葡聚糖包裹超順磁性氧化鐵納米材料用于關(guān)節(jié)軟骨磁共振T2-Map成像研究

楊濱羽，羅霞，劉佳伶，何淼，李偲羽，嚴(yán)浩吉，吳君

(1.川北醫(yī)學(xué)院影像學(xué)院醫(yī)學(xué)影像診斷專業(yè)，四川 南充 637000；2.川北醫(yī)學(xué)院影像學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程教研室，四川 南充 637000)

1 引 言

磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)成像造影劑是一種在磁共振掃描過(guò)程中為了增強(qiáng)掃描效果從而更清楚分辯組織的順磁物質(zhì)。粒徑小于20 nm的磁性氧化鐵粒子在外加磁場(chǎng)下即具有超順磁性[1]，稱為超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxid，SPIO)納米顆粒，是一種良好的MRI造影劑[2]，主要用于T2-Map成像。葡聚糖是一種具有良好水溶性及生物相容性的低聚糖，經(jīng)過(guò)葡聚糖表面修飾的SPIO顆粒更加穩(wěn)定，不易發(fā)生團(tuán)聚[3-4]，在MRI成像過(guò)程中的增強(qiáng)效果更優(yōu)異。關(guān)節(jié)軟骨是一種具有彈性的結(jié)締組織，幾乎無(wú)血管系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)和神經(jīng)的分布。其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)只能依靠關(guān)節(jié)在伸展或放松時(shí)外力擠壓進(jìn)出。為尋找一種能有效進(jìn)入關(guān)節(jié)軟骨并具有良好增強(qiáng)對(duì)比能力的MRI造影劑，本研究選取體重在3～3.5 kg的6月齡新西蘭白兔(n=3)，將SPIO材料經(jīng)過(guò)葡聚糖修飾后，經(jīng)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射，并進(jìn)行磁共振增強(qiáng)成像以及組織學(xué)檢測(cè)，得出該種材料對(duì)于關(guān)節(jié)軟骨在磁共振T2-Map成像上的適用性，從而在選擇造影劑對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨的T2-Map成像上提供更多思路。

2 實(shí)驗(yàn)材料及原理

2.1 材料制備

2.1.1主要原料和試劑 葡聚糖(Mw=70 000)，上海生工生物工程公司；FeCl3·6H2O、 FeCl2·4H2O，阿拉丁；濃氨水、檸檬酸、檸檬酸鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

2.1.2分析測(cè)試儀器 納米粒度-電位檢測(cè)儀，Zetasizer Nano ZS，英國(guó) Malvern 公司；掃描電子顯微鏡，S-4800，Hitachi；原子吸收光譜儀，AA800, Perkin-Elmer，US；NIKONECLIPSE80i共聚焦熒光顯微鏡。

2.1.3葡聚糖包裹的SPIO材料合成 取10.015 g葡聚糖置于50 mL的三口燒瓶中，加入20 mL純水，在超聲下使其溶解。然后加入0.697 g FeCl3·6H2O。在惰性氣體保護(hù)下將 0.282 g FeCl2·4H2O加入上述溶液中，待其完全溶解后將三口瓶置于冰浴中，在快速攪拌下緩慢滴加1 mL濃氨水(25%～28%)，繼續(xù)攪拌5 min后撤去冰浴,轉(zhuǎn)為油浴加熱。待反應(yīng)體系溫度達(dá)到 80 ℃后,恒溫95 min[5]。反應(yīng)停止后，使其自然冷卻至室溫，5 000 rcf下離心15 min除去大顆粒。離心結(jié)束后，取上清液，用十萬(wàn)分子量的透析袋在檸檬酸鈉緩沖液中透析2 d，然后濃縮至合適濃度待用。

2.1.4葡聚糖SPIO材料的鐵濃度測(cè)定 通過(guò)設(shè)置對(duì)照，配置標(biāo)準(zhǔn)溶液并測(cè)定出線性相關(guān)系數(shù)大于0.999的吸光度與鐵濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線值。再取一定體積制備好的葡聚糖SPIO材料，加入王水稀釋，通過(guò)原子吸收光譜儀測(cè)定稀釋后的樣品濃度，并計(jì)算出母液樣品濃度。最終計(jì)算出葡聚糖包裹的SPIO材料鐵濃度為 5.512 mg/mL，經(jīng)生理鹽水稀釋至0.05 mg/mL備用。

2.1.5葡聚糖SPIO納米顆粒的表征測(cè)定 用去離子水稀釋葡聚糖SPIO納米顆粒溶液，吸取1 mL溶液于石英皿中，使用納米粒度-電位檢測(cè)儀對(duì)納米顆粒的形貌及其粒徑分布進(jìn)行檢測(cè)。再吸取50 μL稀釋后的溶液滴至單晶硅表面，室溫下自然揮發(fā)，然后將其置于日立S-4800掃描電鏡下進(jìn)行觀察。分別通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering ，DLS)和掃描電鏡進(jìn)行觀察分析，見(jiàn)圖1，葡聚糖SPIO納米顆粒的平均粒徑為(18.0 ± 8) nm ，且均勻分散，粒徑分布窄。

圖1葡聚糖氧化鐵納米顆粒的粒徑分布及掃描電鏡圖

Fig.1Size distribution and SEM of dextran-coated SPIO nanomaterials

2.2 葡聚糖SPIO材料體外MRI

磁共振成像造影劑用于增強(qiáng)影像觀察效果，而葡聚糖SPIO材料作為T2造影劑的主要機(jī)制是縮短T2弛豫時(shí)間。為了更加客觀地描述該材料的作用效果，我們引入“弛豫效能”(relaxivity, r)這一概念[6]。

(1)

其中，r2表示造影劑T2弛豫效能；obs表示該造影劑某濃度下實(shí)際測(cè)得的弛豫率，即弛豫時(shí)間倒數(shù)；d表示組織中抗磁性物質(zhì)的弛豫率，可認(rèn)為是常數(shù)；[CA]表示造影劑濃度。

在3.0T臨床磁共振上對(duì)葡聚糖包裹的SPIO進(jìn)行體外磁共振T2WI成像，測(cè)量其弛豫效能。配置不同濃度的樣品，通過(guò)數(shù)據(jù)擬合得到每種濃度樣品的T2弛豫時(shí)間。然后再通過(guò)T2弛豫率與Fe濃度做線性擬合，計(jì)算出葡聚糖包裹的SPIO納米材料的T2弛豫效能為57(s-1mM-1)，見(jiàn)圖2。

2.3 T2-Map設(shè)計(jì)與算法

圖2 (a).橫向弛豫效能r2在3.0T下是57(s-1mM-1);(b).T2WI和T2(ms)

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 造影劑對(duì)軟骨T2-Map成像的效果

在兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)直接注射制備的0.5 mg/mL葡聚糖SPIO材料0.25 mL，并進(jìn)行磁共振掃描，對(duì)取得的T2加權(quán)圖像進(jìn)行處理得到T2-Map，應(yīng)用matlab進(jìn)行圖像后處理，得到軟骨的局部偽彩圖并進(jìn)行定量分析，見(jiàn)圖3。

圖3軟骨T2-Map偽彩圖

Fig.3Pseudo-color diagram of cartilage T2-Map

將0 h(control)與24 h的T2-Map和3D-curve對(duì)照并進(jìn)行比較，相比0 h，24 h中的色階整體的藍(lán)色更深，表明圖像中顯示的T2值有了較明顯的下降，由此可得，在24 h內(nèi)，葡聚糖SPIO材料進(jìn)入了軟骨內(nèi)且尚未完全被排出至細(xì)胞外基質(zhì)之外[9]。由于2次MRI成像的定位不易保持在同一層面上，所以部分異常信號(hào)帶未出現(xiàn)在同一位置。

3.2 組織學(xué)驗(yàn)證

三價(jià)鐵離子可在酸性亞鐵氰化鉀溶液中產(chǎn)生普魯士蘭(Fe4[Fe(CN)6]3)反應(yīng)，能夠通過(guò)組織切片有效檢測(cè)出葡聚糖SPIO材料在軟骨內(nèi)的分布情況。在24 h掃描結(jié)束后，將3只實(shí)驗(yàn)兔行耳靜脈注射空氣法處死，取出股骨髁，做矢狀面切片，經(jīng)普魯士蘭染色，送至成都里來(lái)生物公司處理完成。

4 結(jié)果與分析

4.1 軟骨T2弛豫時(shí)間的分析

3組兔膝關(guān)節(jié)腔(n=3)注射了18 nm葡聚糖SPIO后，對(duì)其進(jìn)行MRI增強(qiáng)掃描并定量分析。

見(jiàn)圖4，計(jì)算關(guān)節(jié)軟骨T2的均值與標(biāo)準(zhǔn)差，軟骨24 h對(duì)應(yīng)的T2值低于0 h(control)對(duì)應(yīng)的T2值，表明24 h內(nèi)，葡聚糖SPIO材料進(jìn)入了軟骨內(nèi)且尚未完全被排出至細(xì)胞外基質(zhì)之外。

圖4 軟骨T2值減少

4.2 組織學(xué)分析

經(jīng)普魯士藍(lán)鐵染色發(fā)現(xiàn)，注射造影劑后24 h，軟骨內(nèi)仍然存在著 SPIO 。鏡檢發(fā)現(xiàn)注射的 SPIO 造影劑在軟骨細(xì)胞的陷窩中和軟骨基質(zhì)內(nèi)均存在藍(lán)染顆粒(見(jiàn)圖5中箭頭所指))，這說(shuō)明軟骨細(xì)胞的攝取作用對(duì)造影劑有很大影響。由于 SPIO 是滲透進(jìn)入軟骨，而軟骨層很薄，約在0.2 mm左右。假設(shè)均勻分布到整個(gè)軟骨面(約100 mm×100 mm)，切片厚度 4 μm (矢狀面切片)，因?yàn)檐浌鞘菬o(wú)血管的，不像肝臟等有血管組織會(huì)密集分布 SPIO，所以在單張切片上 SPIO 即使有也不會(huì)很多。故僅可在部分切片中觀察到軟骨細(xì)胞陷窩內(nèi)和基質(zhì)中含有藍(lán)染顆粒。

圖5 兔膝關(guān)節(jié)軟骨普魯士藍(lán)染色

組織學(xué)普魯士藍(lán)染色證明了本研究制備的18 nm粒徑葡聚糖包裹的SPIO顆?？梢詽B透入兔膝關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)。

5 結(jié)論

關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)無(wú)神經(jīng)血管分布，關(guān)節(jié)囊分泌的滑液是軟骨獲取營(yíng)養(yǎng)成分及物質(zhì)代謝的重要途經(jīng)。在關(guān)節(jié)活動(dòng)過(guò)程中，本研究制備的SPIO顆粒依靠滑液的運(yùn)輸以及機(jī)械擠壓作用進(jìn)入軟骨基質(zhì)，經(jīng)軟骨細(xì)胞吞噬，24 h后行組織學(xué)染色發(fā)現(xiàn)仍有殘留。在進(jìn)一步靶向SPIO納米顆粒評(píng)估骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的研究中，發(fā)現(xiàn)注射SPIO造影劑96 h后，軟骨細(xì)胞內(nèi)仍有蓄積，這很可能與軟骨細(xì)胞的胞飲作用有關(guān)，這一點(diǎn)在本研究和后續(xù)的研究結(jié)果與Rothenfluh等的研究結(jié)果一致[10]，同時(shí)進(jìn)入軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的SPIO顆粒最終經(jīng)機(jī)械擠壓模式將異物以基質(zhì)-滑液-淋巴引流的代謝途徑排出。超順磁性氧化鐵顆粒最初用于靜脈給藥的增強(qiáng)磁共振T2-Map成像，在近年研究中主要用于心肝腎等器官，脈管、神經(jīng)等系統(tǒng)的活體示蹤，藥物靶向研究，干細(xì)胞培養(yǎng)等[11-15]，在軟骨部位一般用于軟骨細(xì)胞的SPIO標(biāo)記，在體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞并移植到軟骨層進(jìn)行組織修復(fù)方面的研究，或通過(guò)靜脈注射釓類造影劑進(jìn)行軟骨增強(qiáng)磁共振成像[16]，直接用于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射SPIO造影劑進(jìn)行軟骨磁共振增強(qiáng)成像的研究較少。

本研究制備了粒徑(18 ± 2) nm的葡聚糖包裹的超順磁性氧化鐵納米顆粒，作為磁共振T2造影劑，對(duì)兔關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行增強(qiáng)MRI掃描。該材料被注射關(guān)節(jié)腔前后24 h，分析得出軟骨的T2弛豫時(shí)間均下降。進(jìn)行組織病理學(xué)普魯士蘭染色，發(fā)現(xiàn)軟骨基質(zhì)及細(xì)胞內(nèi)均有氧化鐵納米顆粒的存在，說(shuō)明葡聚糖包裹SPIO納米材料可應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨磁共振增強(qiáng)成像。為下一步的SPIO納米顆粒載藥系統(tǒng)，即診療一體化磁共振探針的設(shè)計(jì)奠定了基礎(chǔ)，為骨關(guān)節(jié)炎軟骨退變的診斷及治療提供更多思路。