玉米種子內(nèi)部擬輪枝鐮孢菌抗性的QTL定位

馬培培，周子鍵，赫可偉，宋云霞，吳建宇

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

玉米種子是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中重要的生產(chǎn)資料之一，種子的質(zhì)量是確保農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要前提和基礎(chǔ)。到目前為止，發(fā)芽率和純度被認為是種子質(zhì)量的主要指標。帶菌種子會縮短其貯藏時間，造成種子劣變，發(fā)芽率降低，引起苗期病害，此外種子所攜帶病菌也是許多病害的初侵染源[1-3]。擬輪枝鐮孢菌(Fusariumverticillioides)是玉米重要的種傳病原真菌之一，嚴重影響玉米產(chǎn)量和人畜安全。種子表面的病原菌可以通過消毒和包衣控制，然而種內(nèi)潛伏的擬輪枝鐮孢菌很難通過化學(xué)防控的方法解決[4]。因此，研究玉米種子內(nèi)部對擬輪枝鐮孢菌的抗性機制，挖掘、利用抗病基因資源并選育相應(yīng)的抗病品種，具有重要的理論和生產(chǎn)意義。

針對玉米種子的抗性，一些遺傳研究工作相繼被報道。張繼敏[5]對玉米接種黃曲霉，通過對重組自交系(Recombinant inbred line，RIL)群體進行連鎖分析，檢測到6個玉米黃曲霉的抗性QTL(Quantitative trait loci)，分別位于第4、5、6、8、10號染色體。OUNOLA等[6]通過連鎖和關(guān)聯(lián)作圖研究玉米Lipoxygenases(LOXs)基因?qū)S曲霉毒素積累的影響，共鑒定出13個位點。琚銘[7]利用RIL群體通過種子浸泡菌液法接種，在3個環(huán)境進行抗性鑒定，定位出8個QTL，其中有5個QTL與已報道的玉米穗腐病抗性QTL位點一致，另外3個QTL是種子抗性所特有的。這些研究都集中在種子對外部擬輪枝鐮孢菌的抗性上，關(guān)于種子內(nèi)部對擬輪枝鐮孢菌的抗性研究鮮有報道。為此，以玉米RIL群體為試驗材料，創(chuàng)造攜帶擬輪枝鐮孢菌的種子并于室內(nèi)培養(yǎng)，以發(fā)病等級為指標，對玉米種子內(nèi)部抗擬輪枝鐮孢菌QTL進行定位，旨在進一步闡述玉米種子抗病機制，比較玉米種內(nèi)與種外抗性差別，為玉米抗病遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

以抗病玉米自交系BT-1與感病玉米自交系N6(圖1)構(gòu)建的RIL群體(F10)及2個親本為遺傳研究材料。其中，自交系BT-1來源于骨干自交系8085，屬于蘇灣血緣。自交系N6是黃早4的改良材料，屬于塘四平頭血緣，對多種病害高感但具有較好的綜合農(nóng)藝表現(xiàn)。2個親本自交系BT-1和N6分別對種內(nèi)潛伏擬輪枝鐮孢菌具有較高和較低的抗性。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)吳建宇教授課題組前期已經(jīng)構(gòu)建了該RIL群體的遺傳連鎖圖譜[8]，并進行了一些相關(guān)性狀(種子[7]、穗長[9]、株高及穗位高[10])的分析。

圖1 抗病玉米自交系BT-1和感病玉米自交系N6的擬輪枝鐮孢菌感染情況Fig.1 Fusarium verticillioides infection grades of disease resistant maize inbred line BT-1 and susceptible maize inbred line N6

1.2 試驗設(shè)計

RIL群體以及2個親本被種植在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園區(qū)(鄭州：2016年春播、2016年夏播、2017年夏播、2018年夏播,依次標為環(huán)境Ⅰ、環(huán)境Ⅱ、環(huán)境Ⅲ、環(huán)境Ⅳ)，行長2 m，行間距0.67 m，每行播種10株。采用隨機區(qū)組設(shè)計，種植2個重復(fù)。采用單粒播種并進行標準田間管理。采用DONG等[11]的方法利用擬輪枝鐮孢菌對生長中的玉米果穗進行預(yù)接種(圖2)。使用5×106個/mL的擬輪枝鐮孢菌孢子懸浮液對授粉后15 d的玉米果穗進行穗腐病接種。

圖2 玉米果穗接種擬輪枝鐮孢菌的部位Fig.2 Fusarium verticillioides inoculation site of maize ear

通過注射法將1 mL接種液接種到RIL群體以及2個親本自交系的果穗中部，每個材料接種10穗。接種后的果穗用紙膠帶封住傷口，以減少周圍環(huán)境對發(fā)病的影響。

1.3 調(diào)查方法

將收獲后的玉米風(fēng)干，從每個穗子接種點的上方、左側(cè)和右側(cè)分別選取10個毗鄰穗腐癥狀籽粒的無明顯發(fā)病癥狀的種子(以保證這些種子攜帶近似的擬輪枝鐮孢菌)，用75%乙醇浸泡30～50 s，然后用3%的次氯酸鈉浸泡1 min。用清水清洗3遍種子，并將其放在培養(yǎng)皿中的干燥濾紙上(每個培養(yǎng)皿放置2層濾紙)。10顆種子胚朝下，并加入4 mL無菌水，每個材料做3個重復(fù)。將培養(yǎng)皿密封后，放入培養(yǎng)箱中26 ℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)5 d后，參考琚銘[7]的方法對材料的發(fā)病等級進行評估，并將發(fā)病等級劃分為1、3、5、7、9共5級。RIL群體鑒定的具體材料數(shù)和重復(fù)如表1所示。

表1 RIL群體表型鑒定的材料數(shù)和重復(fù)Tab.1 Material number and replication for phenotypic investigation of RIL population

1.4 抗性QTL定位分析

RIL群體10條染色體的遺傳圖譜包括207個SRR(Simple sequence repeat)標記位點，圖譜總長為1 820.8 cM，標記平均間距為11.7 cM。采用QTL IciMapping 4.0軟件[12]和完備區(qū)間作圖法，在步長1 cM、PIN=0.05的參數(shù)下，以2.5為LOD閾值檢定主效QTL。如果同一染色體不止一個QTL，則參照MCINTOSH[13]的方法命名，即q+性狀名稱縮寫+染色體+編號。

2 結(jié)果與分析

2.1 RIL群體種內(nèi)擬輪枝鐮孢菌抗性的表型分析

通過對RIL群體4個環(huán)境的表型數(shù)據(jù)聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，種內(nèi)擬輪枝鐮孢菌培養(yǎng)后種子的發(fā)病等級基本符合正態(tài)分布(圖3)。其中RIL群體的玉米種子對種內(nèi)擬輪枝鐮孢菌的抗性發(fā)病等級大部分集中在3～5級，發(fā)病等級高于7的高感材料相對較少，僅有0.94%。

圖3 RIL群體發(fā)病等級分布Fig.3 Frequency distribution of disease grade in RIL population

對RIL群體4個環(huán)境的表型進行描述性統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)RIL群體的發(fā)病等級范圍在1～9級，單環(huán)境的廣義遺傳力在0.84～0.88，聯(lián)合分析的遺傳力為0.74(表2)?？偟膩碚f遺傳力都相對較高，說明玉米種子內(nèi)部對擬輪枝鐮孢菌抗性是復(fù)雜的數(shù)量性狀，主要受遺傳因素控制。

表2 RIL群體4個環(huán)境表型的描述性統(tǒng)計Tab.2 Descriptive statistics for RIL population phenotypes in four environments

2.2 玉米種子內(nèi)部擬輪枝鐮孢菌抗性的QTL分析

從表3可以看到，4個環(huán)境共檢測到10個QTL位點，分別位于第2、4、6、8、9、10染色體上，解釋2.59%～7.21%的表型變異，其中位于第2染色體上的有3個QTL。利用4個環(huán)境表型的最佳無偏估計值，對玉米種子內(nèi)部擬輪枝鐮孢菌抗性QTL進行聯(lián)合分析。對RIL群體室內(nèi)表型4次聯(lián)合后共定位到6個種內(nèi)抗性QTL位點，分別位于第1、3、4、9、10染色體上，解釋的表型變異范圍為1.32%～7.62%。其中，在第3染色體上定位出2個QTL。在4個環(huán)境中位于標記umc1964—mmc0371的QTL在第1個環(huán)境及聯(lián)合分析中均被檢測到，解釋了7.21%的表型變異。在4個環(huán)境中位于標記umc1492—umc1691的QTL在第4個環(huán)境及聯(lián)合分析中均被檢測到，解釋了6.64%的表型變異。

表3 4個環(huán)境中玉米種子內(nèi)部擬輪枝鐮孢菌抗性QTL檢測結(jié)果Fig.3 QTL mapping for maize seed internal Fusarium verticillioides resistance in four environments

效應(yīng)最大的QTL位于第3染色體bnlg1144—bnlg1447，解釋了7.62%的表型貢獻率，抗病效應(yīng)來自于抗病親本BT-1(圖4)。除此之外，發(fā)現(xiàn)的6個QTL中，有3個的抗性來自于感病親本N6。上述結(jié)果表明，種子內(nèi)部對擬輪枝鐮孢菌的抗性是一個微效多基因控制的數(shù)量性狀。

圖4 4次聯(lián)合檢測到的QTL位點在染色體上的分布Fig.4 Chromosomal distribution of QTL detected for seed internal resistance by combined analysis

將上述QTL與課題組前期定位的種子外部對擬輪枝鐮孢菌抗性QTL[7]進行比較(表4)，發(fā)現(xiàn)qSIR4是不同性狀所共有的一致QTL，表明其可能在不同組織均具有對擬輪枝鐮孢菌的抗病效應(yīng)，說明種子內(nèi)部抗性與外部抗性有一定的關(guān)系。qSIR1、qSIR3-1等5個QTL并未在種子外部抗性定位中檢測到，說明其是種子內(nèi)部對擬輪枝鐮孢菌抗性的特有QTL，表明種子內(nèi)部對擬輪枝鐮孢菌的抗性具有與外部抗性不同的機制。

表4 玉米種子內(nèi)部與外部對擬輪枝鐮孢菌抗性QTL的比較Fig.4 Comparison of QTL results of internal and external resistance of maize seeds to F.verticillioides

3 結(jié)論與討論

擬輪枝鐮孢菌(F.verticillioides)能侵染發(fā)育中的玉米籽粒，從而引起玉米穗腐病，嚴重影響玉米的產(chǎn)量。當人畜食用沒有癥狀但受真菌侵染的玉米或侵染玉米加工的產(chǎn)品時，會攝入真菌毒素，引起中毒、致癌，嚴重時甚至致命。研究發(fā)現(xiàn)，玉米種子僅僅表面消毒不能去除內(nèi)部的擬輪枝鐮孢菌，因此有報道將其稱之為種傳真菌[14]。據(jù)報道，大部分玉米被擬輪枝鐮孢菌無癥狀侵染，且大多數(shù)的玉米地塊超過90%的玉米被感染，且無癥狀感染(內(nèi)部潛伏擬輪枝鐮孢菌)比有癥狀感染(表現(xiàn)為穗腐病、種子干癟等)更普遍[15-19]。由于表面消毒和肉眼挑選等手段無法解決種內(nèi)潛伏擬輪枝鐮孢菌的問題，鑒定優(yōu)異抗源并開展遺傳研究，進而培育抗擬輪枝鐮孢菌的玉米新品種，對于阻斷擬輪枝鐮孢菌病害的系統(tǒng)侵染以及保障人畜的健康安全具有重要意義。

課題組在之前進行種子抗性研究時發(fā)現(xiàn)，清水對照種子進行表面消毒后培養(yǎng)，部分材料仍然出現(xiàn)明顯的真菌感染表型，且這種現(xiàn)象并不集中在對外部真菌抗性較差的遺傳材料上[7]。因此，推測玉米種子內(nèi)部對擬輪枝鐮孢菌的抗性可能與外部對擬輪枝鐮孢菌的抗性并非完全一致。后續(xù)的抗性鑒定表明，大多數(shù)自交系材料對內(nèi)部攜帶擬輪枝鐮孢菌的抗性表現(xiàn)與外部接種時的抗性相比，并不完全一致。因此，課題組將種子內(nèi)部對擬輪枝鐮孢菌的抗性作為一個獨立的性狀并開展抗性遺傳研究。

采用果穗大田預(yù)接種，收獲后選取無穗腐癥狀種子，表面消毒后恒溫培養(yǎng)，對玉米種子內(nèi)部擬輪枝鐮孢菌抗性進行鑒定。以玉米骨干自交系BT-1和N6為親本構(gòu)建的RIL群體為材料，通過4個環(huán)境的聯(lián)合分析，檢測到6個控制玉米種子內(nèi)部對擬輪枝鐮孢菌抗性的QTL位點，分別位于第1、3、4、9、10染色體上。琚銘[7]利用同一套RIL群體對玉米種子進行接種后鑒定，定位到8個種子外部抗性QTL，其中第4染色體上的QTL與本研究一致。上述結(jié)果表明，玉米種子內(nèi)部對擬輪枝鐮孢菌的抗性是獨立的性狀。

數(shù)量性狀由微效多基因控制，往往效應(yīng)較小且容易受環(huán)境影響。通過4個環(huán)境的聯(lián)合分析定位到6個QTL，表型貢獻率在1.32%～7.62%。SSR分子標記遺傳圖譜定位的QTL區(qū)間較大，因此，下一步需要進一步擴大定位群體，增加環(huán)境數(shù)量，提高遺傳圖譜的標記密度，以增加定位的精度。在此基礎(chǔ)上克隆抗病QTL，加深對抗病機制的認識，為抗病遺傳育種工作奠定基礎(chǔ)。