谷子PEPC基因的鑒定及其對(duì)非生物逆境的響應(yīng)特性

趙晉鋒 杜艷偉 王高鴻 李顏方 趙根有 王振華 王玉文 余愛麗

谷子PEPC基因的鑒定及其對(duì)非生物逆境的響應(yīng)特性

趙晉鋒**杜艷偉**王高鴻 李顏方 趙根有 王振華 王玉文 余愛麗*

山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所/ 特色雜糧種質(zhì)資源發(fā)掘與育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山西長(zhǎng)治 046011

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是C4植物光合作用關(guān)鍵酶, 并在植物多種代謝途徑及逆境信號(hào)應(yīng)答過程中起重要作用。本研究通過序列比對(duì), 從谷子基因組中篩選出6個(gè)候選基因。SiPEPC蛋白特征參數(shù)相似度很高, 序列非常保守, 都含有PEPC基因特征功能域PEPcase Motif。SiPEPC成員主要被定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體。在SiPEPC成員啟動(dòng)子序列中含大量有光、激素、逆境以及其他生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)的順式應(yīng)答元件。苗期逆境qRT-PCR表達(dá)譜分析表明, 5個(gè)基因()不同程度受ABA、PEG、高鹽和低溫誘導(dǎo)表達(dá), 表明其參與了苗期對(duì)非生物逆境的響應(yīng)。5個(gè)基因表達(dá)量在正常生長(zhǎng)條件下隨著谷子的生長(zhǎng)呈增強(qiáng)趨勢(shì), 且在不同生育時(shí)期干旱脅迫下明顯增加, 表明其參與了拔節(jié)、抽穗、灌漿期的干旱脅迫應(yīng)答。拔節(jié)期弱光可誘導(dǎo)5個(gè)基因的表達(dá), 而在拔節(jié)期中等強(qiáng)度光照以及抽穗期和灌漿期的中等光照和弱光照下表達(dá)量均急劇降低, 揭示光照強(qiáng)度嚴(yán)重影響基因的表達(dá)。

谷子; 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶; 非生物逆境; 表達(dá)分析

谷子[(L.) P. Beauv.]是C4禾本科重要糧食作物和飼草作物, 起源于我國(guó), 在全球一些溫帶、亞熱帶和熱帶的干旱和半干旱地區(qū)廣泛種植, 具有抗旱、耐瘠、適應(yīng)性廣等特點(diǎn)[22-24]。谷子在生長(zhǎng)過程中會(huì)經(jīng)常遇到干旱、鹽漬、低溫、高溫、洪澇以及病蟲害侵染等, 這些逆境嚴(yán)重影響了谷子的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量品質(zhì)[25]。2012年谷子基因組測(cè)序已完成并公布, 為開展谷子抗逆分子生物學(xué)研究提供了極為便利的條件[26-27]。迄今為止PEPC研究主要聚焦在C4型PEPC基因在提高C3植物光合作用和耐脅迫應(yīng)答領(lǐng)域, 在C4作物玉米、高粱中研究較多, 但是在C4作物谷子中PEPC基因非生物逆境相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究檢索了谷子中的PEPC基因家族成員, 并對(duì)其氨基酸序列、蛋白特征、功能、亞細(xì)胞定位、啟動(dòng)子區(qū)域順式應(yīng)答元件等參數(shù)特征分析和預(yù)測(cè), 隨后檢測(cè)了家族基因在幼苗期逆境脅迫下的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式及在拔節(jié)、抽穗、灌漿3個(gè)生育時(shí)期干旱脅迫和不同光照處理下的表達(dá)情況, 旨在為進(jìn)一步分析PEPC基因在谷子逆境應(yīng)答信號(hào)途徑中的功能和機(jī)制以及為利用基因工程方法改善作物光合速率和提高產(chǎn)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用谷子品種‘豫谷1號(hào)’, 種子保存于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院谷子研究所生物技術(shù)課題。在組培室中培養(yǎng)谷子幼苗, 溫度為(22±2)℃, 濕度為60%, 光照周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

待組培室幼苗長(zhǎng)至三葉一心期時(shí), 分別對(duì)其進(jìn)行20% PEG-6000模擬干旱、鹽(250 mmol L–1NaCl)、ABA (100 μmol L–1)和低溫(4℃)脅迫處理, 苗期逆境表達(dá)譜分析取樣時(shí)間點(diǎn)為處理后0、1、3、6、12和24 h, 整株取樣[28]。旱棚種植‘豫谷1號(hào)’, 對(duì)照處理生育期內(nèi)正常澆水; 干旱處理只澆3次關(guān)鍵水, 分別為拔節(jié)(6月20日)、抽穗(8月5日)和灌漿期(8月30日)澆透水, 其他時(shí)間采用自然控水方式控水。光照處理為當(dāng)植株出苗后用黑色遮陽網(wǎng)分別遮擋1層(中等光照, 拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期測(cè)量光照強(qiáng)度分別為221.8、411.6、164.6 μmol m-2s-1), 2層(弱光照, 拔節(jié)期、抽穗期、灌漿期測(cè)量光照強(qiáng)度分別為52.1、95.8、58.8 μmol m-2s-1)至成熟收獲。光照強(qiáng)度用標(biāo)智光強(qiáng)測(cè)定儀(GM1040)于晴天上午9:00—10:00測(cè)量10次數(shù)值, 取平均值。干旱處理試驗(yàn)與光照處理試驗(yàn)為同一對(duì)照。對(duì)照、中等光照處理和弱光照處理生育期內(nèi)正常澆水, 其他農(nóng)田管理措施相同。分別在拔節(jié)、抽穗、灌漿期時(shí)取旱棚干旱處理與光照強(qiáng)度處理材料和對(duì)照旗葉葉片, 立即在-80℃冰箱中速凍備用。

1.3 谷子PEPC基因的鑒定及基因結(jié)構(gòu)、蛋白序列分析

在Phytozome數(shù)據(jù)庫中以擬南芥和玉米的已知PEPC氨基酸序列為遞交序列, 進(jìn)行BlastP比對(duì), 搜索具有完整閱讀框的谷子同源序列, 獲得谷子候選PEPC基因。基因參數(shù)和蛋白序列來源于Phytozome數(shù)據(jù)庫。利用ExPASy網(wǎng)站在線工具預(yù)測(cè)蛋白分子量和等電點(diǎn)。利用PLACE在線軟件對(duì)基因啟動(dòng)子區(qū)域順式元件進(jìn)行分析, 采用GSDS軟件繪制基因結(jié)構(gòu)圖, 用在線工具CELLO v.2.5進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè), 預(yù)測(cè)置信度計(jì)算參考Yu等[29]描述方法。使用Blast工具在NCBI上查找不同物種氨基酸同源性序列, 用ClustalX1.83軟件分析比對(duì)基因序列[30], 用Mega6.0軟件鄰接法構(gòu)建不同物種N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹[31]。

1.4 總RNA提取、cDNA合成及引物設(shè)計(jì)

按照說明書, 使用生工TRIzol試劑盒提取植物總RNA; 使用生工第1鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。所用引物由Primer Primer 5.0設(shè)計(jì), 引物信息見表1。

1.5 Real-time PCR分析

樣品cDNA均一化后作為實(shí)時(shí)定量PCR模板, 以谷子基因(Seita.7G294000)作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系為20 μL, 包含10 μL 2′熒光染料混合液、0.4 μL正向引物(10 μmol L–1)、0.4 μL反向引物(10 μmol L–1)、2 μL cDNA模板、7.2 μL無菌水。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)優(yōu)化后PCR程序?yàn)?5℃ 3 min; 95℃ 7 s, 57℃ 10 s, 72℃ 15 s, 45個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)3次重復(fù), 采用相對(duì)定量2–ΔΔCt方法計(jì)算基因在某種逆境處理下某個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于對(duì)照的轉(zhuǎn)錄水平變化[32]。SiPEPC成員在苗期不同逆境、不同生育期干旱和不同光照下Real-time PCR 表達(dá)分析結(jié)果利用百邁克云平臺(tái)在線工具聚類熱圖繪制(Pretty Heatmaps)熱圖, 參數(shù)默認(rèn)。

表1 本試驗(yàn)所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子PEPC基因成員鑒定與參數(shù)分析

通過序列比對(duì)和分析, 從谷子中篩選出6個(gè)候選基因成員(表2)。根據(jù)基因定位在染色體1~9號(hào)上的先后位置順序分別命名為。6個(gè)基因不均分布在1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)染色體上, 其中分別分布于1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)染色體上, 而全部位于5號(hào)染色體上。基因有2種轉(zhuǎn)錄方式, 其他5個(gè)基因只有1種轉(zhuǎn)錄方式。功能域分析發(fā)現(xiàn), 所有基因都含有PEPC基因特征功能域PEPcase, 功能域在基因中的詳細(xì)位置見表2。候選SiPEPC蛋白參數(shù)分析表明, SiPEPC成員之間基因組長(zhǎng)度變化明顯, 在4676~8603 bp之間, 編碼氨基酸數(shù)目在964~1032之間。成員間分子量范圍在109.82~114.89 kD之間, 蛋白等電點(diǎn)范圍在5.70~7.14之間, 不穩(wěn)定指數(shù)范圍在44.10~52.09之間, 脂肪系數(shù)范圍在85.81~93.87之間, 平均疏水指數(shù)范圍在-0.418~-0.277之間。GSDS在線軟件分析SiPEPC成員基因結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),分別含9、9、8、6、9個(gè)內(nèi)含子, 而含20個(gè)內(nèi)含子(圖1)。

圖1 SiPEPC成員的基因結(jié)構(gòu)

Fig. 1 Gene structure of SiPEPC genes

2.2 SiPEPC蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和啟動(dòng)子區(qū)域順式元件分析

采用Psort在線工具對(duì)谷子SiPEPC家族成員的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明, SiPEPC成員主要被定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體(表3)。利用PLACE在線軟件對(duì)SiPEPC成員啟動(dòng)子順式元件分析(表4), SiPEPC成員啟動(dòng)子區(qū)域主要包括大量的光應(yīng)答元件、激素類應(yīng)答元件(脫落酸、赤霉素、水楊酸、乙烯、茉莉酸甲酯、生長(zhǎng)素)、逆境應(yīng)答元件(逆境防御、低溫、干旱、傷害)以及其他生長(zhǎng)調(diào)控相關(guān)順式元件, 包括缺氧特異性誘導(dǎo)、厭氧誘導(dǎo)必需、分生組織特異性表達(dá)、玉米蛋白代謝調(diào)控、種子特異性調(diào)控、晝夜節(jié)律元件等。

表3 SiPEPC蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)

表4 SiPEPC基因啟動(dòng)子區(qū)域順式元件預(yù)測(cè)

(續(xù)表4)

2.3 PEPC序列比對(duì)及進(jìn)化分析

谷子PEPC成員氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)成員之間序列非常保守, 相似性較高, 其序列一致性為67.71%。所有成員都含有PEPC蛋白特征功能域PEPcase, 其中SiPEPC1、SiPEPC2、SiPEPC3、SiPEPC5、SiPEPC6序列相似性較高, 整體序列一致性為74.03%, 而SiPEPC4在特征功能域內(nèi)由于有幾個(gè)片段的插入和缺失, 因此與其他幾個(gè)SiPEPC序列一致性較低, 在32.92%~ 34.06%之間。為進(jìn)一步了解谷子SiPEPC進(jìn)化關(guān)系, 推測(cè)其生物功能, 在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索了不同物種已知PEPC基因。序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)所有物種PEPC整體一致性非常高, 為72.88%, 說明PEPC基因在進(jìn)化過程中非常保守。利用 MEGA6.0 軟件構(gòu)建了谷子和不同物種PEPC蛋白成員的Neighbor-Joining進(jìn)化樹(圖3)。

從圖3可以看出, 谷子的基因與高粱、玉米基因聚合在一起, 揭示谷子與高粱、玉米親緣關(guān)系較近(同屬禾本科C4作物), 另一方面也暗示它們?cè)谀承┕δ苌峡赡芫哂邢嗨菩?。玉米、高粱、谷子的PEPC成員與擬南芥、馬鈴薯、花生、蓖麻、煙草PEPC成員相互嵌合在一起, 表明PEPC基因在單、雙子葉植物分化以前就已經(jīng)存在。另外發(fā)現(xiàn)一些同源基因?qū)? 例如和、和、和、和和和, 這些相同或不同物種的PEPC基因聚在一起表明, 它們可能由共同祖先進(jìn)化而來, 而且具有類似的生物功能。

2.4 SiPEPC家族基因苗期非生物逆境脅迫下表達(dá)分析

由圖4可知, 谷子三葉一心期幼苗在4種脅迫處理下, 除由于表達(dá)量低未檢測(cè)到信號(hào)外, 其他5個(gè)基因在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)水平變化趨勢(shì)不完全相同。在ABA脅迫處理下所有時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量均下調(diào), 其他基因表達(dá)量在4種脅迫處理過程中至少1個(gè)時(shí)間點(diǎn)有所上調(diào)。在ABA-12 h、Cold-24 h、PEG-12 h、NaCl-12 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高, 分別為對(duì)照的8.20、9.70、4.85、9.93倍;在ABA-12 h、Cold-24 h、PEG-6 h、NaCl-6 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高, 分別為對(duì)照的4.81、8.77、5.69、21.38倍;在ABA-6 h、Cold-24 h、PEG-24 h、NaCl-6 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高, 分別為對(duì)照的13.91、1.34、3.55、3.22倍;在ABA-6 h、Cold-24 h、PEG-24 h、NaCl-12 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高, 分別為對(duì)照的16.00、31.70、4.31、9.24倍; 而在ABA-12 h、Cold-24 h、PEG-12 h、NaCl-12 h時(shí)其相對(duì)表達(dá)量達(dá)最高, 分別為對(duì)照的0.93、5.19、3.53、15.68倍。試驗(yàn)表明5個(gè)基因都參與了苗期谷子對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)。

2.5 不同生育期干旱脅迫及不同光照強(qiáng)度下表達(dá)分析

為進(jìn)一步了解PEPC基因在谷子不同生育期干旱脅迫下的表達(dá)情況, 本研究檢測(cè)了它們?cè)?個(gè)關(guān)鍵生育時(shí)期(拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期)干旱脅迫及不同光照強(qiáng)度下的表達(dá)情況。由圖5可知,在正常抽穗期、灌漿期表達(dá)量與拔節(jié)期相比均有明顯提升, 而在抽穗期表達(dá)量下降, 在灌漿期表達(dá)量較拔節(jié)期有明顯提升。干旱脅迫下,在抽穗期、灌漿期表達(dá)量與拔節(jié)期相比均也有明顯提升,在灌漿期、抽穗期表達(dá)量與拔節(jié)期相比呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì), 而呈現(xiàn)先降后升趨勢(shì)。表明大部分SiPEPC基因在正常生長(zhǎng)條件下其表達(dá)隨谷子生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)增強(qiáng)趨勢(shì), 在不同生育期干旱脅迫下其表達(dá)量趨勢(shì)都有明顯增加, 揭示這5個(gè)基因在關(guān)鍵生育時(shí)期都參與了對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)。

圖2 PEPC家族蛋白序列的氨基酸序列多重比對(duì)

AtPEPC1、AtPEPC2、AtPEPC3: 擬南芥AtPEPC1、AtPEPC2、AtPEPC3; SbPEPC1、SbPEPC2、SbPEPC3: 高粱SbPEPC1、SbPEPC2、SbPEPC3; GmPEPC: 大豆GmPEPC; ZmPEPC1、ZmPEPC2: 玉米ZmPEPC1、ZmPEPC2; StPEPC: 馬鈴薯StPEPC; AhPEPC: 花生AhPEPC; RcPEPC: 蓖麻RcPEPC; NtPEPC: 煙草 NtPEPC。對(duì)應(yīng)GenBank蛋白序列號(hào)分別為Q9MAH0.1、Q5GM68.2、Q84VW9.2、P29195.1、P29194.1、P15804.2、P51061.1、P04711.2、P51059.1、P29196.2、ABY87944.1、ABR29878.1、P27154.1。相同氨基酸殘基用黑色表示, 相似氨基酸殘基用灰色表示(相似性≥ 60%)。

AtPEPC1, AtPEPC2, AtPEPC3:AtPEPC1, AtPEPC2, AtPEPC3; SbPEPC1, SbPEPC2, SbPEPC3:SbPEPC1, SbPEPC2, SbPEPC3; GmPEPC:GmPEPC; ZmPEPC1, ZmPEPC2:ZmPEPC1, 2; StPEPC:StPEPC; AhPEPC:AhPEPC; RcPEPC:RcPEPC; NtPEPC:NtPEPC. The corresponding GenBank protein numbers are Q9MAH0.1, Q5GM68.2, Q84VW9.2, P29195.1, P29194.1, P15804.2, P51061.1, P04711.2, P51059.1, P29196.2, ABY87944.1, ABR29878.1, and P27154.1, respectively. The amino acids with an entire homology are shown by a black background, and those shared non-identical conserved identity by a graybackground (≥ 60% similarity).

由圖6可知, 所有基因熱圖顏色從J-1期(拔節(jié)期對(duì)照)偏黑紅色向在J-2期(拔節(jié)期干旱)的鮮紅色轉(zhuǎn)變, 即所有基因在J-2期表達(dá)量與J-1期相比均有所提高, 也就是說拔節(jié)期干旱誘導(dǎo)了所有基因的表達(dá)。但在J-3期(拔節(jié)期中等光照)條件下所有基因表達(dá)量全部下降, 而在J-4期(拔節(jié)期弱光照)所有基因表達(dá)量又全部上升。試驗(yàn)結(jié)果說明拔節(jié)期光照強(qiáng)度影響基因表達(dá), 弱光條件能誘導(dǎo)基因在拔節(jié)期的表達(dá)。與拔節(jié)期相似, 在H-2期(抽穗期干旱)所有基因表達(dá)量較對(duì)照H-1期(抽穗期對(duì)照)均有明顯提高, 但在H-3 (抽穗期中等光照)和H-4 (抽穗期弱光照)條件下所有基因表達(dá)量都是下降的。說明抽穗期干旱誘導(dǎo)了所有基因的表達(dá), 抽穗期中等、弱光照抑制基因的表達(dá)。在灌漿期的各個(gè)處理下(F-1、F-2、F-3、F-4), 除了在F-2期(灌漿期)干旱表達(dá)量提升外, 其他所有基因在各處理下表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。說明灌漿期大部分基因在干旱、中等和弱光照處理下表達(dá)量下降, 揭示基因在灌漿期可能對(duì)干旱、中等光照以及弱光照響應(yīng)較弱。

圖3 不同物種PEPC蛋白的進(jìn)化關(guān)系

圖4 SiPEPC基因苗期逆境表達(dá)譜

圖中淺綠、深綠、黑色、淺紅、深紅5種顏色代表基因表達(dá)水平。綠色表示基因表達(dá)弱, 紅色表示基因表達(dá)強(qiáng)。

Light green, dark green, black, light red and dark red are used to represent gene expression levels. Green indicates weak gene expression; red indicates strong gene expression.

(圖5)

圖5 正常和干旱條件下SiPEPC基因在不同發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量

*表示在0.05水平上顯著; **表示在0.01水平上顯著。

* Significantly different at＜0.05; ** Significantly different at＜0.01.

圖6 光照和干旱條件下SiPEPC的相對(duì)表達(dá)量

圖中淺綠、深綠、黑色、淺紅、深紅五色代表基因表達(dá)水平。綠色表示基因表達(dá)弱, 紅色表示基因表達(dá)強(qiáng)。J-1: 拔節(jié)期對(duì)照; J-2: 拔節(jié)期干旱; J-3: 拔節(jié)期中等光照; J-4: 拔節(jié)期弱光照; H-1: 抽穗期對(duì)照; H-2: 抽穗期干旱; H-3: 抽穗期中等光照; H-4: 抽穗期弱光照; F-1: 灌漿期對(duì)照; F-2: 灌漿期干旱; F-3: 灌漿期中等光照; F-4: 灌漿期弱光照。

Light green, dark green, black, light red, and dark red are used to represent gene expression levels. Green indicates weak gene expression; red indicates strong gene expression. J-1: control at jointing stage; J-2: drought at jointing stage; J-3: medium light intensity at jointing stage; J-4: weak light intensity at jointing stage; H-1: control at heading stage; H-2: drought at heading stage; H-3: medium light intensity at heading stage; H-4: weak light intensity at heading stage; F-1: drought at filling stage; F-2: drought at filling stage; F-3: medium light intensity at filling stage; F-4: weak light intensity at filling stage.

3 討論

本研究在谷子基因組中檢索得到6個(gè)基因, 序列比對(duì)顯示, 谷子PEPC基因序列相似性很高, 揭示它們?cè)谶M(jìn)化上非常保守。系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)表明, 在單、雙子葉植物分離以前PEPC基因就已經(jīng)存在。進(jìn)化樹中谷子成員多與高粱、玉米成員緊密嵌合在一起, 而與擬南芥、馬鈴薯、花生、蓖麻、煙草成員相對(duì)較遠(yuǎn), 揭示了谷子與高粱、玉米親緣關(guān)系相對(duì)較近, 而與而與擬南芥、馬鈴薯、花生、蓖麻、煙草親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)。值得一提的是,基因由于在進(jìn)化過程中存在一些片段的插入和缺失, 而且在基因組成上含有20個(gè)內(nèi)含子, 遠(yuǎn)比其他基因內(nèi)含子數(shù)目多, 因此推測(cè)在功能上可能與其他基因有所不同。隨后的表達(dá)分析也證明了這一點(diǎn), 在所有表達(dá)譜分析中都檢測(cè)不到基因的表達(dá), 說明與其他基因在功能上有明顯不同, 可能參與了谷子生長(zhǎng)與發(fā)育中的其他信號(hào)途徑。另外在進(jìn)化樹中發(fā)現(xiàn)一些同源基因?qū)? 揭示這些同源基因?qū)赡苡晒餐嫦冗M(jìn)化而來, 另一方面也暗示它們?cè)谀承┬盘?hào)通路中可能具有相似的功能。

隨后本研究對(duì)谷子6個(gè)基因生物信息學(xué)特征進(jìn)行了系統(tǒng)的預(yù)測(cè)和分析, 期望能夠發(fā)現(xiàn)對(duì)于功能研究有幫助信息。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,成員很多性狀和參數(shù)非常接近類似, 比如亞細(xì)胞定位分析成員都主要被定位在細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體, 這些位置都是植物光合作用的關(guān)鍵位置, 揭示了基因可能在植物光合作用信號(hào)途徑中起比較重要作用。這些結(jié)論不僅驗(yàn)證了它們同屬PEPC基因家族, 而且預(yù)示不同基因可能共同參與或調(diào)控某些信號(hào)途徑。順式元件分析表明, 在啟動(dòng)子區(qū)域含有ABA、低溫、干旱和防御應(yīng)激反應(yīng)等順式元件。一般來講如果基因啟動(dòng)子區(qū)域存在某種順式元件則暗示該基因很可能參與相應(yīng)的信號(hào)途徑[33]。研究表明在非生物逆境, 比如干旱、鹽、低溫、高溫以及傷害等脅迫下會(huì)導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)的ABA水平升高, 而且眾所周知, ABA是在非生物逆境應(yīng)答中起重要作用的激素[34-36]。因此我們推測(cè)谷子家族基因很可能參與植物對(duì)非生物逆境脅迫的響應(yīng)。

Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果表明, 5個(gè)谷子基因在4種處理下其表達(dá)量有顯著變化, 除了幾乎所有基因表達(dá)量在4種脅迫處理過程中至少1個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有所上調(diào)。試驗(yàn)結(jié)果表明, 谷子家族基因廣泛參與了植物苗期非生物逆境脅迫應(yīng)答。本研究結(jié)果同已有關(guān)于PEPC在逆境應(yīng)答方面研究結(jié)果是相一致的[19-21]。為了進(jìn)一步了解在不同關(guān)鍵生育期干旱脅迫下的表達(dá)情況, 本研究檢測(cè)了成員在關(guān)鍵生育期(拔節(jié)期、抽穗期和灌漿期)干旱脅迫及不同光照強(qiáng)度(中等光照強(qiáng)度Ⅰ和弱光照強(qiáng)度Ⅱ)下的表達(dá)情況。如圖5所示, 試驗(yàn)結(jié)果表明基因成員不同處理下表達(dá)情況各有特點(diǎn)。例如在正常條件下在抽穗期、灌漿期表達(dá)量較拔節(jié)期均有明顯提升, 而在抽穗期表達(dá)下降, 在灌漿期表達(dá)明顯提升。在干旱脅迫下抽穗期、灌漿期表達(dá)較拔節(jié)期也有明顯提升,在灌漿期、抽穗期表達(dá)量呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì), 而呈現(xiàn)先降后升趨勢(shì)。結(jié)果揭示基因在正常生長(zhǎng)條件下隨著谷子生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程其表達(dá)趨勢(shì)增強(qiáng), 在不同生育期干旱脅迫下其表達(dá)量趨勢(shì)都明顯增加, 表明5個(gè)基因在不同生育期都參與了對(duì)干旱脅迫下的響應(yīng)。不同生育期干旱、不同光照處理下表達(dá)分析(圖6)表明, 所有基因在J-2期(拔節(jié)期干旱)表達(dá)量提高, 但在J-3期(拔節(jié)期中等光照)全部下降, 而在J-4期(拔節(jié)期弱光照)又全部上升。在H-2期(抽穗期干旱)所有基因表達(dá)量均有明顯提高, 但在H-3 (抽穗期中等光照) H-4 (抽穗期弱光照)條件下都是下降的。在灌漿期的各個(gè)處理下(F-1、F-2、F-3、F-4), 只有在F-2期(灌漿期)干旱表達(dá)量提升, 其他所有基因在各處理下表達(dá)量均呈下降趨勢(shì)。試驗(yàn)結(jié)果說明拔節(jié)期干旱和弱光條件能誘導(dǎo)基因的表達(dá), 抽穗期干旱誘導(dǎo)了所有基因的表達(dá), 灌漿期大部分基因在干旱、中等和弱光照處理下表達(dá)量下降,基因參與了拔節(jié)期和抽穗期的干旱脅迫響應(yīng), 不同光照強(qiáng)度影響基因在不同生育期的表達(dá), 弱光可誘導(dǎo)基因在拔節(jié)期的表達(dá)。光強(qiáng)對(duì)PEPC有調(diào)節(jié)作用, 穗期玉米遮陰后其葉片的PEPC活性顯著降低, 且隨光照強(qiáng)度的減弱而加劇, 穗期遮陰結(jié)束后PEPC活性能恢復(fù)到對(duì)照水平[37]。本研究結(jié)果只表明弱光可誘導(dǎo)基因在拔節(jié)期的表達(dá), 未出現(xiàn)隨光照強(qiáng)度的減弱而誘導(dǎo)加劇情況, 而在谷子抽穗期和灌漿期大部分基因沒有檢測(cè)到弱光能誘導(dǎo)PEPC表達(dá)的現(xiàn)象。這可能是谷子與玉米物種差別或是PEPC基因在不同生育期功能差別造成, 需要我們下一步詳盡的試驗(yàn)驗(yàn)證, 但是這些結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了順式元件分析結(jié)果, 證明了基因在植物逆境應(yīng)答中起一定作用。順式元件分析還顯示在基因啟動(dòng)子區(qū)域存在茉莉酸甲酯、水楊酸、赤霉素順式原件。研究表明病原體感染通常導(dǎo)致細(xì)胞中茉莉酸甲酯、水楊酸、乙烯等激素水平的增加[38], 因此推斷基因可能在生物應(yīng)激反應(yīng)中起一些作用。此外還發(fā)現(xiàn)了缺氧特異性誘導(dǎo)(GC-motif)、分生組織表達(dá)(CAT-box)、厭氧誘導(dǎo)必需(ARE)、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控(O2-site)、種子特異性調(diào)控(RY-element)、晝夜節(jié)律(circadian)等核心元件, 這些順式元件的存在暗示PEPC可能參與相應(yīng)的生理生化過程。需要注意的是在啟動(dòng)子區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了大量的光應(yīng)答元件, 眾所周知谷子是光溫敏感性作物, 而且PEPC是光合作用中的關(guān)鍵酶, 預(yù)示可能參與調(diào)控谷子的光溫應(yīng)答調(diào)控并在其中起重要作用。

本文報(bào)道的谷子基因也為進(jìn)一步闡明在谷子逆境應(yīng)答中的功能、機(jī)制提供了試驗(yàn)依據(jù)。盡管這些這些結(jié)論與推測(cè)需進(jìn)一步嚴(yán)謹(jǐn)詳盡的試驗(yàn)證明, 但是仍然為我們理解C4植物的關(guān)鍵酶PEPC在非生物逆境下的表達(dá)特征及光強(qiáng)對(duì)植物PEPC基因表達(dá)特性影響提供有益線索, 對(duì)深入了解C4植物光合特點(diǎn)對(duì)提高C3植物的光合效率和對(duì)C3植物的改造將具有一定意義。

4 結(jié)論

從谷子全基因組中鑒定出6個(gè)PEPC基因成員, 集中分布在谷子的1號(hào)、2號(hào)、4號(hào)、5號(hào)染色體上。所有蛋白序列高度保守, 都具有PEPC基因特征保守功能域PEPcase。谷子PEPC家族基因成員主要存在于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體。家族基因廣泛參與了谷子苗期非生物逆境脅迫應(yīng)答。成員參與了谷子在拔節(jié)、抽穗、灌漿期的干旱應(yīng)答, 而光照強(qiáng)度會(huì)嚴(yán)重影響基因在不同生育期的表達(dá)。

[1] Hibberd J M, Quick W P. Characteristics of C4 photosynthesis in stems and petioles of C3flowering plants.(London), 2002, 415: 451–454.

[2] Lara M V, Chuong S D X, Akhani H, Andreo S C, Edwards G E. Species Having C4single-cell-type photosynthesis in the chenopodiaceae family evolved a photosynthetic phosphoenolpyruvate carboxylase like that of kranz-type C4species., 2006, 142: 673–684.

[3] Merkelbach S, Gehlen J, Denecke M, Hirschet H J, Kreuzaler F. Cloning, sequence analysis and expression of a cDNA encoding active phosphoenolpyruvate carboxylase of the C3plant., 1993, 23: 881–888.

[4] Hart Y, Mayo A E, Milo R, Alon U. Robust control of PEP formation rate in the carbon fixation pathway of C4plants by a bi-functional enzyme., 2011, 5: 171.

[5] 魏紹巍, 黎茵. 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的功能及其在基因工程中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報(bào), 2011, 27: 1702–1710. Wei S W, Li Y. Functions of plant phosphoenolpyruvate carboxylase and its applications for genetic engineering., 2011, 27: 1702–1710 (in Chinese with English abstract).

[6] Lebouteiller B, Gousset-Dupont A, Pierre J N, Bleton J, Tchapla A, Maucourt M, Moing A, Rolin D, Vidal J. Physiological impacts of modulating phosphoenolpyruvate carboxylase levels in leaves and seeds of., 2007, 172: 265–272.

[7] Muramatsu M, Suzuki R, Yamazaki T, Miyao M. Comparison of plant-type phosphoenolpyruvate carboxylases from rice: identification of two plant-specific regulatory regions of the allosteric enzyme., 2015, 56: 468–480.

[8] Sanchez R, Cejudo F J. Identification and expression analysis of a gene encoding a bacterial-type phosphoenolpyruvate carboxylase fromand rice., 2003, 132: 949– 957.

[9] Dong L Y, Masuda T, Kawamura T, Hata S, Izui K. Cloning, expression, and characterization of a root-form phosphoenolpyruvate carboxylase from: comparison with the C4-form enzyme., 1998, 39: 865–873.

[10] Besnard G, Pincon G, Dhonta A, D'Hont A, Hoarau J Y, Cadet F, Offmann B. Characterisation of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene family in sugarcane (spp)., 2003, 107: 470–478.

[11] Sullivan S, Jenkins G I, Nimmo H G. Roots, cycles and leaves: Expression of the phosphoenolpyruvate carboxylase kinase gene family in soybean., 2004, 135: 2078–2087.

[12] 蔡小寧, 陳茜, 楊平, 任源浩. 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的生物信息學(xué)分析. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36: 914–916. Cai X N, Chen X, Yang P, Ren Y H. Bioinformatics analysis of phosphoenolpyruvate carboxylase., 2008, 36: 914–916 (in Chinese with English abstract).

[13] 焦進(jìn)安. 植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的多生理功能. 植物生理學(xué)通訊, 1987, (1): 40–43. Jiao J A. Multiple function of phosphoenolpyruvate carboxylase in plants., 1987, (1): 40–43 (in Chinese).

[14] Bandyopadhyay A, Datta K, Zhang J, Yang W, Raychaudhur S, Miyao M. Enhanced photosynthesis rate in genetically engineeredrice expressinggene cloned from maize.(Oxford), 2007, 172: 1204–1209.

[15] 丁在松, 周寶元, 孫雪芳, 趙明. 干旱脅迫下 PEPC 過表達(dá)增強(qiáng)水稻的耐強(qiáng)光能力. 作物學(xué)報(bào), 2012, 38: 285–292. Ding Z S, Zhou B Y, Sun X F, Zhao M. High light tolerance is enhanced by overexpressed PEPC in rice under drought stress., 2012, 38: 285–292 (in Chinese with English abstract).

[16] 焦德茂, 李霞, 黃雪清, 遲偉, 匡廷云, 古森本. 轉(zhuǎn)基因水稻的光合CO2同化和葉綠素?zé)晒馓匦? 科學(xué)通報(bào), 2001, 46: 414–418. Jiao D M, Li X, Huang X Q, Chi W, Kuang T Y, Gu S B. Photosynthetic CO2assimilation and chlorophyll fluorescence characteristics of transgenic PEPC rice., 2001, 46: 414–418 (in Chinese).

[17] 方立鋒, 丁在松, 趙明. 轉(zhuǎn)基因水稻苗期抗旱特性研究. 作物學(xué)報(bào), 2008, 34: 1220–1226. Fang L F, Ding Z S, Zhao M. Characteristics of drought tolerance inoverexpressed rice seedlings., 2008, 34: 1220–1226 (in Chinese with English abstract).

[18] Jeanneau M, Gerentes D, Foueillassar X, Zivy M, Vidal J, Toppan A, Perez P. Improvement of drought tolerance in maize: towards the functional validation of thegene and increase of water use efficiency by over-expressing C4-PEPC., 2002, 84: 1127–1135.

[19] Gonzalez M C, Sanchez R, Cejudo F J. Abiotic stresses affecting water balance induce phosphoenolpyruvate carboxylase expression in roots of wheat seedlings., 2003, 216: 985–992.

[20] Sanchez R, Flores A, Cejudo F J. Arabidopsis phosphoenolpyruvate carboxylase genes encode immunologically unrelated polypeptides and are differentially expressed in response to drought and salt stress., 2006, 223: 901–909.

[21] Garciá-Maurino S, Monreal J, Alvarez R, Vidal J, Echevarría C. Characterization of salt stress-enhanced phosphoenolpyruvate carboxylase kinase activity in leaves of sorghum vulgare: independence of osmotic stress, involvement of iontoxicity and significance of dark phosphorylation., 2003, 216: 648–655.

[22] 智慧, 牛振剛, 賈冠清, 柴楊, 李偉, 王永芳, 李海權(quán), 陸平, 白素蘭, 刁現(xiàn)民. 谷子干草飼用品質(zhì)性狀變異及相關(guān)性分析. 作物學(xué)報(bào), 2012, 38: 800–807. Zhi H, Niu Z G, Jia G Q, Chai Y, Li W, Wang Y F, Li H Q, Lu P, Bai S L, Diao X M. Variation and correlation analysis of hay forage quality traits of foxtail millet [(L.) Beauv.]., 2012, 38: 800–807 (in Chinese with English abstract).

[23] Devos K M, Wang Z M, Beales J, Sasaki T, Gale M D. Comparative genetic maps of foxtail millet () and rice ()., 1998, 96: 63–68.

[24] Jayaraman A, Puranik S, Rai N K, Vidapu S, Sahu P P, Lata C, Prasad M. cDNA-AFLP analysis reveals differential gene expression in response to salt stress in foxtail millet (L.)., 2008, 40: 241–251.

[25] 趙晉鋒, 余愛麗, 田崗, 杜艷偉, 郭二虎, 刁現(xiàn)民. 谷子CBL基因鑒定及其在干旱, 高鹽脅迫下的表達(dá)分析. 作物學(xué)報(bào), 2013, 39: 360–367. Zhao J F, Yu A L, Tian G, Du Y W, Guo E H, Diao X M. Identification of CBL genes from foxtail millet ([L.] Beauv.) and its expression under drought and salt stresses., 2013, 39: 360–367 (in Chinese with English abstract).

[26] Zhang G Y, Liu X, Quan Z W, Cheng S F, Xu X, Pan S K, Xie M, Zeng P, Yue Z, Wang W L, Tao Y, Bian C, Han C L, Xia Q J, Peng X H, Cao R, Yang X H, Zhan D L, Hu J C, Zhang Y X, Li H N, Li H, Li N, Wang J Y, Wang C C, Wang R Y, Guo T, Cai Y J, Liu C Z, Xiang H T, Shi Q X, Huang P, Chen Q C, Li Y R, Wang J, Zhao Z H, Wang J. Genome sequence of foxtail millet () provides insights into grass evolution and biofuel potential., 2012, 30: 549–554.

[27] Bennetzen J L, Schmutz J, Wang H, Percifield R, Hawkins J, Pontaroli A C, Estep M, Feng L, Vaughn J N, Grimwood J, Jen-kins J, Barry K, Lindquist E, Hellsten U, Deshpande S, Wang X W, Wu X M, Mitros T, Triplett J, Yang X H, Ye C Y, Mauro-herrera M, Wang L, Li P H, Sharma M, Sharma R, Ronald P C, Panaud O, Kellogg E A, Brutnell T P, Doust A N, Tuskan G A, Rokhsar D, Devos K M. Reference genome sequence of the model plant setaria., 2012, 30: 555–561.

[28] Shinozaki K, Yamaguchi-Shinozaki K. A novel-acting element in angene is involved in responsiveness to drought, low-temperature, or high-salt stress., 1994, 6: 251–264.

[29] Yu C S, Chen Y C, Lu C H, Hwang J K. Prediction of protein subcellular localization., 2006, 64: 643–651.

[30] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, Chenna R, Mcgettigan P A, McWilliam H, Valentin F, Wallace I M, Wilm A, Lopez R. Clustal W and Clustal X version 2.0., 2007, 23: 2947–2948.

[31] Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0., 2013, 30: 2725–2729.

[32] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCt., 2001, 25: 402–408.

[33] Narusaka Y, Nakashima K, Shinwari Z K, Sakuma Y, Furihata T, Abe H, Narusaka M, Shinozaki K, Yamaguchi-shinozaki K. Interaction between two-acting elements, ABRE and DRE, in ABA-dependent expression ofgene in response to dehydration and high-salinity stresses., 2003, 621: 137–148.

[34] Nakashima K, Yamaguchi-shinozaki K. ABA signaling in stress-response and seed development., 2013, 32: 959–970.

[35] Verma V, Ravindran P, Kumar P P. Plant hormone-mediated regulation of stress responses., 2016, 16: 86.

[36] Zhang J, Jia W, Yang J, Ismail A M. Role of ABA in integrating plant responses to drought and salt stresses., 2006, 97: 111–119.

[37] 張吉旺, 董樹亭, 王空軍, 胡昌浩, 劉鵬. 大田遮蔭對(duì)夏玉米光合特性的影響. 作物學(xué)報(bào), 2007, 33: 216–222. Zhang J W, Dong S T, Wang K J, Hu C H, Liu P. Effects of shading in field on photosynthetic characteristics in summer corn., 2007, 33: 216–222 (in Chinese with English abstract).

[38] Bari R, Jones J D. Role of plant hormones in plant defence responses., 2009, 69: 473–488.

Identification of PEPC genes from foxtail millet and its response to abiotic stress

ZHAO Jin-Feng**, DU Yan-Wei**, WANG Gao-Hong, LI Yan-Fang, ZHAO Gen-You, WANG Zhen-Hua, WANG Yu-Wen, and YU Ai-Li*

Millet Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences / Shanxi Key Laboratory of Genetic Resources and Breeding in Minor Crops, Changzhi 046011, Shanxi, China

Phosphoenolpyruvate carboxylase (PEPC) is a key enzyme in photosynthesis of C4plants and plays an important role in a variety of metabolic and stress pathways. In this study, we identified six candidate PEPC genes from foxtail millet genome via sequence alignment. The characteristic parameters of allprotein were very similar and the sequences were very conservative. Allgenes contained the PEPcase motif, which is the characteristic domain ofgene.were localized in cytoplasm, nucleus and mitochondrion. Promoter analysis identified a variety of light, hormonal, stress, and other growth-related cis-elements in the promoter sequences ofmembers. The qRT-PCR expression profiles showed that the fivegenes (,,,,) were induced by ABA, PEG, high salt and low temperature at seedling stage, indicating that fivegenes ate involved in abiotic signaling pathway at the seedling stage. The expression of fivegenes increased with the growth of foxtail millet under normal growth conditions, and increased significantly under drought stress at different growth stages, indicating that fiveare involved in drought stress response at jointing, heading and filling stages. The weak light at jointing stage could induce the expression of fivegenes, while the expression level decreased sharply under moderate light intensity at jointing stage, moderate and weak light intensity at heading and filling stages, showing that light intensity seriously affects the expression ofgenes.

foxtail millet; phosphoenolpyruvate carboxylase; abiotic stress; expression analysis

10.3724/SP.J.1006.2020.94107

本研究由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院項(xiàng)目(YGJPY2009, YGG17021, YCX2019T05), 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-06-13.5-A23)和國(guó)家農(nóng)業(yè)環(huán)境數(shù)據(jù)中心觀測(cè)檢測(cè)任務(wù)(ZX03S0410)項(xiàng)目資助。

This study was supported by the Project Plan of Shanxi Academy of Agricultural Sciences (YGJPY2009, YGG17021, YCX2019T05), the China Agricultural Research System (CARS-06-13.5-A23), and the National Agricultural Environmental Data Center Observation and Detection Mission (ZX03S0410).

余愛麗, E-mail: yuailimail@163.com, Tel: 0355-2204195

同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

趙晉鋒, E-mail: zhaojfmail@126.com, Tel: 0355-2204195

2019-07-24;

2020-01-15;

2020-02-14.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200214.1339.002.html