鑒別MS-H疫苗株和MS野毒株的MAMA-PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用

李玉燕　鞏新民　祝永華　張霞　彭曉艷　王海蘭　曲秀娟　郭龍宗　崔治中

摘? 要：根據(jù)Kreizinger Z等[1]已發(fā)表的研究，依據(jù)obg基因第367位和629位的核苷酸轉(zhuǎn)換，我們建立了依托瓊脂糖凝膠電泳（常規(guī)PCR）的錯(cuò)配擴(kuò)增突變分析（MAMA）方法以區(qū)分ts+MS-H疫苗株、ts-MS-H再分離株以及MS野毒株。本研究對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的客戶送檢的MS分離株的陽性病料，以及日常場(chǎng)區(qū)送檢咽喉拭子MS通用引物檢測(cè)的陽性樣品進(jìn)行MAMA-PCR擴(kuò)增，用以比對(duì)各分離株目的片段的差別，建立MS-H疫苗株與MS野毒株的鑒別方法，這將為臨床雞群MS感染狀態(tài)的評(píng)估提供參考依據(jù)，也為MS的凈化和防控提供技術(shù)指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞： MS;咽喉拭子;MAMA-PCR

中圖分類號(hào)：S858.324.4? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2020）2-0022-05

禽滑液囊支原體（MS）感染是雞群中普遍存在的一種感染[2]，在規(guī)?；B(yǎng)殖公司的集約化飼養(yǎng)的雞群，MS感染尤為嚴(yán)重。MS感染可垂直和水平傳播[3]，其中種雞的垂直傳播會(huì)給下游企業(yè)帶來持續(xù)不斷的巨大經(jīng)濟(jì)損失，是可凈化的一種重要的垂直傳播性疾病[4]。目前雞滑液囊支原體疾病的控制，一般會(huì)采用活疫苗或活疫苗和滅活疫苗結(jié)合免疫，MS支原體應(yīng)用較為廣泛的活疫苗菌株有MS-H株。MS-H株可在雞的上呼吸道攜帶，會(huì)干擾臨床樣品MS的PCR的檢測(cè)結(jié)果。另外，疫苗的應(yīng)用過程中其回復(fù)突變導(dǎo)致一定的毒力，因此基于弱毒活疫苗的有效性及安全性考慮，建立鑒別MS疫苗株和野毒株的方法十分重要，可以了解雞群在MS-H株活苗免疫后雞群是否還存在野毒感染，為該病的凈化控制提供參考。在本研究中，依據(jù)obg基因第367位和629位的核苷酸轉(zhuǎn)換，我們建立了依托瓊脂糖凝膠電泳（常規(guī)PCR）的錯(cuò)配擴(kuò)增突變分析（MAMA）方法以區(qū)分ts+MS-H疫苗株、ts-MS-H再分離株以及MS野毒株。該方法將適用于肉種雞場(chǎng)禽滑液囊支原體感染狀況的監(jiān)測(cè)和MS-H活疫苗免疫雞群野毒感染風(fēng)險(xiǎn)的連續(xù)跟蹤評(píng)估。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑? 定制110bp Marker、PCR引物由青島英賽特生物科技有限公司合成;核酸自動(dòng)提取試劑盒購自青島英賽特生物科技有限公司和杭州博日科技有限公司;EasyPure Viral DNA/RNA Kit提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒、2000bp Marker、500bp Marker、瓊脂糖、TAE均購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。MS-H疫苗株（批號(hào)為MSH 172452A），購自澳大利亞生物資源。雞滑液囊支原體參考株WVU1853株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2? 采集樣品? 本實(shí)驗(yàn)室保存的客戶送檢的文登、鐵嶺、龍口等區(qū)域MS分離株的陽性病料，以及日常場(chǎng)區(qū)送檢咽喉拭子MS通用引物檢測(cè)的陽性樣品（包括A、B、C、D、E五個(gè)場(chǎng)區(qū)），MS-H疫苗株和雞滑液囊支原體參考株WVU1853株作為陽性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照。

采集疑似支原體感染的雞只的肺臟、氣管、氣囊等病料，加入滅菌生理鹽水研磨，直至成勻漿液。將懸液移至離心管中充分搖震后，4℃，12000r/min離心5min，取上清液備用，用于提取核酸。

咽喉拭子樣品的采集與處理參照郭龍宗等[4]發(fā)表的方法進(jìn)行處理，將棉棒插入喉頭口及上顎裂處來回刮3～5次取咽喉分泌液，將樣品端插入離心管剪下或折斷，放入含有0.8～1.0mL PBS的1.5ml離心管中，備用。

1.3? 核酸提取? 采集的咽喉拭子樣品參照核酸自動(dòng)提取試劑盒的使用說明，從咽喉棉拭子擠出并離心的上清液提取DNA;肺、氣管、氣囊等采集樣品參照EasyPure Viral DNA/RNA Kit的使用說明提取DNA。

1.4? 樣品的鑒定

1.4.1? 引物? 根據(jù)張秀美等[5]已發(fā)表的針對(duì)MS序列的通用PCR檢測(cè)引物，由青島英賽特生物科技有限公司合成（見表1）。本研究參照Kreizinger Z等[1]已發(fā)表的研究，通過設(shè)計(jì)MAMA方法進(jìn)而檢測(cè)MS的obg基因第367位和629位核苷酸，基因組位置、引物序列見表2。

1.4.2? 目的片段的擴(kuò)增? MS通用引物PCR反應(yīng)體系見表3;MS MAMA-PCR鑒別引物反應(yīng)體系見表4。

MS通用引物PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，于4℃保存，備用。

MS MAMA-PCR鑒別引物反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 30s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min，于4℃保存，備用。

反應(yīng)結(jié)束，取7μL MS通用引物PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，取7μL MS MAMA-PCR產(chǎn)物經(jīng)3%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。

1.4.3? 結(jié)果判定? 若MS-H1引物擴(kuò)增出71bp的目的條帶，MS-H2引物擴(kuò)增出96bp的目的條帶，則判定為MS野毒株，見表5;若MS-H1引物擴(kuò)增出91bp的目的條帶，MS-H2引物擴(kuò)增出96bp的目的條帶，則判定為MS-H疫苗株，見表5;若MS-H1引物擴(kuò)增出91bp的目的條帶，MS-H2引物擴(kuò)增出77bp的目的條帶，則判定為MS-H再分離株，見表5。

2? 結(jié)果

2.1? MS通用引物PCR檢測(cè)結(jié)果? A、B、C場(chǎng)咽喉拭子，文登、龍口、鐵嶺客戶采集病料，MS-H疫苗株，雞滑液囊支原體參考株WVU 1853株MS通用PCR檢測(cè)均為陽性，見圖1。

2.2? MS MAMA-PCR檢測(cè)結(jié)果? 檢測(cè)結(jié)果見圖2、圖3。

由圖2、圖3可知，雞滑液囊支原體參考株WVU1853株用MS-H1引物可擴(kuò)增出71bp的目的條帶，MS-H2引物擴(kuò)增出96bp的目的條帶。MS-H疫苗株用MS-H1引物可擴(kuò)增出91bp的目的條帶，MS-H2引物擴(kuò)增出96bp的目的條帶。

A、C場(chǎng)咽喉拭子用MS-H1引物可擴(kuò)增出91bp的目的條帶;文登、龍口、鐵嶺客戶采集病料用MS-H1引物可擴(kuò)增出71bp的目的條帶;B場(chǎng)咽喉拭子用MS-H1引物可同時(shí)擴(kuò)增出71bp和91bp的目的條帶，見圖2。6份采集樣品用MS-H2引物均擴(kuò)增出96bp的目的條帶，見圖3。結(jié)果判定：A、C場(chǎng)咽喉拭子MS分離株均為MS-H疫苗株;文登、龍口、鐵嶺客戶MS分離株均為MS野毒株;B場(chǎng)咽喉拭子MS分離株同時(shí)存在MS-H疫苗株和MS野毒株的感染。

采集6份D場(chǎng)咽喉拭子和5份E場(chǎng)咽喉拭子陽性DNA（MS通用引物凝膠成像圖省略）進(jìn)行MS MAMA-PCR擴(kuò)增，凝膠成像圖顯示：D場(chǎng)6份樣品用MS-H1引物均擴(kuò)增出91bp的目的條帶，其中6號(hào)樣品用MS-H2引物同時(shí)擴(kuò)增出77bp和96bp的目的條帶，其余樣品僅擴(kuò)增出96bp的目的條帶，見圖4、圖5;E場(chǎng)11號(hào)樣品用MS-H1引物同時(shí)擴(kuò)增出71bp和91bp的目的條帶，其余樣品僅擴(kuò)增出91bp的目的條帶，MS-H2引物均擴(kuò)增出96bp的目的條帶，見圖4、圖5。

結(jié)果判定：D場(chǎng)咽喉拭子樣品同時(shí)檢測(cè)出MS-H疫苗株和MS再分離株;E場(chǎng)咽喉拭子樣品同時(shí)存在MS-H疫苗株和MS野毒株的感染。

3? 討論

MAMA-PCR原理[1]：MAMA曾用于多種病原的單核苷酸多態(tài)性分型。簡(jiǎn)單的說，MAMA技術(shù)是基于3'端單核苷酸特異性的等位基因特異性引物，每個(gè)等位基因特異性引物3'端倒數(shù)第二個(gè)堿基前一個(gè)堿基的錯(cuò)配會(huì)增強(qiáng)本方法識(shí)別單核苷酸多態(tài)性的能力。其中一個(gè)等位基因特異性引物的5'端具有一個(gè)額外的15～20個(gè)堿基的GC-鉗序列結(jié)構(gòu)（序列為CGGGG），另一個(gè)等位基因特異性引物沒有該額外序列結(jié)構(gòu)。GC-鉗序列結(jié)構(gòu)能夠增加PCR產(chǎn)物的熔解溫度（Tm）3～5℃，這種變化能夠在Real-Time PCR儀（熔解-MAMA方法）上通過熒光染料被檢測(cè)到;并且它能夠增加PCR產(chǎn)物的分子量大小，這一變化能夠在3%瓊脂糖凝膠電泳（瓊脂糖-MAMA方法）中識(shí)別。臨床禽滑液囊支原體（MS）檢測(cè)常用的MS-207bp通用引物的PCR檢測(cè)方法的靈敏性和特異性均較高[5]，適合用于場(chǎng)區(qū)咽喉拭子樣品大批量的篩選檢測(cè)，但其無法區(qū)分MS疫苗毒和野毒感染。在免疫程序和實(shí)際應(yīng)用中，區(qū)分MS-H疫苗株和野毒分離株是至關(guān)重要的，為了實(shí)行防控和凈化，必須有可靠的能夠區(qū)分MS-H疫苗株和MS野毒株的分子分型方法。

本實(shí)驗(yàn)將MS-H疫苗株和雞滑液囊支原體參考株WVU1853株作為陽性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照，進(jìn)行MAMA-PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示：MS-H疫苗株和雞滑液囊支原體參考株WVU1853株均擴(kuò)增出目的條帶大小，陰性對(duì)照無任何條帶，驗(yàn)證了該引物的有效性，可區(qū)分MS-H疫苗株和MS野毒株。

本實(shí)驗(yàn)同時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的客戶送檢的文登、鐵嶺、龍口等區(qū)域MS分離株的陽性病料，以及日常場(chǎng)區(qū)送檢咽喉拭子MS通用引物檢測(cè)的陽性樣品（包括A、B、C、D、E五個(gè)場(chǎng)區(qū)）進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示：A、C場(chǎng)咽喉拭子MS分離株均為MS-H疫苗株;文登、龍口、鐵嶺客戶MS分離株均為MS野毒株;B場(chǎng)咽喉拭子MS分離株同時(shí)存在MS-H疫苗株和MS野毒株的感染;D場(chǎng)咽喉拭子樣品同時(shí)檢測(cè)出MS-H疫苗株和MS再分離株;E場(chǎng)咽喉拭子樣品同時(shí)存在MS-H疫苗株和MS野毒株的感染。

臨床采集樣品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明該檢測(cè)方法對(duì)臨床樣品中MS的檢測(cè)具有指導(dǎo)意義，可有效鑒別MS-H疫苗株和MS野毒株的感染，這將為臨床雞群MS感染狀態(tài)的評(píng)估提供參考依據(jù)，也為MS的凈化和防控提供技術(shù)指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

[1]? Kreizinger Z， Sulyok KM， Pásztor A， Erdélyi K， Felde O， Povazsán J，et al.（2015） Rapid， Simple and Cost-Effective Molecular Method to Differentiate the Temperature Sensitive （ts+ ） MS-H Vaccine Strain and Wild-Type Mycoplasma synoviae Isolates[J].PLOS ONE，2005，10（7）：e0133554. doi：10.1371.

[2]? Y.M.Saif.禽病學(xué)[M]. 第十二版. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2012，951-952.

[3]? 劉金華，甘孟侯. 中國禽病學(xué)[M].第2版.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2015：216-234.

[4]? 郭龍宗，李玉燕，崔治中，等.哈伯德曾祖代雞支原體凈化狀態(tài)的維持和檢測(cè)[J].中國家禽，2018，40（5）：65-69.

[5]? 張秀美，M.I.Khan.PCR技術(shù)在禽支原體診斷上的發(fā)展和應(yīng)用[C].//中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)第十一次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集.北京：中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)禽病學(xué)分會(huì)，2003：465-466.

Establishment and preliminary application of MAMA-PCR method for identification of MS-H vaccine strain and MS wild strain

LI Yuyan1， GONG Xinmin1， ZHU Yonghua1， ZHANG Xia1， PENG Xiaoyan1， WANG Hailan1，