因創(chuàng)傷弧菌感染引起的敗血癥患者,在3~4 d內(nèi)均出現(xiàn)腹腔內(nèi)廣泛性壞死、多器官功能衰竭而死亡的案例,是公眾飲食健康的重大威脅之一,所以對(duì)創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)在公共衛(wèi)生上具有十分重要的意義[4]。

    目前,對(duì)創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)仍主要依靠傳統(tǒng)方法,即首先利用選擇性培養(yǎng)基增菌,進(jìn)而結(jié)合生化及血清學(xué)方法進(jìn)行鑒定。傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確,但是存在檢測(cè)效率低、檢測(cè)目標(biāo)單一、靈敏度低且耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等不足。為滿足致病菌快速檢測(cè)的要求,技術(shù)人員發(fā)展了酶聯(lián)熒光免疫檢測(cè)法(VIDAS-CHL)、酶免疫法(EIA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、膠體金試紙條法、API生化鑒定試紙條法、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增(LAMP)技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光PCR等方法。其中,實(shí)時(shí)熒光PCR及PCR相關(guān)的其他改良技術(shù)以操作簡(jiǎn)便快捷、靈敏度高等顯著優(yōu)勢(shì),近年來(lái)在致病菌檢測(cè)中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[5],但熒光檢測(cè)設(shè)備普遍售價(jià)偏高、產(chǎn)物片段偏小、引物探針設(shè)計(jì)要求較高等不可回避的缺陷,在一定程度上限制了其推廣應(yīng)用,尤其是不利于非實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)以及基層實(shí)驗(yàn)室的推廣應(yīng)用。

    RPA(recombinase polymerase amplifcation)是繼LAMP之后的另一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[6],該技術(shù)擴(kuò)增利用單鏈DNA結(jié)合蛋白(single-stranded DNA binding protein,SSB)將雙鏈模板DNA解鏈,在DNA聚合酶的作用下,引物與特定模板正確配對(duì)形成復(fù)合體,然后由DNA聚合酶延伸引物生成新的DNA互補(bǔ)鏈。該方法主要具備以下優(yōu)點(diǎn):(1)恒溫37 ℃下即可反應(yīng),不需要高低溫度循環(huán)實(shí)現(xiàn)核酸解鏈和退火;(2)只需要1對(duì)引物,反應(yīng)時(shí)間短,僅需40 min;(3)結(jié)果易辨識(shí),RPA擴(kuò)增產(chǎn)物具有特定大小的條帶[7],而且還可進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)序確認(rèn)。

    目前,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到利用RPA技術(shù)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的報(bào)道,本研究擬根據(jù)編碼創(chuàng)傷弧菌DNA促旋酶的B亞單位蛋白(Gyrase Beta Subunit)的gryB基因,設(shè)計(jì)RPA檢測(cè)引物,構(gòu)建創(chuàng)傷弧菌的RPA檢測(cè)方法,并驗(yàn)證其特異性和靈敏度,建立一種快速檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌gryB的簡(jiǎn)便高效、特異性強(qiáng)、靈敏度高、適于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用檢測(cè)的技術(shù)方法。

    1?材料與方法

    1.1?材料與試劑

    創(chuàng)傷弧菌(ATCC27562)、擬態(tài)弧菌(ATCC33653)、副溶血弧菌(ATCC17802)、河流弧菌(ATCC33809)、溶藻弧菌(ATCC17749)、霍亂弧菌(ATCC39315)、哈維氏弧菌(ATCC33842)、沙門氏菌(ATCC14028)、大腸埃希菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)和單增李斯特菌(ATCC19114)均為本機(jī)構(gòu)購(gòu)買的標(biāo)準(zhǔn)菌株,其購(gòu)買來(lái)源為中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、廣東食品微生物安全工程技術(shù)研究開(kāi)發(fā)中心和美國(guó)MBL公司。應(yīng)用檢測(cè)的樣品均為本機(jī)構(gòu)2016年法定和委托檢驗(yàn)中的留樣,所用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司產(chǎn)(貨號(hào)DP302),引物由上海生物工程技術(shù)有限公司安排合成,電泳級(jí)瓊脂糖、DNA Marker及顯色劑購(gòu)自寶生物大連生物技術(shù)有限公司,RPA擴(kuò)增試劑盒為TwistDX公司產(chǎn)TwistAmp Basic kits。

    1.2?主要儀器與設(shè)備

    PCR擴(kuò)增儀(Veriti,ABI公司)、核酸蛋白分析儀(ND-1000,Thermo公司)、電泳儀(DYY-6C,北京六一)、凝膠成像系統(tǒng)(Tanon-1 600,天能公司)。

    1.3?方法

    1.3.1?基因組DNA提取

    先將上述標(biāo)準(zhǔn)菌株按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789進(jìn)行復(fù)壯增菌及生化鑒定,再參照試劑盒說(shuō)明書,提取上述增菌液的基因組DNA,使用核酸蛋白分析儀檢測(cè)DNA濃度及純度并統(tǒng)一稀釋為100 ng/μL備用。

    1.3.2?引物設(shè)計(jì)

    參考RPA引物設(shè)計(jì)的要求,根據(jù)gryB基因的保守序列,使用Oligo V6.22軟件進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)和篩選,入選序列再利用Primer Blast工具(NCBI官方網(wǎng)站提供)進(jìn)行特異性確認(rèn),最終交由上海生物工程技術(shù)有限公司安排合成。最終設(shè)計(jì)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的RPA檢測(cè)引物,擴(kuò)增條帶234 bp,序列具體如下:上游引物:5′-GCTTGAATACCACCTTCATACATGAAGTGATC-3′;下游引物:5′-TCATGGTGTGCCTGATGCACCGCTTGCTAT-3′。

    1.3.3?RPA檢測(cè)方法建立

    以“1.3.1”節(jié)中制備的DNA為模板,采用上述引物進(jìn)行RPA擴(kuò)增,同時(shí)設(shè)置超純水為陰性對(duì)照,測(cè)試恒溫37 ℃反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)分別為30、40、50、60 min時(shí)的擴(kuò)增效果。RPA擴(kuò)增體系的配制方法如下:向含有凍干酶粉的0.2 mL Twist Amp反應(yīng)管(Twist AmpBasic kits,Twist)中加入再水化緩沖液(Rehydration Buffer)29.5 μL,去離子水12.5 μL,上、下游引物各2 μL(終濃度為0.4 μmol/L),模板DNA 1.0 μL,最后再加入醋酸鎂溶液2.5 μL(280 mmol/L)。RPA反應(yīng)結(jié)束后,向RPA擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50.0 μL苯酚/氯仿溶液,充分混勻后12 000 r/min離心2 min,取上清液5 μL點(diǎn)樣于1.5%瓊脂糖凝膠,使用1×TBE緩沖液進(jìn)行電泳,電泳條件為5 V/cm,恒壓電泳40~60 min,最終在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

    1.3.4?RPA檢測(cè)方法特異性評(píng)價(jià)

    按照“1.3.3”節(jié)的RPA檢測(cè)反應(yīng)體系及適用擴(kuò)增時(shí)長(zhǎng),對(duì)前述11種標(biāo)準(zhǔn)菌株的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè),對(duì)所建立的RPA檢測(cè)方法特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

    1.3.5?RPA檢測(cè)方法靈敏度評(píng)價(jià)

    將創(chuàng)傷弧菌基因組DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋,共5個(gè)稀釋度,以梯度稀釋的DNA為模板,按照“1.3.3”節(jié)所示RPA檢測(cè)反應(yīng)體系進(jìn)行RPA靈敏度試驗(yàn),并與蔣蔚等報(bào)道的PCR檢測(cè)方法的靈敏度[8]進(jìn)行比較,評(píng)價(jià)RPA檢測(cè)方法的靈敏度。

    1.3.6?RPA檢測(cè)方法應(yīng)用效果評(píng)價(jià)

    選取本機(jī)構(gòu)2016年檢測(cè)留樣樣品50份,包括20份陽(yáng)性樣品,其中創(chuàng)傷弧菌確認(rèn)陽(yáng)性檢出2份。樣品主要為凍蝦仁、凍鳳尾對(duì)蝦、凍牡蠣、活青蟹、金鯧魚以及水質(zhì)監(jiān)控樣本,參考食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品處理,使用堿性蛋白胨水增菌培養(yǎng)10 h,取2 mL 增菌液離心富集,使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司,貨號(hào)DP302)提取DNA,使用建立的RPA方法進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn),以結(jié)果的一致性來(lái)評(píng)價(jià)方法的應(yīng)用效果。

    2?結(jié)果與分析

    2.1?RPA檢測(cè)方法的構(gòu)建

    以創(chuàng)傷弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株基因組DNA為模板,并以超純水為陰性對(duì)照,測(cè)試了不同擴(kuò)增時(shí)長(zhǎng)的RPA檢測(cè)效果,由圖1可知,在40 min時(shí)便可達(dá)到較為理想的擴(kuò)增效果,gryB擴(kuò)增條帶與預(yù)期目的條帶大小一致,約234 bp,陰性對(duì)照沒(méi)有條帶,建立的RPA檢測(cè)體系能夠準(zhǔn)確檢測(cè)到gryB基因。

    2.2?RPA檢測(cè)方法的特異性評(píng)價(jià)

    由圖2可知,gryB的RPA特異性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示,創(chuàng)傷弧菌能夠檢測(cè)到234 bp的特異性條帶,其他10株標(biāo)準(zhǔn)菌株:擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、哈維氏弧菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌均未檢測(cè)到條帶,說(shuō)明該方法具有較強(qiáng)的特異性。

    2.3?RPA檢測(cè)方法的靈敏度評(píng)價(jià)

    靈敏度測(cè)試結(jié)果(圖3)顯示,當(dāng)RPA檢測(cè)方法反應(yīng)時(shí)間為40 min,DNA含量為0.1 ng時(shí),可檢測(cè)234 bp大小目的條帶,該靈敏度結(jié)果與蔣蔚等建立的檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌groEL基因的PCR方法一致;當(dāng)DNA含量為0.01 ng時(shí),2種方法均未能擴(kuò)增到目的條帶,說(shuō)明RPA方法與PCR方法的靈敏度相當(dāng)。

    2.4?RPA檢測(cè)方法的應(yīng)用效果

    應(yīng)用建立的RPA檢測(cè)方法,對(duì)本機(jī)構(gòu)2016年檢測(cè)的20份陽(yáng)性檢出留樣(其中創(chuàng)傷弧菌確認(rèn)陽(yáng)性檢出2份)和30份陰性留樣進(jìn)行了復(fù)檢,結(jié)果共有2份樣本檢出創(chuàng)傷弧菌,該留樣檢測(cè)結(jié)果與之前傳統(tǒng)培養(yǎng)及生化鑒定的結(jié)果完全一致,表明該方法具有較好的應(yīng)用效果。

    3?討論

    RPA技術(shù)是近些年興起的常溫?cái)U(kuò)增技術(shù),目前在病毒、病原菌及轉(zhuǎn)基因的檢測(cè)中均有成功應(yīng)用的先例[8-14],但尚未見(jiàn)創(chuàng)傷弧菌的相關(guān)研究報(bào)道。本研究建立了針對(duì)創(chuàng)傷弧菌特異性gryB基因的RPA檢測(cè)方法,并對(duì)該方法進(jìn)行了應(yīng)用測(cè)試,結(jié)果顯示該方法特異性強(qiáng),靈敏度與普通PCR相當(dāng),可較好應(yīng)用于水生動(dòng)物及其加工產(chǎn)品的檢測(cè),且反應(yīng)耗時(shí)短、對(duì)設(shè)備依賴程度低,適合基層單位和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)使用,為創(chuàng)傷弧菌的疫情監(jiān)控、污染監(jiān)測(cè)等提供了更為簡(jiǎn)便高效的解決手段。

    研究表明,gryB基因與DNA復(fù)制、限制、修飾和修復(fù)相關(guān),在細(xì)菌DNA的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制中發(fā)揮重要作用,近年來(lái)常被選用于細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育分析及細(xì)菌鑒定[15-16]。本研究亦是基于gryB基因保守序列建立了RPA檢測(cè)方法,在特異性、靈敏度及應(yīng)用檢測(cè)方面上也均達(dá)到了預(yù)期效果。

    RPA技術(shù)最大的優(yōu)點(diǎn)在于在37 ℃恒溫反應(yīng),不需要進(jìn)行復(fù)雜的反應(yīng)參數(shù)優(yōu)化,本研究也只是對(duì)比測(cè)試不同反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)的擴(kuò)增效果,發(fā)現(xiàn)在40 min時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物基本可滿足檢測(cè)需求,考慮時(shí)效性及污染防控,未選用擴(kuò)增更長(zhǎng)但可能更靈敏的反應(yīng)參數(shù)。此外,RPA技術(shù)反應(yīng)溫度接近人體溫,可不依賴PCR擴(kuò)增儀,有學(xué)者利用該特性建立了一種僅僅利用人體溫度即能完成DNA擴(kuò)增的RPA檢測(cè)方法[17],顯著拓展了該技術(shù)的應(yīng)用條件。

    靈敏度是評(píng)價(jià)檢測(cè)方法優(yōu)劣的一個(gè)關(guān)鍵參數(shù),本研究建立的RPA技術(shù)用于檢測(cè)gryB方法,其靈敏度和普通PCR方法相當(dāng),也與已報(bào)道的LAMP檢測(cè)方法[18-20]相當(dāng)。但RPA技術(shù)相比普通PCR,反應(yīng)更為快速(僅需30~40 min),且不依賴PCR儀;同時(shí)相比LAMP、RPA技術(shù)引物設(shè)計(jì)難度小,產(chǎn)物片段單一,便于后續(xù)進(jìn)行測(cè)序確證,具有更高的實(shí)用價(jià)值。

    同PCR方法一樣,RPA技術(shù)也是擴(kuò)增檢測(cè)特定基因序列,該序列與目標(biāo)菌的性狀及行為表現(xiàn)并無(wú)必然的對(duì)應(yīng)關(guān)系,當(dāng)目標(biāo)菌數(shù)量較少、活力較弱時(shí),使用傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)方法不一定能檢出為陽(yáng)性,故在應(yīng)用檢測(cè)中可能存在假陰性問(wèn)題[21]。本研究建立的RPA檢測(cè)方法,對(duì)本機(jī)構(gòu)的50例留樣的應(yīng)用檢測(cè)并未發(fā)現(xiàn)假陰性問(wèn)題,可能與研究的樣本數(shù)量偏小有關(guān)。

    當(dāng)然,RPA技術(shù)作為一種后起的檢測(cè)手段,也有不足之處需要完善。首先,RPA體系對(duì)于蛋白活性要求比較高,需要保證體系中的各種酶觸反應(yīng)準(zhǔn)確進(jìn)行,其技術(shù)的提升依賴現(xiàn)代酶學(xué)的發(fā)展應(yīng)用;其次,RPA擴(kuò)增體系中存在大量蛋白酶,故直接電泳無(wú)法分辨出目的核酸片段,必須經(jīng)過(guò)純化去除蛋白質(zhì)[7];再次,RPA的關(guān)鍵技術(shù)有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的保護(hù),試劑成本相對(duì)較高。但RPA技術(shù)作為一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù),具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作快速便捷等優(yōu)點(diǎn),被譽(yù)為“一種可替代PCR的技術(shù)”,在病原體檢測(cè)及食品安全等眾多領(lǐng)域已經(jīng)有了越來(lái)越多的推廣應(yīng)用,技術(shù)發(fā)展及應(yīng)用前景均較為廣闊。

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