甘藍(lán)型油菜脂肪酶基因BnGLIP1的克隆與分析

李明 丁麗娜 王政 曹維 王玉康 張潔夫 譚小力

摘要：植物GDSL脂肪酶是一個(gè)重要的脂肪酶家族，具有水解酶活性，在植物體內(nèi)參與眾多的生理活動(dòng)。從甘藍(lán)型油菜中克隆到1個(gè)GDSL類型脂肪酶基因，將其命名為BnGLIP1。該脂肪酶基因編碼的蛋白有360個(gè)氨基酸，含有20種氨基酸，分子質(zhì)量為39 545.35 u，理論等電點(diǎn)為4.95。生物信息學(xué)分析表明，該蛋白屬于穩(wěn)定性蛋白，可能為親水性蛋白;編碼蛋白的N端具有信號(hào)肽序列，推測(cè)可能為外分泌蛋白;蛋白質(zhì)二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)顯示α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例較高。組織特異性表達(dá)分析表明，BnGLIP1在甘藍(lán)型油菜的根、莖、莖尖、葉、花、角果、種子等中均有表達(dá)，其中角果中的表達(dá)量最高，莖中最低。干旱、高鹽等脅迫處理均能誘導(dǎo)BnGLIP1的表達(dá)，表明BnGLIP1脂肪酶基因在植物的脅迫響應(yīng)中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜;BnGLIP1;生物信息學(xué);表達(dá)模式分析;脅迫響應(yīng)

中圖分類號(hào)： S634.301;Q785文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）04-0059-06

收稿日期：2019-03-05

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2016YFD0100305）。

作者簡(jiǎn)介：李?明（1993—），女，山東菏澤人，碩士研究生，研究方向?yàn)槟Ｊ缴锕δ芑蚪M學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)。E-mail：LMING0309@126.com。

通信作者：譚小力，博士，研究員，研究方向?yàn)橛筒斯δ芑蚪M學(xué)。E-mail：xltan@ujs.edu.cn。

油菜是繼水稻、小麥、玉米和大豆之后的第五大農(nóng)作物，主要分布在長(zhǎng)江流域，屬于十字花科，主要分為三大類型，即白菜型油菜、芥菜型油菜和甘藍(lán)型油菜。其中甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）是我國(guó)重要的油料作物，油菜籽中除含有豐富的油脂外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，是一種潛在的植物蛋白資源[1]。此外，油菜又是生物柴油的理想原料，是一種優(yōu)質(zhì)能源，油菜生產(chǎn)對(duì)保障我國(guó)食用油安全供給有重要意義，同時(shí)對(duì)發(fā)展生物能源也有潛在價(jià)值[2]。

GDSL脂肪酶是具有多功能性質(zhì)的水解酶，在多種植物體中均有發(fā)現(xiàn)[3-6]。近年來(lái)許多研究發(fā)現(xiàn)，GDSL在植物生長(zhǎng)發(fā)育、器官形態(tài)發(fā)生、逆境脅迫和脂代謝等方面發(fā)揮著重要作用[7-10]。譬如，BnLIP2在油菜的種子萌發(fā)、形態(tài)建成及開(kāi)花過(guò)程中起著重要作用[11]。Takahashi等鑒定到了1個(gè)擬南芥CDEF1（cuticle destructing factor 1）基因，該基因表達(dá)的蛋白屬于GDSL脂肪酶/酯酶家族，參與花粉管穿透柱頭并且可促進(jìn)側(cè)根的形成[12]。此外，Kim等研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥glip1-1突變體在接種壞死病原菌后表現(xiàn)出誘導(dǎo)抗性缺陷，而在過(guò)表達(dá)GLIP1基因植株中則表現(xiàn)出對(duì)多種病原菌的抗性[13]。與野生型植株相比，AtGDSL1和BnGDSL1過(guò)表達(dá)株系的種子發(fā)芽率和成 苗率均有提高，與此同時(shí)，AtGDSL1和BnGDSL1的組成性過(guò)表達(dá)促進(jìn)了脂肪分解代謝，降低了種子油含量[14]。另外，Chen等研究表明，GDSL脂酶家族成員可以通過(guò)降解脂肪酸而影響種子脂肪酸的含量[15]。在油菜中過(guò)表達(dá)棉花基因GhGLIP后，顯著提高了油菜種子中的油脂含量[16]。

與微生物、動(dòng)物GDSL脂肪酶研究相比，植物中該類脂肪酶的研究較少，尤其是關(guān)于油料作物脂肪酶基因，有很多問(wèn)題亟待發(fā)現(xiàn)和研究。本研究從甘藍(lán)型油菜中分離得到了1個(gè)GDSL脂肪酶基因（BnGLIP1），進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析及表達(dá)分析，預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)與功能，為深入研究其生化功能打下基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料與試劑

1.1.1?植物材料

甘藍(lán)型油菜中雙11號(hào)種子購(gòu)于武漢中油種業(yè)科技有限公司，培養(yǎng)室生長(zhǎng)條件如下：溫度為（20+2） ℃，濕度為60%～90%，每天光周期為光照8 h/黑暗16 h，光照度為150 μmol/（m2·s）。生長(zhǎng)15 d后分別取幼苗的根、葉、莖和莖尖，另外在開(kāi)花7 d后取新鮮的花，待開(kāi)花30 d后取幼嫩的角果和種子，將所取材料置于-70 ℃ 冰箱備用。

1.1.2?試劑

TRIzolTM Reagent，購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司;DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、HiScript Q RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）反轉(zhuǎn)錄試劑盒、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix，均購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;瓊脂糖凝膠回收試劑盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit，購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司;KOD-Plus-Neo高保真酶，購(gòu)自東洋紡（上海）生物科技有限公司;pMDTM18-T Vector克隆試劑盒，購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?油菜總RNA提取以及cDNA合成

采用Trizol試劑快速提取法提取油菜總RNA。首先取少量組織用液氮速凍，研磨至粉末狀，之后加入1 mL預(yù)冷的Trizol，充分混合后冰上靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。待完成后，取約800 μL 上清加入300 μL三氯甲烷并劇烈振蕩，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min。隨后取上清加入等體積異丙醇輕搖，4 ℃、12 000 r/min離心10 min;棄上清加入75%乙醇充分洗滌，4 ℃、12 000 r/min離心5 min。最后棄上清，干燥沉淀，加入DEPC水溶解，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

cDNA合成是以總RNA為模板，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成第1鏈。

1.2.2?序列克隆

根據(jù)BnaC07g35650D序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行克隆，擴(kuò)增BnGLIP1的引物序列如下：OL-F：5′-GGATAAGGTTTTTTCCAGAGAG-3′和OL-R：5′-TCTTTGTCTGTGTGGAGGAA-3′。以甘藍(lán)型油菜中雙11號(hào)的cDNA為模板，使用高保真聚合酶KOD-Plus-Neo進(jìn)行目的片段擴(kuò)增，采用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物，并將產(chǎn)物連接到pMD18-T載體從而構(gòu)建成為BnGLIP1-pMD18-T載體，之后轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并將陽(yáng)性克隆送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3?蛋白生物信息學(xué)分析

利用Primer 5軟件預(yù)測(cè)目的基因BnGLIP1編碼的氨基酸序列;蛋白的理化性質(zhì)利用在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）進(jìn)行分析;利用NCBI中的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)[17]對(duì)蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè);使用MEGA 5.1軟件進(jìn)行多種氨基酸序列比對(duì);利用ProtScale分析蛋白的親疏水性;運(yùn)用SignalP 4.1 Server對(duì)蛋白序列的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè);運(yùn)用TargetP 1.1 Server預(yù)測(cè)真核細(xì)胞蛋白的亞細(xì)胞定位[18];利用SOPMA和SWISS-MODEL分別對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.4?環(huán)境脅迫處理

選用生長(zhǎng)至4葉1心期的油菜幼苗進(jìn)行不同環(huán)境脅迫模擬處理。干旱脅迫處理：用聚乙二醇（PEG）溶液模擬干旱，將濃度為20%（W/V）的PEG溶液噴施于油菜葉片上，黑暗培養(yǎng)24 h。鹽脅迫處理：將濃度為25 mmol/L的NaCl溶液噴施于油菜葉片上，黑暗培養(yǎng)24 h。低溫、高溫脅迫處理：分別將油菜置于4 ℃冰箱和37 ℃培養(yǎng)箱，黑暗培養(yǎng)24 h。以室溫下正常生長(zhǎng)的幼苗作為對(duì)照。上述每種處理均設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.5?表達(dá)分析

根據(jù)BnGLIP1基因序列的非保守區(qū)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物序列如下：qPCR-F：5′-AGATTCCTTTGCCAACGACC-3′和qPCR-R：5′-ACCCTAAACCCATAGCGAGA-3′，選取甘藍(lán)型油菜Actin基因（GenBank：AF111812.1）作為內(nèi)參基因，內(nèi)參引物序列如下：Actin-RTF：5′-TGTTGCTATCCAGGCTGTTCTTTC-3′和Actin-RTR：5′-GATAGCGTGAGGAAGAGCATAACC-3′。以反轉(zhuǎn)錄第1條鏈cDNA為模板，具體操作方法根據(jù)AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7軟件進(jìn)行分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?甘藍(lán)型油菜BnGLIP1基因的全長(zhǎng)cDNA克隆

本研究從甘藍(lán)型油菜中雙11中分離得到了BnaC07g35650D的全長(zhǎng)cDNA，核苷酸序列和預(yù)測(cè)的氨基酸序列如圖1所示，該序列的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)1 083 bp，編碼360個(gè)氨基酸，將克隆到的基因命名為BnGLIP1（B.napus GDSL LIPASE-LIKE1）。

2.2?蛋白性質(zhì)的生物信息學(xué)分析

2.2.1?蛋白理化性質(zhì)分析

利用ProtParam進(jìn)行蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，分析結(jié)果顯示BnGLIP1蛋白由360個(gè)氨基酸組成，分子式為C1 741H2 663N483O536S19，分子質(zhì)量為39 545.35 u，理論等電點(diǎn)為4.95，此蛋白由20種氨基酸組成，其中所占比例最高的3個(gè)氨基酸為Ala（8.9%）、Asn（8.9%）和Gly（9.2%），帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為34個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為25個(gè)。

2.2.2?蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

與其他脂酶（lipase）相似，GDSL類脂酶同樣以絲氨酸作為水解催化位點(diǎn)，但不同的是絲氨酸位于蛋白N端。此外，GDSL脂酶還具有至少4個(gè)保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域（block）[6]。利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)BnGLIP1蛋白的保守結(jié)構(gòu)域特征，結(jié)果顯示此蛋白屬于植物SGNH脂肪酶家族（圖2）。使用MEGA 5.1軟件對(duì)來(lái)自不同物種的氨基酸進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜BnGLIP1蛋白具有很高的保守性，其中它與擬南芥中的同源蛋白（AAL24090.1）同源性最高，為90.83%，其次為另一種擬南芥同源蛋白（NP_199379.1），同源性為81.94%。如圖3所示，BnGLIP1具備GDSL脂肪酶的序列特征，一級(jí)結(jié)構(gòu)主要包括5個(gè)保守區(qū)域（Ⅰ～Ⅴ）。

2.2.3?蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)

甘藍(lán)型油菜BnGLIP1蛋白由360個(gè)氨基酸組成，為進(jìn)一步了解編碼蛋白的親疏水性，利用ProtScale對(duì)其進(jìn)行詳細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，雖然某些氨基酸表現(xiàn)出較強(qiáng)的疏水性，但親水性氨基酸多于疏水性氨基酸，因此可以預(yù)測(cè)此蛋白為親水性蛋白（圖4）。

2.2.4?信號(hào)肽分析以及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

如圖5所示，運(yùn)用SignalP 4.1 Server對(duì)蛋白序列的信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)前21個(gè)氨基酸的信號(hào)肽（S）值處于最高，在0.637～0.943之間浮動(dòng)，并且在第22個(gè)氨基酸處驟降至0.137，之后處于一個(gè)平穩(wěn)水平;在第22個(gè)氨基酸處出現(xiàn)剪切位點(diǎn)（C）最高值0.877;Y值也在第22個(gè)氨基酸處出現(xiàn)最高值。由此可知，此BnGLIP1 蛋白有信號(hào)肽序列?推測(cè)其可能為外分泌蛋白。另外，利用TargetP 1.1 Server對(duì)其進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，定位依據(jù)的是任何一個(gè)N-末端存在序列，如葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、線粒體靶向肽或分泌途徑信號(hào)肽等。分析結(jié)果顯示，分泌途徑中的信號(hào)肽（SP）數(shù)值為0.976，并且可靠指數(shù)RC為1，表明其為一個(gè)分泌蛋白（表1），定位在細(xì)胞外。根據(jù)以上預(yù)測(cè)結(jié)果分析，推測(cè)BnGLIP1很可能是一個(gè)分泌蛋白。

2.2.5?二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

氨基酸序列決定了蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)決定了其功能。為了探討B(tài)nGLIP1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，利用SOPMA在線分析軟件對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。如圖6所示，α螺旋（藍(lán)色）占38.06%，延伸鏈條（紅色）占16.11%，β轉(zhuǎn)角（綠色）占3.61%，紫色代表無(wú)規(guī)則卷曲，占42.22%（圖6）。該結(jié)果與SWISS-MODEL軟件進(jìn)行的三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相吻合（圖7）。

2.3?BnGLIP1基因表達(dá)模式分析

2.3.1?組織特異性表達(dá)分析

采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)BnGLIP1在甘藍(lán)型油菜不同組織包括根、莖、葉、花、莖尖、角果、種子中的表達(dá)模式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，但在各個(gè)組織中的表達(dá)量存在顯著差異。其中以根作為對(duì)照，基因在角果中的表達(dá)量最高，約是根中表達(dá)量的8.95倍，在葉和莖中表達(dá)量相對(duì)較低（圖8）。

2.3.2?各種環(huán)境因子對(duì)BnGLIP1表達(dá)的影響

qRT-PCR分析顯示，在PEG溶液處理24 h時(shí)，與對(duì)照（CK）相比，BnGLIP1的相對(duì)表達(dá)量顯著提高。25 mmol/L NaCl處理也可以誘導(dǎo)BnGLIP1的表達(dá)。另外，在4 ℃低溫、37 ℃高溫處理?xiàng)l件下，BnGLIP1的相對(duì)表達(dá)量下降（圖9）。這些結(jié)果表明，BnGLIP1可能參與植物對(duì)環(huán)境脅迫的應(yīng)答反應(yīng)。

3?討論與結(jié)論

甘藍(lán)型油菜是我國(guó)及世界上最重要的油料作物之一。植物脂肪酶具有廣泛的生理功能，能催化水解反應(yīng)，還可能催化酯化、醇解、酸解等多種反應(yīng)，在油脂分解反應(yīng)及油脂改造中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。

本研究以我國(guó)長(zhǎng)江中下游油菜主產(chǎn)區(qū)具有優(yōu)良抗逆特點(diǎn)的甘藍(lán)型油菜品種中雙11號(hào)為材料，克隆了1個(gè)重要的GDSL脂肪酶基因BnGLIP1，并通過(guò)生物信息學(xué)方法分析了其基本理化性質(zhì)以及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)等。利用NCBI的CDD數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，BnGLIP1蛋白屬于植物SGNH脂肪酶家族。對(duì)來(lái)自不同植物物種的GDSL同源蛋白進(jìn)行序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，BnGLIP1在不同的物種中具有很高的保守性，特別是與雙子葉植物油菜、擬南芥、山茱萸的GDSL脂肪酶在氨基酸水平上有很高的同源性。

植物基因在各組織器官的表達(dá)情況對(duì)其功能具有很大的影響，如Kondou等研究了擬南芥的RGE1基因，該基因在種子萌發(fā)階段的胚乳中特異表達(dá)，在心形階段控制胚胎的發(fā)育中起著重要的作用[19]。筆者利用qRT-PCR比較了該基因在不同組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在不同組織中的表達(dá)差異較大，其中在角果中表達(dá)量最高，推測(cè)此基因可能在角果期發(fā)揮功能。與筆者研究結(jié)果一致，目前所報(bào)道的脂肪酶基因在不同組織器官中的表達(dá)特征呈現(xiàn)出多樣性，Lee等發(fā)現(xiàn)擬南芥GLIP2在根和莖以及早期幼苗階段（1周齡）中高表達(dá)，而GLIP1在1周齡幼苗、花、葉、莖、根等階段均有表達(dá)[20]。此外，它的表達(dá)還受到干旱、高鹽等各種環(huán)境脅迫的誘導(dǎo)，受到低溫、高溫等環(huán)境條件的抑制，表明BnGLIP1基因除了參與脂肪酸代謝外，也參與了對(duì)環(huán)境脅迫的響應(yīng)。

生物信息學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，BnGLIP1蛋白含有1段跨膜結(jié)構(gòu)域，都屬于親水性蛋白，在N端有1段含有25個(gè)氨基酸序列的信號(hào)肽，可能分泌到細(xì)胞外。TargetP 1.1 Server分析發(fā)現(xiàn)，SP數(shù)值為0.976，更進(jìn)一步說(shuō)明了它是一個(gè)分泌蛋白。在擬南芥中，其同源蛋白GDSL脂肪酶GLIP1也是一個(gè)分泌蛋白，它通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)激活植物局部和系統(tǒng)的抗性，在植物免疫反應(yīng)中發(fā)揮了重要作用[21]。所以筆者推測(cè)甘藍(lán)型油菜BnGLIP1很可能也是一個(gè)植物防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)的蛋白，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)基因及酶活分析將有助于進(jìn)一步了解BnGLIP1的生物學(xué)功能。

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