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      牦牛ACTA1基因啟動子區(qū)克隆、DNA甲基化與組織表達(dá)相關(guān)性分析

      2020-04-16 03:44:26柴志欣王吉坤鐘金城
      華北農(nóng)學(xué)報 2020年1期
      關(guān)鍵詞:肺臟牦牛甲基化

      楊 勤,柴志欣,王吉坤,王 會,鐘金城

      (西南民族大學(xué) 青藏高原動物遺傳資源保護(hù)與利用四川省、教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 成都 610041)

      牦牛(Bosgrunniens)是分布于青藏高原及其毗鄰的高山、亞高山地區(qū)的特有且珍貴畜種,能適應(yīng)高寒、低氧、強(qiáng)紫外線等高原惡劣生態(tài)環(huán)境以生存和繁衍后代,能充分利用高寒牧草資源為高原牧民提供肉、乳、毛、皮、役用等生產(chǎn)生活資料[1],是當(dāng)?shù)啬撩裰饕?jīng)濟(jì)來源。因此,開展牦牛遺傳資源保護(hù)與利用具有重要的科學(xué)和經(jīng)濟(jì)價值,研究其生長發(fā)育及其調(diào)控機(jī)理對充分發(fā)揮牦牛品種優(yōu)良特性和促進(jìn)牧區(qū)畜牧產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

      α肌動蛋白1(Actin alpha 1,ACTA1)是肌動蛋白的一類異構(gòu)形式,是構(gòu)成骨骼肌收縮蛋白的重要成分,廣泛參與肌細(xì)絲組裝、骨骼肌纖維發(fā)育以及細(xì)胞和細(xì)胞器的運(yùn)動等生理活動[2]。研究表明,ACTA1基因突變與人類多種肌肉疾病密切相關(guān),如骨骼肌先天性肌病、橫紋肌疾病、桿狀體肌病與蓋肌病等[3-7]。近年來,國內(nèi)外許多研究也對畜禽ACTA1基因進(jìn)行了報道。Swery等[8]研究發(fā)現(xiàn),ACTA1基因突變與斑馬的肌無力相關(guān)。Sibut等[9]研究表明,12月齡韓牛背最長肌中ACTA1基因表達(dá)水平顯著高于27月齡韓牛,ACTA1基因可能是調(diào)控韓牛肉質(zhì)性狀的重要基因。Shin等[10]研究顯示,ACTA1基因在韓牛低等級大理石花紋牛肉中表達(dá)量顯著高于高等級大理石花紋個體,ACTA1基因可能是影響肉質(zhì)性狀的候選基因。目前,有關(guān)ACTA1基因調(diào)控牦牛肉質(zhì)性狀的分子機(jī)制尚未見報道。

      DNA甲基化即在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)作用下,將S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)提供的甲基轉(zhuǎn)移到第5位胞嘧啶,而形成5-甲基胞嘧啶(5-mC)。發(fā)生DNA甲基化修飾的主要位點(diǎn)是CpG二核苷酸序列的胞嘧啶上[11]。在基因核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下,基因表達(dá)卻能發(fā)生可遺傳的變化[12]。DNA甲基化與生物體內(nèi)重要基因表達(dá)調(diào)節(jié)密切相關(guān),目前相關(guān)研究表明,DNA甲基化與基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),啟動子區(qū)和結(jié)構(gòu)基因的高甲基化與基因的表達(dá)存在一定的負(fù)相關(guān),而啟動子區(qū)低甲基化與轉(zhuǎn)錄活性正相關(guān)[13]。經(jīng)證實(shí),DNA甲基化在家畜生長發(fā)育過程中主要參與細(xì)胞新陳代謝活動以及眾多生長代謝和調(diào)控過程,與家畜肌肉生長發(fā)育和脂肪沉積等經(jīng)濟(jì)性狀密切相關(guān)[14]。

      本試驗(yàn)以類烏齊牦牛、麥洼牦牛為研究對象,采用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)技術(shù)檢測ACTA1基因在這2個牦牛群體各組織的表達(dá)差異;利用重亞硫酸氫鹽測序法(Bisulfite-sequencing PCR,BSP)檢測ACTA1基因在各組織的甲基化狀態(tài),從表觀遺傳學(xué)角度分析ACTA1基因與牦牛肉質(zhì)性狀的相關(guān)性,旨在為進(jìn)一步揭示ACTA1基因?qū)﹃笈IL發(fā)育、肌肉發(fā)育等的調(diào)控作用,并為建立有效可靠的分子標(biāo)記等提供理論依據(jù)。

      1 材料和方法

      1.1 試驗(yàn)動物與樣品采集

      于西藏自治區(qū)昌都市類烏齊縣和四川省紅原縣分別選取3頭4.5歲類烏齊牦牛和麥洼牦牛,分別采集臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪6種組織,DEPC水清洗干凈,錫箔紙包裝后迅速置于液氮中保存,用于提取基因組DNA和總RNA。

      1.2 主要試劑

      TRIzol RNA提取試劑盒(Thermo);血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN);DNA純化回收試劑盒(TIANGEN);反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis(Thermo Scientific);瓊脂糖BIOWEST REGULAR AGAROSE G-10(GENE COMPANYLTD);DL2000 DNA Ladder(TaKaRa);Loading Buffer(TaKaRa);pMD19-T載體(TaKaRa);DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN);質(zhì)粒DNA提取試劑盒Plasmid Miniprep Plus Purification(GeneMark);DNA甲基化處理試劑盒ZYMO EZ DNA Methylation-GoldTMKit(The Epigenetics companyTM);Dream TaqTMGreen PCR Master Mix(2X)(Thermo Scientific);Zymo TaqTMPremix(Epigenetics companyTM);RNase-Free ddH2O(Thermo Scientific)。

      1.3 組織樣核酸提取

      1.3.1 組織總RNA提取及cDNA合成 利用TRIzol法提取組織總RNA,紫外分光光度計測定RNA樣品質(zhì)量和濃度(吸光度OD260/280),通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其完整性,置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。將提取的總RNA稀釋成200 ng/μL,分別取5 μL,反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.3.2 基因組DNA提取與重亞硫酸氫鹽處理 利用DNA提取試劑盒提取麥洼牦牛、類烏齊牦牛各組織基因組DNA,紫外分光光度計測定DNA樣品的質(zhì)量和濃度(吸光度OD260/280),通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?yán)格按照DNA甲基化試劑盒說明書對基因組DNA 20 μL(DNA質(zhì)量為200 ~ 500 ng最適宜,不足20 μL應(yīng)加ddH2O補(bǔ)齊)進(jìn)行重亞硫酸氫鹽處理,-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.4 引物設(shè)計與合成

      根據(jù)西南民族大學(xué)青藏高原研究院動物遺傳育種與繁殖實(shí)驗(yàn)室已有的牦牛ACTA1基因CDS區(qū)序列設(shè)計熒光定量引物ACTA1-qPCR,以β-actin作為內(nèi)參基因。根據(jù)ACTA1基因序列(GenBank: AC_000185)設(shè)計啟動子區(qū)PCR引物ACTA1-PCR,引物具體信息見表1。引物由Thermo(上海)公司合成。

      表1 ACTA1-PCR引物

      1.5 ACTA1基因啟動子區(qū)克隆、序列分析

      以基因組DNA為模板,以ACTA1-PCR為引物進(jìn)行ACTA1基因啟動子區(qū)擴(kuò)增(25 μL體系)。凝膠電泳檢測擴(kuò)增結(jié)果,試劑盒純化PCR陽性擴(kuò)增產(chǎn)物。取1 μL膠回收產(chǎn)物與PUC載體pMD-19T于16 ℃過夜連接,然后轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,并涂布于Ampr/LB固體培養(yǎng)基平板;挑取單個菌落接種于含Ampr/LB液體培養(yǎng)基中。經(jīng)PCR鑒定后,將陽性重組質(zhì)粒送擎科生物技術(shù)公司(成都)測序。

      啟動子區(qū)克隆測序結(jié)果經(jīng)NCBI-Blast比對后,從NCBI數(shù)據(jù)庫搜集12個物種ACTA1基因啟動子區(qū)序列,利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建不同物種間ACTA1基因啟動子區(qū)核苷酸序列進(jìn)化樹。在線軟件Methprimer(http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi預(yù)測CPG島(圖1)。選擇長度為230 bp的 CpG1(-202~-431 bp、包含16個CG位點(diǎn))作為研究對象,并篩選ACTA1基因BSP引物ACTA1-P1(圖2)。如圖2所示,第一排為目的基因原序列,第二排為重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的序列,除CG位點(diǎn)外的C均轉(zhuǎn)化為T,P1-F/R為BSP引物。

      圖1 ACTA1基因啟動子區(qū)CpG島預(yù)測

      1.6 重亞硫酸鹽測序及分析

      取重亞硫酸鹽處理后的DNA作為模板進(jìn)行BSP反應(yīng),PCR反應(yīng)體系(10 μL):Zymo TaqTMPremix 25 μL,上、下游引物各1 μL(10 μmol/L),模板4 μL,ddH2O 19 μL。反應(yīng)程序:94 ℃ 10 min;94 ℃ 30 s,最佳Tm 30 s,72 ℃ 30 s,35個循環(huán);72 ℃ 7 min。將PCR產(chǎn)物連接到載體PMD19-T,并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞,從平板上挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定,每個轉(zhuǎn)化板挑取至少10個陽性克隆,送擎科(成都)生物技術(shù)公司測序。使用Bio Analyzer 軟件分析測序結(jié)果;利用在線軟件MSR calculate(http://www.msrcall.com/ MSRcalcalate.aspx)繪制ACTA1基因甲基化位點(diǎn)棒棒糖模型。

      圖2 ACTA1基因啟動子區(qū)序列及BSP擴(kuò)增區(qū)域示意圖

      1.7 qRT-PCR定量分析類烏齊牦牛、麥洼牦牛ACTA1 mRNA表達(dá)

      實(shí)時熒光定量 PCR以β-actin為內(nèi)參基因,對類烏齊牦牛、麥洼牦牛ACTA1基因mRNA在臀大肌、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脂肪6個組織中的表達(dá)水平進(jìn)行定量檢測。反應(yīng)體系(10 μL):SYBR premix Dimer Eraser(2x)5 μL,ddH2O 3.2 μL,上下游引物(10 μmol/L)各 0.4 μL,cDNA 1 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 10 s,39個循環(huán);添加熔解曲線。設(shè)置以ddH2O為模板的陰性對照,每個組織進(jìn)行3個技術(shù)重復(fù),使用Bio-Rad 公司熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析。

      1.8 數(shù)據(jù)分析與處理

      采用2-ΔΔCt法對ACTA1基因mRNA表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析,所得數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析,ACTA1基因mRNA相對表達(dá)豐度采用ANOVA方差分析和Turkey′s LSD檢驗(yàn),所有結(jié)果當(dāng)P<0.05時,具有統(tǒng)計學(xué)意義。最后使用GraphPad Prism 5繪制ACTA1基因在類烏齊牦牛、麥洼牦牛不同組織的mRNA表達(dá)柱狀圖;甲基化程度和mRNA相對表達(dá)量的所有數(shù)據(jù)均采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SEM)”表示。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 ACTA1基因序列分析

      經(jīng)克隆及測序獲得牦牛ACTA1基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游及第一外顯子區(qū)域部分序列,瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3-A所示,總長為1 028 bp,經(jīng)NCBI-Blast分析,與黃牛序列一致性為99.7%,其中A、T、G、C殘基含量分別為19.4%(199),17.5%(180),30.9%(318),32.2%(331),A+T的含量(36.9%)小于G+C(63.1%)。以重亞硫酸鹽處理后的DNA作為模板進(jìn)行ACTA1啟動子區(qū),CpG1 BSP克隆及測序,瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果如圖3-B所示。

      M.DL2000分子質(zhì)量標(biāo)記; A(1-12).ACTA1基因啟動子PCR擴(kuò)增; B(1-12).ACTA1基因CpG1 PCR擴(kuò)增。

      2.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

      以NJ法構(gòu)建ACTA1基因啟動子區(qū)系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示,牦牛與黃牛聚為一支,親緣關(guān)系最近;水牛、綿羊、豬及犬各單獨(dú)占據(jù)一支,與牦牛親緣關(guān)系較近;兩棲綱的熱帶爪蟾與牦牛親緣關(guān)系最遠(yuǎn),說明哺乳動物ACTA1基因在長期生物進(jìn)化過程中高度保守(圖4)。

      2.3 CpG島甲基化水平分析

      利用在線軟件MSR Calcalate繪制各組織甲基化狀態(tài)的棒棒糖模型(圖5)。圖示每行代表一個陽性克隆測序和比對后的甲基化狀態(tài),其中白色圓圈表示未被甲基化的CG位點(diǎn),黑色圓圈表示被甲基化修飾的CG位點(diǎn)。結(jié)果顯示,ACTA1啟動子區(qū)CpG島在成年類烏齊牦牛和麥洼牦牛各組織中均表現(xiàn)為較低的甲基化狀態(tài),且除肺臟組織外,其他各組織甲基化水平無顯著差異(P>0.05),類烏齊牦牛臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟和脂肪的甲基化概率分別為6.25%,6.88%,20.00%,16.25%,26.25%,29.38%,麥洼牦牛臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟和脂肪的甲基化概率分別為5.00%,7.50%,18.13%,20.00%,26.25%,28.75%(表2);,其中臀大肌的甲基化水平最低,脂肪組織的甲基化水平最高。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),第3,4,11,13位CG位點(diǎn)甲基化頻率分別為34.17%,42.50%,35.83%,35.83%,遠(yuǎn)高于其他CG位點(diǎn)。

      圖4 ACTA1基因啟動子序列系統(tǒng)發(fā)育樹

      A-F.類烏齊牦牛不同組織(臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪); G-L.麥洼牦牛不同組織(臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪)。

      2.4 qRT-PCR定量分析牦牛ACTA1 mRNA表達(dá)

      熒光定量PCR結(jié)果顯示,ACTA1基因在類烏齊牦牛、麥洼牦牛各組織中均有表達(dá),表達(dá)量存在一定差異。由表2可知,2個群體在臀大肌均呈現(xiàn)最高表達(dá),顯著高于其他組織表達(dá)量(P<0.05);其次在心臟的表達(dá)量較高,顯著高于腎臟、肺臟、肝臟、脂肪組織表達(dá)量(P<0.05);而在腎臟、肺臟、肝臟、脂肪組織中的表達(dá)量依次降低,其中肺臟與腎臟和肝臟差異不顯著(P>0.05),但三者均顯著高于脂肪(P<0.05)。相對表達(dá)量與DNA甲基化相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),ACTA1基因各組織表達(dá)量與DNA甲基化水平顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.797,P=0.002)(表2)。

      表2 ACTA1基因在麥洼牦牛和類烏齊牦牛各組織的相對表達(dá)量及其CpG島甲基化程度

      注:**表示在0.01水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)(P<0.01)。相同字母代表無顯著差異(P>0.05);相異字母代表差異顯著(P<0.05)。

      Note:**Indicates significant correlation at the 0.01 level (both sides) (P<0.01). Identical letters represent no significant differences (P>0.05); Distinct letters represent significant differences (P<0.05).

      3 結(jié)論與討論

      在動物生長發(fā)育過程中,DNA甲基化修飾對基因表達(dá)發(fā)揮重要作用[15]。最初,DNA甲基化在動物育種工作中的研究主要集中在雜交育種[16-17]、雄性不育[18-20]、胚胎移植[21-22]以及泌乳性能等方面[23],近幾年,出現(xiàn)了少量有關(guān)DNA甲基化影響肌肉發(fā)育、脂肪沉積的研究報道。韓玉嬌[24]發(fā)現(xiàn) 6月齡秦川牛肌肉和脂肪組織中甲基化水平顯著低于24月齡秦川牛肌肉和脂肪組織中甲基化水平(P<0.01),且甲基化水平與 mRNA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。房希碧[25]利用全基因組甲基化測序法和轉(zhuǎn)錄組測序法聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn),日本和牛與草原紅牛背最長肌的147個基因DMRs甲基化水平與基因表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),其中大部分基因可能通過 DNA 甲基化調(diào)控基因的表達(dá)水平,從而影響肉質(zhì)性狀。姚力丹等[26]分析5月齡巴什拜羊肌肉組織MSTN基因DNA甲基化和mRNA表達(dá)量的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)MSTN基因DNA甲基化與其表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)。上述研究均證實(shí)了基因啟動子區(qū)域CpG島的甲基化程度與該基因的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[13]。DNA甲基化具有組織特異性、時間和空間特異性,即使同一個體在不同時期不同組織DNA甲基化狀態(tài)可能會相差迥異[27]。本研究在前期克隆了ACTA1基因編碼區(qū)及啟動子區(qū)的基礎(chǔ)上,檢測了各組織ACTA1mRNA在類烏齊牦牛和麥洼牦牛臀大肌、心臟、腎臟、肺臟、肝臟、脂肪各組織間表達(dá)水平差異,并利用重亞硫酸氫鹽測序法分析了各組織器官DNA甲基化水平,試圖尋找ACTA1基因甲基化模式與mRNA表達(dá)量間的聯(lián)系,為牦牛的表觀遺傳領(lǐng)域提供一定的數(shù)據(jù)支持。

      相關(guān)研究證明,哺乳動物體內(nèi)的組織特異性基因CpG島通常呈現(xiàn)較低的甲基化狀態(tài),其甲基化的CG位點(diǎn)往往為隨機(jī)分布,CpG島區(qū)域DNA甲基化修飾程度與mRNA表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)[28],本研究結(jié)果顯示,ACTA1啟動子區(qū)CpG島在牦牛的各個組織中甲基化的CG位點(diǎn)隨機(jī)分布,且均表現(xiàn)為較低的甲基化水平。其中ACTA1基因在脂肪組織DNA甲基化水平最高,肌肉組織最低,其中類烏齊牦牛甲基化水平依次為:臀大肌<心臟<腎臟<肺臟<肝臟<脂肪,而麥洼牦牛甲基化水平依次為:臀大肌<心臟<肺臟<腎臟<肝臟<脂肪。ACTA1基因mRNA表達(dá)水平定量分析顯示在6個組織中均有表達(dá),其中類烏齊牦牛和麥洼牦牛在臀大肌和心臟組織中的表達(dá)量均最高,在脂肪的表達(dá)量均最低,其表達(dá)量趨勢均為:臀大肌>心臟>腎臟(肺臟)>肝臟>脂肪。牦牛常年生活在平均海拔3 500 m以上的高寒草甸草場,飼養(yǎng)方式以自然放牧為主,牦牛善走陡坡險路、雪山沼澤、能渡江河等,其骨骼肌為適應(yīng)高強(qiáng)度運(yùn)動及代謝需求,臀大肌等骨骼肌肌纖維含量非常豐富且發(fā)達(dá),因此,ACTA1mRNA表達(dá)量極顯著高于其他組織器官。此外,牦牛心臟ACTA1mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織,肌纖維含量豐富,有利于氧氣運(yùn)輸及氣體交換,在氧含量極低的高原環(huán)境也可為機(jī)體代謝活動供應(yīng)充足的氧氣。利用SPSS 19.0分析各組織ACTA1mRNA表達(dá)量與DNA甲基化水平相關(guān)性極顯著性,結(jié)果顯示,各組織表達(dá)量與DNA甲基化水平存在顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.796,P<0.01),表明ACTA1基因啟動子區(qū)甲基化組織特異性較強(qiáng)。各組織DNA甲基化模式在類烏齊牦牛與麥洼牦牛間無顯著差異,推測是因?yàn)锳CTA1基因在長期生物進(jìn)化過程中高度保守,故其甲基化率在同一物種不同品種間無顯著差異,相關(guān)推測有待進(jìn)一步驗(yàn)證。ACTA1基因啟動子區(qū)CpG島區(qū)域具有一定的轉(zhuǎn)錄活性,且各組織間甲基化水平與組織特異性表達(dá)存在顯著負(fù)相關(guān),2個品種間各組織甲基化水平無顯著差異,證明啟動子區(qū)域DNA甲基化對肌肉發(fā)育具有一定的調(diào)控作用,但影響基因表達(dá)的因素很多,可能還會涉及染色質(zhì)重塑、非編碼RNA、蛋白質(zhì)修飾等其他調(diào)控方式,因此,本研究結(jié)果僅可在表觀遺傳領(lǐng)域?yàn)殛笈_z傳育種提供部分?jǐn)?shù)據(jù)支持。

      本試驗(yàn)成功克隆了ACTA1基因啟動子區(qū)并構(gòu)建了13個物種間系統(tǒng)發(fā)育樹,發(fā)現(xiàn)牦牛與黃牛、羊的親緣關(guān)系最近,證明ACTA1基因在長期生物進(jìn)化過程中高度保守;對ACTA1基因啟動子區(qū)CpG1進(jìn)行DNA甲基化差異分析和mRNA表達(dá)水平檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),ACTA1基因DNA甲基化與其表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān),臀大肌甲基化水平低于其他組織,其ACTA1mRNA表達(dá)量顯著高于其他組織,脂肪組織與之相反,表明DNA甲基化對肌肉和脂肪發(fā)育具有一定的調(diào)控作用,可作為牦牛遺傳育種的表觀遺傳標(biāo)記的參考。

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