艾葉揮發(fā)油抗病原微生物活性研究進(jìn)展

呂豐，叢萌，沈秉正，洪宗國

·綜述·

艾葉揮發(fā)油抗病原微生物活性研究進(jìn)展

呂豐，叢萌，沈秉正，洪宗國

430060 武漢大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部（呂豐、沈秉正）；430070 武漢，華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動科動醫(yī)學(xué)院（叢萌）；430074 武漢，中南民族大學(xué)藥學(xué)院（洪宗國）

艾葉為菊科蒿屬多年生草本植物艾（Levl. et Vant.）的干燥葉，植株有濃烈的香氣，除干旱及高寒地區(qū)外，在我國分布廣泛。在中醫(yī)理論中，艾是一種重要的藥用植物，是中醫(yī)艾灸療法的灸材，也作為飲片廣泛應(yīng)用于臨床，具有“溫經(jīng)止血、散寒止痛”的功效，在梁·陶弘景《名醫(yī)別錄》及明·李時珍《本草綱目》等多部中醫(yī)藥傳統(tǒng)典籍中均有收錄。

隨著現(xiàn)代分離提取及藥理活性評價技術(shù)的提高，對艾葉化學(xué)成分活性部位的研究取得一定進(jìn)展。艾葉揮發(fā)油（volatile oils fromfolium，VOAAF）為艾葉主要活性成分，其抗菌及抗病毒活性日益為人們關(guān)注，本文綜述了 VOAAF 的化學(xué)成分及抗病原微生物活性，旨在為發(fā)掘艾的藥用價值提供理論參考，為進(jìn)一步深化開發(fā)艾醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)貢獻(xiàn)一份力量。

1 艾葉揮發(fā)油的化學(xué)成分

揮發(fā)油是艾葉抗病原微生物的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，然而 VOAAF 化學(xué)成分很大程度上受產(chǎn)地、采集期和提取工藝的影響。艾在我國分布較廣，由于氣候、水文和土壤的差異，導(dǎo)致品種變異，形成具有各地特色的亞種。傳統(tǒng)認(rèn)為，艾葉采集以端午節(jié)為佳，然而含閏月年份的 24 節(jié)氣與陰歷出入較大，也與采收期光照及降雨有關(guān)，故艾葉的采集期也一定程度影響 VOAAF 的化學(xué)成分。VOAAF 常用的提取工藝包括水蒸氣蒸餾法、超臨界 CO2萃取法、溶劑萃取法和微波萃取法等。這些方法在工藝、產(chǎn)率、提取速度和能耗等方面均各有不同，故對 VOAAF 的化學(xué)成分也有一定影響。本小節(jié)將依產(chǎn)地、采集期和提取工藝三大因素對VOAAF化學(xué)成分的影響進(jìn)行綜述。

1.1 產(chǎn)地對艾葉揮發(fā)油化學(xué)成分的影響

肖宇碩等[1]對江蘇南通、湖北蘄春、浙江臺州、云南楚雄及新疆烏魯木齊五地采集的艾葉樣本進(jìn)行揮發(fā)油成分研究，發(fā)現(xiàn)湖北蘄春樣本揮發(fā)油含量最高；在檢出的 155 種成分中，蒎烯、桉油精、萜品烯、側(cè)柏酮、1-石竹烯和氧化石竹烯等 16 個成分為共有組分。本實(shí)驗(yàn)室分別對湖北蘄春、安徽霍山、江西樟樹、山東鄄城和河北安國五個地方品種的 VOAAF 進(jìn)行了化學(xué)成分分析[2]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：運(yùn)用蘄艾油簡式提取法[3]所得揮發(fā)油得率分別為 1.230%、0.296%、0.479%、0.394% 和 0.675%；分別檢出 28、41、16、46 和 11 種化學(xué)成分，其中 1,8-桉葉油素、3-側(cè)柏酮、石竹烯及其氧化物和龍腦等為其共有成分。蔣瀟和田靜[4]通過比較云南、四川和湖北三地產(chǎn) VOAAF 化學(xué)成分發(fā)現(xiàn)，三地樣品共同含有的化合物分別為樟腦、龍腦、3,3,6-三甲基-1,5-庚二烯-4-酮和 1,8-桉葉油素，然而含量差異較大。戴衛(wèi)波等[5]通過對 12 個不同產(chǎn)地的VOAAF 分析得出：湖北、山西、河北、湖南和安徽產(chǎn)艾葉其揮發(fā)油含量較高；普遍含有桉油精、樟腦、龍腦、松油醇（包括 α-松油醇和順式-β-松油醇）、側(cè)柏酮和氧化石竹烯等成分。綜上，艾葉產(chǎn)地不同造成了揮發(fā)油的得率及主要化學(xué)成分的差異，故強(qiáng)調(diào)道地性為確立 VOAAF 主要化學(xué)成分的基本前提，也為研究其抗病原微生物活性指明了物質(zhì)基礎(chǔ)。

1.2 采集期對艾葉揮發(fā)油化學(xué)成分的影響

張?jiān)萚6]以湖北蘄春 2014 年種植的艾為研究對象，對當(dāng)年端午節(jié)前后一個月共 7 個時間點(diǎn)采收艾葉樣本進(jìn)行揮發(fā)油化學(xué)成分分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：當(dāng)年 5 月 20 日前后采收樣本的揮發(fā)油含量最高，達(dá)到 1.29%；以龍腦、桉油精、樟腦等 30 種主要成分相對含量為指標(biāo)，5 月 27 日采收樣本為最高，5 月 20 日采收樣本次之。本實(shí)驗(yàn)室對湖北蘄春在 2012 年端午節(jié)前一個月 6 個時間點(diǎn)采集的艾葉進(jìn)行揮發(fā)油化學(xué)成分分析發(fā)現(xiàn)[7]：當(dāng)年 6 月 2 日采集點(diǎn)揮發(fā)油含量最高；通過比較不同采集期 5 種生物活性成分（1,8-桉葉油素、β-側(cè)柏酮、樟腦、龍腦、4-萜烯醇）相對含量變化，6 月 2 – 9 日采集樣本生物活性成分含量最高，毒性最低，品質(zhì)較好。傳統(tǒng)認(rèn)為，艾葉采集以端午節(jié)為佳，但動植物生長依 24 節(jié)氣變化，含閏月年份的 24 節(jié)氣與陰歷出入較大，故端午節(jié)收艾未必最佳。例如，2012 年（閏四月年）芒種節(jié)的前后采收的艾葉質(zhì)量最好，既有較高的 VOAAF 得率，又可保證揮發(fā)油中生物活性成分含量的穩(wěn)定性。

1.3 提取工藝對艾葉揮發(fā)油化學(xué)成分的影響

目前已報道 VOAAF 的提取方法多達(dá)十余種[8]，較為常見的有水蒸氣蒸餾法、超臨界流體萃取法和有機(jī)溶劑萃取法等。表 1 為多篇文獻(xiàn)報道的艾葉揮發(fā)油得率及主要化學(xué)成分。水蒸氣蒸餾法操作簡便環(huán)保，無有機(jī)溶劑殘留，在工業(yè)制備中運(yùn)用廣泛；由于其工作溫度在 100 ℃左右，蒸餾出大部分可揮發(fā)性組分以小分子化合物及其氧化產(chǎn)物為主[9-10]。超臨界 CO2萃取法揮發(fā)油得率較高，反應(yīng)界面在常溫下進(jìn)行，一定程度上避免了常規(guī)提取過程中經(jīng)常發(fā)生的分解、沉淀等反應(yīng)；所得產(chǎn)物中極性較小的成分含量較高[9, 11]。運(yùn)用有機(jī)溶劑萃取法揮發(fā)油得率較高，極性較小成分含量較多（如芳香族化合物），然而提取物種類較前兩種方法有限且具有溶劑殘留[12-14]。綜合來看，水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油工業(yè)推廣和臨床藥用價值更大，而超臨界流體萃取法和有機(jī)溶劑萃取法等工藝更適合于成分分析和品質(zhì)鑒定。

表 1 不同提取方法制備的艾葉揮發(fā)油化學(xué)成分比較

多種因素均可顯著影響 VOAAF 的主要化學(xué)成分。VOAAF 是多組分混合物，因此，在考察 VOAAF 生物活性時，應(yīng)務(wù)必將產(chǎn)地、采集期及提取方式等因素考慮在內(nèi)，以保證研究方案的可行性、可靠性和科學(xué)性。

2 艾葉揮發(fā)油抗病原微生物活性

按大小、結(jié)構(gòu)和組成等，病原微生物可分為三大類：非細(xì)胞型（病毒）、原核細(xì)胞型（細(xì)菌、支原體、衣原體和立克次體等）和真核細(xì)胞型（真菌）。近年來，VOAAF 抗病原微生物活性已經(jīng)見諸報道，本小節(jié)將依病原微生物的分類來綜述 VOAAF 的生物活性及其作用機(jī)制。

2.1 艾葉揮發(fā)油的抗病毒活性

病毒是形態(tài)最微小、結(jié)構(gòu)最簡單的微生物，在微生物引起的疾病中，病毒約占 75%。早期研究肯定了艾灸的抗病毒作用，而 VOAAF 作為艾葉中主要活性成分，其抗病毒活性也逐漸為人們關(guān)注。吳生兵等[15]利用水蒸氣蒸餾法提取安徽產(chǎn) VOAAF，觀察到其具有抗水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus，VZV）的活性，且劑量越大抑制效果越持久。一項(xiàng)基于 HepG 2.2.15 細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，水蒸氣蒸餾法提取的河南產(chǎn) VOAAF 對乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）具有抑制作用；其機(jī)制是抑制 DNA 的復(fù)制，從而減少病毒表面抗原 HBsAg 及 HbeAg 表達(dá)[16]。韓軼等[17]報道，水蒸氣蒸餾法提取的湖北產(chǎn) VOAAF 可通過抑制呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）形成合胞體，產(chǎn)生抗病毒的作用；其 IC50為 3.33 mg/L，治療指數(shù)達(dá)到 9.4。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，VOAAF 及其艾灸過程中產(chǎn)生的艾葉裂解物均發(fā)揮抗病毒作用，其中酚類成分的 O-H 鍵能夠均裂生成半醌自由基，并對甲型 H3N2 流感病毒具有抑制活性[18]。綜上，VOAAF 具有一定的抗病毒活性，但具體是其中哪一種或哪幾種化學(xué)成分具有上述活性，尚有待深入研究。此外，擴(kuò)展 VOAAF 的抗病毒譜和抗病毒機(jī)制也是進(jìn)一步探索的重要方向。

2.2 艾葉揮發(fā)油的抗細(xì)菌活性

由于細(xì)菌的獲得性耐藥，人們對于化學(xué)抗菌藥物的使用日趨謹(jǐn)慎。艾葉的天然提取物可有效抑制細(xì)菌，其主要成分 VOAAF 因其廣譜性和天然安全性具有被廣泛研究和開發(fā)的潛力[19]。雖然多地產(chǎn) VOAAF 抑菌圈直徑（DIZ）、最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）等參數(shù)各異，但仍對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌表現(xiàn)出廣譜抗細(xì)菌活性（表 2）；其中金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的報道最多[20-28]。本實(shí)驗(yàn)室前期亦探索了蘄艾揮發(fā)油抗革蘭氏陰性與陽性菌的廣譜活性[29-30]。劉先華等[20]發(fā)現(xiàn)，VOAAF 對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌的抑制作用等同于或優(yōu)于紅霉素。類似的，李志鵬等[24]發(fā)現(xiàn) VOAAF 對大腸埃希菌的抑制效果強(qiáng)于 160 萬單位青霉素。目前已有多項(xiàng)研究探索了 VOAAF 的抗菌機(jī)制。楊文婷等[25]認(rèn)為 VOAAF 可通過改變細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的通透性以及抑制細(xì)菌 DNA 合成來實(shí)現(xiàn)其抗菌作用。Guan 等[27]通過掃描電鏡發(fā)現(xiàn)，揮發(fā)油的活性成分可穿透細(xì)菌細(xì)胞壁到達(dá)作用靶點(diǎn)，最終破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)起到殺滅細(xì)菌的作用。運(yùn)用細(xì)胞膜熒光探針 diSC35，Xiang 等[28]發(fā)現(xiàn) VOAAF 分別在 MIC 和 MBC 濃度下處理金黃色葡萄球菌，熒光信號顯著增強(qiáng)、培養(yǎng)基上清液水溶性蛋白質(zhì)和鉀離子增加，提示細(xì)菌細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，胞內(nèi)物質(zhì)外泄。綜上，VOAAF 的廣譜抗菌活性提示了其作為天然藥物資源的臨床藥用潛力，而相應(yīng)的抗菌機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

表 2 對艾葉揮發(fā)油敏感的病原菌分類

注：IC50：50% 抑制濃度；IC90：90% 抑制濃度；DIZ：抑菌圈直徑；MIC：最低抑菌濃度；MBC：最低殺菌濃度。

2.3 艾葉揮發(fā)油的抗真菌活性

目前常見的致病性真菌達(dá) 50 ~ 100 種，可引起人類感染性、中毒性及超敏反應(yīng)性疾病[31]。臨床上，艾灸對真菌感染往往有較顯著的療效[32-33]。艾灸具有藥物作用、溫?zé)嶙饔门c近紅外輻射作用三大作用機(jī)制[34]，其中藥物作用與 VOAAF 相關(guān)[35]。絮狀表皮癬菌（）屬于淺部感染真菌，臨床上可致體癬、足癬、手癬和甲癬等。吳生兵等[15]發(fā)現(xiàn)，120 μl/ml VOAAF 作用 3 min 即可殺滅絮狀表皮癬菌。白假絲酵母菌（）又稱白色念珠菌，屬機(jī)會致病性真菌，容易引起皮膚、黏膜和內(nèi)臟的急、慢性感染，其感染率和死亡率逐年上升[36-38]。研究表明，以 120 μl/ml VOAAF 作用 40 min 即可殺滅白假絲酵母菌[15]。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，蘄艾揮發(fā)油對白色念珠菌具有強(qiáng)抑制與殺滅作用，最低抑菌濃度為 0.03%[29]。施高翔等[39]通過研究發(fā)現(xiàn)，VOAAF 處理白假絲酵母菌出現(xiàn)磷脂酰絲氨酸外翻、線粒體膜電位改變和細(xì)胞核固縮或裂解等現(xiàn)象，菌體細(xì)胞凋亡增加，提示 VOAAF 抗白假絲酵母菌活性與誘導(dǎo)線粒體損傷所致的細(xì)胞凋亡有關(guān)。新型隱球菌（）屬機(jī)會致病菌，侵犯人體可引起隱球菌病，最初表現(xiàn)為肺部感染，最終可累及中樞神經(jīng)系統(tǒng)及全身各臟器。吳生兵等[15]在研究中發(fā)現(xiàn) VOAAF 同樣具有抗新型隱球菌活性。黑曲霉（）是曲霉屬致病菌，能侵犯機(jī)體許多部位造成肺曲霉病、全身性曲霉病、中毒和致癌。湖北產(chǎn)艾葉通過同時蒸餾萃取法提取 VOAAF，其對黑曲霉的 MIC 為 6.25 ± 0.36 μl/ml[27]。努爾比耶等[40]發(fā)現(xiàn)，新疆產(chǎn) VOAAF 對黑曲霉的 MIC 為 50 μl/ml；其主要成分桉樹腦和 4-松油烯醇對黑曲霉的 MIC 分別為 50 μl/ml 和 40 μl/ml。上述工作證實(shí)了 VOAAF 的抗真菌活性并初步推測了其活性部位，指出 VOAAF 的抗真菌作用是多種成分協(xié)同、多靶點(diǎn)作用的結(jié)果，為日后研究 VOAAF 的抗真菌活性提示了方向。

3 結(jié)語與展望

艾在我國資源豐富、分布廣泛，在中醫(yī)診療體系中占有重要地位。為了進(jìn)一步探討艾的藥用價值和產(chǎn)業(yè)前景，本文首次綜述了國內(nèi)外對 VOAAF 抗病原微生物活性的研究。但從 VOAAF 藥物開發(fā)的角度而言，還存在諸多難點(diǎn)：首先，VOAAF 的化學(xué)成分復(fù)雜，各品種艾葉油成分又各有差異，難以建立如單一成分藥物類似的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)；其次，對于 VOAAF 抗病原微生物活性的機(jī)制研究深度不足，即具體哪一種或哪幾種活性成分參與了何種水平的抑菌效應(yīng)，VOAAF 的體內(nèi)過程如何，這是藥效學(xué)和藥代學(xué)所需解決的問題；最后，艾葉及其揮發(fā)油產(chǎn)業(yè)開發(fā)規(guī)模及深度不夠，少數(shù)產(chǎn)品如艾條、精油制品尚處于初級開發(fā)階段，艾的藥用及衛(wèi)生保健價值還有待進(jìn)一步發(fā)掘。VOAAF 具有抗病原微生物活性顯著、促滲作用強(qiáng)、安全性高等優(yōu)勢，但同時在應(yīng)用方面存在溶解性差、穩(wěn)定性低等不足，這需要制劑與配方技術(shù)加以解決。目前，常用的如包合、凝膠和微乳等技術(shù)既可保留揮發(fā)油的藥理活性，又能在最大程度上改善物理特性。綜上，VOAAF 的基礎(chǔ)研究和制劑研究將為新型抗病原微生物藥物的開發(fā)提供重要理論保障。

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洪宗國，Email：hongzongguo@aliyun.com

2019-06-12

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.022