牦牛ACTA1基因啟動子區(qū)克隆、DNA甲基化與組織表達(dá)相關(guān)性分析

楊 勤，柴志欣，王吉坤，王 會，鐘金城

(西南民族大學(xué) 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

牦牛(Bosgrunniens)是分布于青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的特有且珍貴畜種，能適應(yīng)高寒、低氧、強(qiáng)紫外線等高原惡劣生態(tài)環(huán)境以生存和繁衍后代，能充分利用高寒牧草資源為高原牧民提供肉、乳、毛、皮、役用等生產(chǎn)生活資料[1]，是當(dāng)?shù)啬撩裰饕?jīng)濟(jì)來源。因此，開展牦牛遺傳資源保護(hù)與利用具有重要的科學(xué)和經(jīng)濟(jì)價值，研究其生長發(fā)育及其調(diào)控機(jī)理對充分發(fā)揮牦牛品種優(yōu)良特性和促進(jìn)牧區(qū)畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

α肌動蛋白1(Actin alpha 1，ACTA1)是肌動蛋白的一類異構(gòu)形式，是構(gòu)成骨骼肌收縮蛋白的重要成分，廣泛參與肌細(xì)絲組裝、骨骼肌纖維發(fā)育以及細(xì)胞和細(xì)胞器的運(yùn)動等生理活動[2]。研究表明，ACTA1基因突變與人類多種肌肉疾病密切相關(guān)，如骨骼肌先天性肌病、橫紋肌疾病、桿狀體肌病與蓋肌病等[3-7]。近年來，國內(nèi)外許多研究也對畜禽ACTA1基因進(jìn)行了報道。Swery等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ACTA1基因突變與斑馬的肌無力相關(guān)。Sibut等[9]研究表明，12月齡韓牛背最長肌中ACTA1基因表達(dá)水平顯著高于27月齡韓牛，ACTA1基因可能是調(diào)控韓牛肉質(zhì)性狀的重要基因。Shin等[10]研究顯示，ACTA1基因在韓牛低等級大理石花紋牛肉中表達(dá)量顯著高于高等級大理石花紋個體，ACTA1基因可能是影響肉質(zhì)性狀的候選基因。目前，有關(guān)ACTA1基因調(diào)控牦牛肉質(zhì)性狀的分子機(jī)制尚未見報道。

DNA甲基化即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)作用下，將S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)提供的甲基轉(zhuǎn)移到第5位胞嘧啶，而形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。發(fā)生DNA甲基化修飾的主要位點(diǎn)是CpG二核苷酸序列的胞嘧啶上[11]。在基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)卻能發(fā)生可遺傳的變化[12]。DNA甲基化與生物體內(nèi)重要基因表達(dá)調(diào)節(jié)密切相關(guān)，目前相關(guān)研究表明，DNA甲基化與基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，啟動子區(qū)和結(jié)構(gòu)基因的高甲基化與基因的表達(dá)存在一定的負(fù)相關(guān)，而啟動子區(qū)低甲基化與轉(zhuǎn)錄活性正相關(guān)[13]。經(jīng)證實(shí)，DNA甲基化在家畜生長發(fā)育過程中主要參與細(xì)胞新陳代謝活動以及眾多生長代謝和調(diào)控過程，與家畜肌肉生長發(fā)育和脂肪沉積等經(jīng)濟(jì)性狀密切相關(guān)[14]。

本試驗(yàn)以類烏齊牦牛、麥洼牦牛為研究對象，采用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測ACTA1基因在這2個牦牛群體各組織的表達(dá)差異；利用重亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite-sequencing PCR，BSP)檢測ACTA1基因在各組織的甲基化狀態(tài)，從表觀遺傳學(xué)角度分析ACTA1基因與牦牛肉質(zhì)性狀的相關(guān)性，旨在為進(jìn)一步揭示ACTA1基因?qū)﹃笈ＩL發(fā)育、肌肉發(fā)育等的調(diào)控作用，并為建立有效可靠的分子標(biāo)記等提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物與樣品采集

于西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣和四川省紅原縣分別選取3頭4.5歲類烏齊牦牛和麥洼牦牛，分別采集臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪6種組織，DEPC水清洗干凈，錫箔紙包裝后迅速置于液氮中保存，用于提取基因組DNA和總RNA。

1.2 主要試劑

TRIzol RNA提取試劑盒(Thermo)；血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN)；DNA純化回收試劑盒(TIANGEN)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis(Thermo Scientific)；瓊脂糖BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10(GENE COMPANYLTD)；DL2000 DNA Ladder(TaKaRa)；Loading Buffer(TaKaRa)；pMD19-T載體(TaKaRa)；DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN)；質(zhì)粒DNA提取試劑盒Plasmid Miniprep Plus Purification(GeneMark)；DNA甲基化處理試劑盒ZYMO EZ DNA Methylation-GoldTMKit(The Epigenetics companyTM)；Dream TaqTMGreen PCR Master Mix(2X)(Thermo Scientific)；Zymo TaqTMPremix(Epigenetics companyTM)；RNase-Free ddH2O(Thermo Scientific)。

1.3 組織樣核酸提取

1.3.1 組織總RNA提取及cDNA合成 利用TRIzol法提取組織總RNA，紫外分光光度計測定RNA樣品質(zhì)量和濃度(吸光度OD260/280)，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其完整性，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將提取的總RNA稀釋成200 ng/μL，分別取5 μL，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 基因組DNA提取與重亞硫酸氫鹽處理 利用DNA提取試劑盒提取麥洼牦牛、類烏齊牦牛各組織基因組DNA，紫外分光光度計測定DNA樣品的質(zhì)量和濃度(吸光度OD260/280)，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?yán)格按照DNA甲基化試劑盒說明書對基因組DNA 20 μL(DNA質(zhì)量為200 ～ 500 ng最適宜，不足20 μL應(yīng)加ddH2O補(bǔ)齊)進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計與合成

根據(jù)西南民族大學(xué)青藏高原研究院動物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室已有的牦牛ACTA1基因CDS區(qū)序列設(shè)計熒光定量引物ACTA1-qPCR，以β-actin作為內(nèi)參基因。根據(jù)ACTA1基因序列(GenBank： AC_000185)設(shè)計啟動子區(qū)PCR引物ACTA1-PCR，引物具體信息見表1。引物由Thermo(上海)公司合成。

表1 ACTA1-PCR引物

1.5 ACTA1基因啟動子區(qū)克隆、序列分析

以基因組DNA為模板，以ACTA1-PCR為引物進(jìn)行ACTA1基因啟動子區(qū)擴(kuò)增(25 μL體系)。凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果，試劑盒純化PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物。取1 μL膠回收產(chǎn)物與PUC載體pMD-19T于16 ℃過夜連接，然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布于Ampr/LB固體培養(yǎng)基平板；挑取單個菌落接種于含Ampr/LB液體培養(yǎng)基中。經(jīng)PCR鑒定后，將陽性重組質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)公司(成都)測序。

啟動子區(qū)克隆測序結(jié)果經(jīng)NCBI-Blast比對后，從NCBI數(shù)據(jù)庫搜集12個物種ACTA1基因啟動子區(qū)序列，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建不同物種間ACTA1基因啟動子區(qū)核苷酸序列進(jìn)化樹。在線軟件Methprimer(http：//www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi預(yù)測CPG島(圖1)。選擇長度為230 bp的 CpG1(-202～-431 bp、包含16個CG位點(diǎn))作為研究對象，并篩選ACTA1基因BSP引物ACTA1-P1(圖2)。如圖2所示，第一排為目的基因原序列，第二排為重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的序列，除CG位點(diǎn)外的C均轉(zhuǎn)化為T，P1-F/R為BSP引物。

圖1 ACTA1基因啟動子區(qū)CpG島預(yù)測

1.6 重亞硫酸鹽測序及分析

取重亞硫酸鹽處理后的DNA作為模板進(jìn)行BSP反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系(10 μL)：Zymo TaqTMPremix 25 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板4 μL，ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，最佳Tm 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 7 min。將PCR產(chǎn)物連接到載體PMD19-T，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，從平板上挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定，每個轉(zhuǎn)化板挑取至少10個陽性克隆，送擎科(成都)生物技術(shù)公司測序。使用Bio Analyzer 軟件分析測序結(jié)果；利用在線軟件MSR calculate(http://www.msrcall.com/ MSRcalcalate.aspx)繪制ACTA1基因甲基化位點(diǎn)棒棒糖模型。

圖2 ACTA1基因啟動子區(qū)序列及BSP擴(kuò)增區(qū)域示意圖

1.7 qRT-PCR定量分析類烏齊牦牛、麥洼牦牛ACTA1 mRNA表達(dá)

實(shí)時熒光定量 PCR以β-actin為內(nèi)參基因，對類烏齊牦牛、麥洼牦牛ACTA1基因mRNA在臀大肌、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脂肪6個組織中的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測。反應(yīng)體系(10 μL)：SYBR premix Dimer Eraser(2x)5 μL，ddH2O 3.2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL，cDNA 1 μL。反應(yīng)程序： 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，39個循環(huán)；添加熔解曲線。設(shè)置以ddH2O為模板的陰性對照，每個組織進(jìn)行3個技術(shù)重復(fù)，使用Bio-Rad 公司熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析。

1.8 數(shù)據(jù)分析與處理

采用2-ΔΔCt法對ACTA1基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析，所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，ACTA1基因mRNA相對表達(dá)豐度采用ANOVA方差分析和Turkey′s LSD檢驗(yàn)，所有結(jié)果當(dāng)P<0.05時，具有統(tǒng)計學(xué)意義。最后使用GraphPad Prism 5繪制ACTA1基因在類烏齊牦牛、麥洼牦牛不同組織的mRNA表達(dá)柱狀圖；甲基化程度和mRNA相對表達(dá)量的所有數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SEM)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ACTA1基因序列分析

經(jīng)克隆及測序獲得牦牛ACTA1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游及第一外顯子區(qū)域部分序列，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3-A所示，總長為1 028 bp，經(jīng)NCBI-Blast分析，與黃牛序列一致性為99.7%，其中A、T、G、C殘基含量分別為19.4%(199)，17.5%(180)，30.9%(318)，32.2%(331)，A+T的含量(36.9%)小于G+C(63.1%)。以重亞硫酸鹽處理后的DNA作為模板進(jìn)行ACTA1啟動子區(qū)，CpG1 BSP克隆及測序，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3-B所示。

M.DL2000分子質(zhì)量標(biāo)記； A(1-12).ACTA1基因啟動子PCR擴(kuò)增； B(1-12).ACTA1基因CpG1 PCR擴(kuò)增。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

以NJ法構(gòu)建ACTA1基因啟動子區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示，牦牛與黃牛聚為一支，親緣關(guān)系最近；水牛、綿羊、豬及犬各單獨(dú)占據(jù)一支，與牦牛親緣關(guān)系較近；兩棲綱的熱帶爪蟾與牦牛親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，說明哺乳動物ACTA1基因在長期生物進(jìn)化過程中高度保守(圖4)。

2.3 CpG島甲基化水平分析

利用在線軟件MSR Calcalate繪制各組織甲基化狀態(tài)的棒棒糖模型(圖5)。圖示每行代表一個陽性克隆測序和比對后的甲基化狀態(tài)，其中白色圓圈表示未被甲基化的CG位點(diǎn)，黑色圓圈表示被甲基化修飾的CG位點(diǎn)。結(jié)果顯示，ACTA1啟動子區(qū)CpG島在成年類烏齊牦牛和麥洼牦牛各組織中均表現(xiàn)為較低的甲基化狀態(tài)，且除肺臟組織外，其他各組織甲基化水平無顯著差異(P>0.05)，類烏齊牦牛臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟和脂肪的甲基化概率分別為6.25%，6.88%，20.00%，16.25%，26.25%，29.38%，麥洼牦牛臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟和脂肪的甲基化概率分別為5.00%，7.50%，18.13%，20.00%，26.25%，28.75%(表2)；，其中臀大肌的甲基化水平最低，脂肪組織的甲基化水平最高。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，第3，4，11，13位CG位點(diǎn)甲基化頻率分別為34.17%，42.50%，35.83%，35.83%，遠(yuǎn)高于其他CG位點(diǎn)。

圖4 ACTA1基因啟動子序列系統(tǒng)發(fā)育樹

A-F.類烏齊牦牛不同組織(臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪)； G-L.麥洼牦牛不同組織(臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪)。

2.4 qRT-PCR定量分析牦牛ACTA1 mRNA表達(dá)

熒光定量PCR結(jié)果顯示，ACTA1基因在類烏齊牦牛、麥洼牦牛各組織中均有表達(dá)，表達(dá)量存在一定差異。由表2可知，2個群體在臀大肌均呈現(xiàn)最高表達(dá)，顯著高于其他組織表達(dá)量(P<0.05)；其次在心臟的表達(dá)量較高，顯著高于腎臟、肺臟、肝臟、脂肪組織表達(dá)量(P<0.05)；而在腎臟、肺臟、肝臟、脂肪組織中的表達(dá)量依次降低，其中肺臟與腎臟和肝臟差異不顯著(P>0.05)，但三者均顯著高于脂肪(P<0.05)。相對表達(dá)量與DNA甲基化相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，ACTA1基因各組織表達(dá)量與DNA甲基化水平顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.797，P=0.002)(表2)。

表2 ACTA1基因在麥洼牦牛和類烏齊牦牛各組織的相對表達(dá)量及其CpG島甲基化程度

注：**表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)(P<0.01)。相同字母代表無顯著差異(P>0.05)；相異字母代表差異顯著(P<0.05)。

Note：**Indicates significant correlation at the 0.01 level (both sides) (P<0.01). Identical letters represent no significant differences (P>0.05); Distinct letters represent significant differences (P<0.05).

3 結(jié)論與討論

在動物生長發(fā)育過程中，DNA甲基化修飾對基因表達(dá)發(fā)揮重要作用[15]。最初，DNA甲基化在動物育種工作中的研究主要集中在雜交育種[16-17]、雄性不育[18-20]、胚胎移植[21-22]以及泌乳性能等方面[23]，近幾年，出現(xiàn)了少量有關(guān)DNA甲基化影響肌肉發(fā)育、脂肪沉積的研究報道。韓玉嬌[24]發(fā)現(xiàn) 6月齡秦川牛肌肉和脂肪組織中甲基化水平顯著低于24月齡秦川牛肌肉和脂肪組織中甲基化水平(P<0.01)，且甲基化水平與 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。房希碧[25]利用全基因組甲基化測序法和轉(zhuǎn)錄組測序法聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，日本和牛與草原紅牛背最長肌的147個基因DMRs甲基化水平與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，其中大部分基因可能通過 DNA 甲基化調(diào)控基因的表達(dá)水平，從而影響肉質(zhì)性狀。姚力丹等[26]分析5月齡巴什拜羊肌肉組織MSTN基因DNA甲基化和mRNA表達(dá)量的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)MSTN基因DNA甲基化與其表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。上述研究均證實(shí)了基因啟動子區(qū)域CpG島的甲基化程度與該基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[13]。DNA甲基化具有組織特異性、時間和空間特異性，即使同一個體在不同時期不同組織DNA甲基化狀態(tài)可能會相差迥異[27]。本研究在前期克隆了ACTA1基因編碼區(qū)及啟動子區(qū)的基礎(chǔ)上，檢測了各組織ACTA1mRNA在類烏齊牦牛和麥洼牦牛臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪各組織間表達(dá)水平差異，并利用重亞硫酸氫鹽測序法分析了各組織器官DNA甲基化水平，試圖尋找ACTA1基因甲基化模式與mRNA表達(dá)量間的聯(lián)系，為牦牛的表觀遺傳領(lǐng)域提供一定的數(shù)據(jù)支持。

相關(guān)研究證明，哺乳動物體內(nèi)的組織特異性基因CpG島通常呈現(xiàn)較低的甲基化狀態(tài)，其甲基化的CG位點(diǎn)往往為隨機(jī)分布，CpG島區(qū)域DNA甲基化修飾程度與mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)[28]，本研究結(jié)果顯示，ACTA1啟動子區(qū)CpG島在牦牛的各個組織中甲基化的CG位點(diǎn)隨機(jī)分布，且均表現(xiàn)為較低的甲基化水平。其中ACTA1基因在脂肪組織DNA甲基化水平最高，肌肉組織最低，其中類烏齊牦牛甲基化水平依次為：臀大肌<心臟<腎臟<肺臟<肝臟<脂肪，而麥洼牦牛甲基化水平依次為：臀大肌<心臟<肺臟<腎臟<肝臟<脂肪。ACTA1基因mRNA表達(dá)水平定量分析顯示在6個組織中均有表達(dá)，其中類烏齊牦牛和麥洼牦牛在臀大肌和心臟組織中的表達(dá)量均最高，在脂肪的表達(dá)量均最低，其表達(dá)量趨勢均為：臀大肌>心臟>腎臟(肺臟)>肝臟>脂肪。牦牛常年生活在平均海拔3 500 m以上的高寒草甸草場，飼養(yǎng)方式以自然放牧為主，牦牛善走陡坡險路、雪山沼澤、能渡江河等，其骨骼肌為適應(yīng)高強(qiáng)度運(yùn)動及代謝需求，臀大肌等骨骼肌肌纖維含量非常豐富且發(fā)達(dá)，因此，ACTA1mRNA表達(dá)量極顯著高于其他組織器官。此外，牦牛心臟ACTA1mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織，肌纖維含量豐富，有利于氧氣運(yùn)輸及氣體交換，在氧含量極低的高原環(huán)境也可為機(jī)體代謝活動供應(yīng)充足的氧氣。利用SPSS 19.0分析各組織ACTA1mRNA表達(dá)量與DNA甲基化水平相關(guān)性極顯著性，結(jié)果顯示，各組織表達(dá)量與DNA甲基化水平存在顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.796，P<0.01)，表明ACTA1基因啟動子區(qū)甲基化組織特異性較強(qiáng)。各組織DNA甲基化模式在類烏齊牦牛與麥洼牦牛間無顯著差異，推測是因?yàn)锳CTA1基因在長期生物進(jìn)化過程中高度保守，故其甲基化率在同一物種不同品種間無顯著差異，相關(guān)推測有待進(jìn)一步驗(yàn)證。ACTA1基因啟動子區(qū)CpG島區(qū)域具有一定的轉(zhuǎn)錄活性，且各組織間甲基化水平與組織特異性表達(dá)存在顯著負(fù)相關(guān)，2個品種間各組織甲基化水平無顯著差異，證明啟動子區(qū)域DNA甲基化對肌肉發(fā)育具有一定的調(diào)控作用，但影響基因表達(dá)的因素很多，可能還會涉及染色質(zhì)重塑、非編碼RNA、蛋白質(zhì)修飾等其他調(diào)控方式，因此，本研究結(jié)果僅可在表觀遺傳領(lǐng)域?yàn)殛笈＿z傳育種提供部分?jǐn)?shù)據(jù)支持。

本試驗(yàn)成功克隆了ACTA1基因啟動子區(qū)并構(gòu)建了13個物種間系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)牦牛與黃牛、羊的親緣關(guān)系最近，證明ACTA1基因在長期生物進(jìn)化過程中高度保守；對ACTA1基因啟動子區(qū)CpG1進(jìn)行DNA甲基化差異分析和mRNA表達(dá)水平檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ACTA1基因DNA甲基化與其表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)，臀大肌甲基化水平低于其他組織，其ACTA1mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織，脂肪組織與之相反，表明DNA甲基化對肌肉和脂肪發(fā)育具有一定的調(diào)控作用，可作為牦牛遺傳育種的表觀遺傳標(biāo)記的參考。