口腔黏膜癌前病變和口腔癌動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

程俊鑫 白賀天 常治楠 李敬 陳謙明

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，成都 610041

口腔癌是全球十大常見癌癥之一，組織結(jié)構(gòu)上約90%屬于口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamouscell carcinoma，OSCC）[1]。近年來(lái)其發(fā)病率不斷上升，據(jù)全球癌癥預(yù)估數(shù)據(jù)[2]顯示，在2018年將會(huì)有246 420例口腔癌男性新發(fā)患者，108 444例口腔癌女性新發(fā)患者。根據(jù)世界衛(wèi)生組織頭頸部腫瘤分類第4版[3]中介紹，口腔黏膜癌前病變主要包括口腔潛在惡性疾病（oral potentially malignant disorder，OPMD）[4]、口腔上皮發(fā)育不良（oral epithelial dysplasia，OED）和增殖性疣狀白斑（proliferative verrucous leukoplakia，PVL），而其中常見的口腔黏膜癌前病變則包括口腔黏膜白斑?。╫ral leukoplakia，OLK）[5]、口腔扁平苔蘚（oral lichen planus，OLP）[6]、口腔黏膜紅斑?。╫ral erythroplakia，OE）[7]、口腔黏膜下纖維性病變（oral submucous fibrosis，OSF）[8]、盤狀紅斑狼瘡（discoid lupus erythematosus，DLE）[9]、口腔慢性念珠菌病[10]和光化性唇炎[11]等。目前，雖然外科手術(shù)治療、放射治療、輔助化學(xué)治療等治療方式都有較大發(fā)展，但OSCC的5年生存率仍沒(méi)有明顯提高，僅為50%，低于許多其他實(shí)體腫瘤。OSCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚不清楚，臨床上也缺乏能對(duì)其進(jìn)行早期診斷和預(yù)后判斷的特異性分子標(biāo)志物。為深入研究口腔黏膜癌前病變及癌變機(jī)制，進(jìn)而尋求有效的防治手段和針對(duì)性的治療措施，構(gòu)建有效的口腔黏膜癌前病變及口腔癌動(dòng)物模型就成為了相關(guān)研究的重要突破口。

1 口腔黏膜癌前病變動(dòng)物模型

目前常見的口腔黏膜癌前動(dòng)物模型分類有以下3種：誘導(dǎo)性動(dòng)物模型、移植瘤動(dòng)物模型和基因修飾動(dòng)物模型。但部分常見口腔黏膜癌前疾病包括OE、DLE以及光化性唇炎均尚無(wú)有效的動(dòng)物模型，本部分將詳細(xì)介紹OLK、OLP、口腔慢性念珠菌病和OSF這4種疾病的動(dòng)物模型。

1.1 OLK動(dòng)物模型

根據(jù)世界衛(wèi)生組織公布的第11版國(guó)際疾病分類標(biāo)準(zhǔn)[12]，OLK是一種發(fā)生在口腔黏膜上的白色斑塊或斑片，其周圍附著有上皮增生、過(guò)度角化的疾病。建立OLK的動(dòng)物模型的方法主要有2種：化學(xué)誘導(dǎo)法和原位移植動(dòng)物模型。

1.1.1 化學(xué)誘導(dǎo)法 化學(xué)誘導(dǎo)法方面，有研究者[13]采用0.005 g·L-1的苯并芘（Benzo[a]pyrene，BaP）/7，12-二甲基苯并蒽（7,12-dimethyl-benz[a]anthracene，DMBA）聯(lián)合誘變劑對(duì)5周齡地鼠的頰囊黏膜進(jìn)行涂擦，分別持續(xù)15周，每周3次，建立了OLK動(dòng)物模型。雖然化學(xué)誘導(dǎo)法建立金黃地鼠頰囊OLK動(dòng)物模型十分簡(jiǎn)便快捷，但是人類沒(méi)有頰囊這一結(jié)構(gòu)，而且人類的口腔黏膜也比金黃地鼠頰囊要厚，所以學(xué)術(shù)界一直對(duì)該模型有效性有爭(zhēng)論。同時(shí)DMBA處理容易破壞黏膜上皮層。

后有研究者[14]改用4-硝基喹啉-N-氧化物（4- nitroquinoline N-oxide，4NQO）飲藥法處理小鼠，取0.001 g·L-1的4NQO用飲藥處理周齡6周的小鼠，分別持續(xù)24周，每周3次，可建立OLK動(dòng)物模型。成年小鼠口腔黏膜與人非常相似，所以能夠解決口腔黏膜的差異性問(wèn)題。然而這一模型有建模周期較長(zhǎng)，將飲藥處理法改為涂藥法，產(chǎn)生相同病理結(jié)果的時(shí)間要短3～4周。有研究者[14]取0.005 g·L-1的4NQO用涂藥法，涂抹周齡6周小鼠的舌部，分別持續(xù)20周，每周3次，可建立OLK動(dòng)物模型。

除此之外，還有學(xué)者[15]使用化學(xué)誘導(dǎo)法與機(jī)械刺激相結(jié)合：采用慢性機(jī)械刺激及50%香煙煙絲丙酮提取液涂擦已經(jīng)用拔髓針輕刮多次的8周齡小鼠舌左側(cè)緣中后1/3偏腹側(cè)及左頰部中份黏膜處，至出現(xiàn)小的出血點(diǎn)或者發(fā)紅，持續(xù)15～25周，可建立OLK動(dòng)物模型。

1.1.2 原位移植法 在原位移植動(dòng)物模型方面，有研究者[16]向5～8周齡的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷（severe combined immunodeficiency，SCID）小鼠的舌腹部移植人非白色念珠菌感染的OLK病損組織，可以建立OLK的動(dòng)物模型。

在上述的這些動(dòng)物模型中，尚不能完全地模擬人類OLK的生物學(xué)特性，各有各的優(yōu)缺點(diǎn)（表1），對(duì)OLK的研究目的、研究手段不同，選用的動(dòng)物模型也就不同，如何建立有效、穩(wěn)定的OLK動(dòng)物模型仍有待進(jìn)一步探索，通過(guò)轉(zhuǎn)基因法來(lái)構(gòu)建OLK變動(dòng)物模型，可能是今后的研究方向之一。

表 1 OLK動(dòng)物模型比較Tab 1 Comparison of OLK animal model

1.2 OLP動(dòng)物模型

OLP是一種細(xì)胞免疫紊亂造成的自身免疫病，世界衛(wèi)生組織將其定義為癌前狀態(tài)，其常見臨床表現(xiàn)是網(wǎng)狀、環(huán)形或者斑片狀的白色丘疹[17]。目前OLP發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能和抗原特異性以及抗原非特異性的T細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥組織反應(yīng)相關(guān)，也受包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α等基因多態(tài)性、壓力、煙草刺激等因素影響[18]。目前大部分建模方式均效果不佳（表2），但仍可嘗試通過(guò)對(duì)具有遺傳特性的棕色挪威鼠皮下注射氯化汞溶液，后向其黏膜表面涂抹氯化汞溶液從而構(gòu)建OLP動(dòng)物模型[19]。

未成功的建模方式主要包括：移植OLP患者病損組織至小鼠舌腹及背部[20]或皮膚[21]進(jìn)行培養(yǎng)，也可通過(guò)黏膜表皮或皮膚針刺劃痕法進(jìn)行模型構(gòu)建[22]，但幾周后都出現(xiàn)了病理特征消失的現(xiàn)象?？赡艿慕忉屖荗LP的發(fā)生和宿主的自身特性相關(guān)，或因?yàn)榻＿^(guò)程中由于患者病損組織淋巴細(xì)胞游走或被小鼠自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞所殺傷。

表 2 OLP建模的比較Tab 2 Comparison of OLP animal model

1.3 口腔慢性念珠菌病動(dòng)物模型

念珠菌是一種感染口腔和陰道黏膜表層的常見條件致病真菌，口腔念珠菌病的發(fā)生和發(fā)展受局部和系統(tǒng)的多種因素影響[23]。目前明確說(shuō)明所建立模型為口腔慢性念珠菌感染動(dòng)物模型的報(bào)道較少，而對(duì)于口腔念珠菌感染的方法報(bào)道則較為全面，因此本部分主要介紹口腔念珠菌感染的方法，其中包括消化道感染、靜脈接種、口腔潰瘍并灌注口腔念珠菌，運(yùn)用激素以及基因型的篩選為口腔慢性念珠菌動(dòng)物模型的建立提供參考。

1.3.1 靜脈注射法 對(duì)免疫缺陷小鼠每天連續(xù)注射環(huán)磷酰胺，3 d后通過(guò)小鼠口腔感染白色鏈球菌即可形成口腔的局限性感染而建立動(dòng)物模型[24]。也有研究者[25]先使得小鼠發(fā)生口腔潰瘍后再進(jìn)行口腔念珠菌灌注，向昆明小鼠口腔內(nèi)注射環(huán)磷酞胺溶液后，用醋酸溶液灌口腔，2 h后再用念珠菌菌懸液0.5 mL灌注口腔，也可建立口腔念珠菌感染物模型。除此還可以采用潑尼松龍構(gòu)建相應(yīng)動(dòng)物模型，有研究者[26]對(duì)小鼠注射苯甲酸雌二醇后，注射潑尼松龍進(jìn)行處理，后將含100 μL菌液的棉球塞入小鼠口腔1～2 h，可建立口腔念珠菌感染動(dòng)物模型。還有研究者[27]將白色念珠菌涂抹在大鼠口腔黏膜并每周用無(wú)菌探針輕刮3次，持續(xù)數(shù)周，可成功構(gòu)建動(dòng)物模型；而如果在實(shí)驗(yàn)前在大鼠飲水中添加阿莫西林進(jìn)行預(yù)處理，則白色念球菌感染效果更好。

1.3.2 利用基因型篩選法 Hu等[28]通過(guò)對(duì)6周齡的BALB/c（敏感型）小鼠進(jìn)行白色念球菌3683注射，發(fā)現(xiàn)其動(dòng)物模型的白色念球菌感染比CBA/CaH（抵抗型）小鼠更為嚴(yán)重；并且白色念球菌3683比白色念球菌3630型和SC5314型口腔感染更好。

目前盡管已經(jīng)有許多成熟的口腔念珠菌感染動(dòng)物模型，但由于人類口腔慢性念珠菌病的發(fā)生十分復(fù)雜，相關(guān)機(jī)制尚不完全明確，對(duì)于口腔慢性念珠菌動(dòng)物模型建立的較少，同時(shí)很多的動(dòng)物模型一般只能模擬部分口腔慢性念珠病發(fā)生的特征。研究者從原先的靜脈感染到后來(lái)的結(jié)合宿主自身免疫狀態(tài)和感染方式，以及對(duì)動(dòng)物模型的選取采取了基因?qū)用娴姆治?，發(fā)現(xiàn)變化的基因種類繁多，同時(shí)不同基因型小鼠的動(dòng)物模型成功率有明顯差異。因此，從動(dòng)物模型的本身基因型進(jìn)行篩選可能是一種更有前景的動(dòng)物模型制作方向，而口腔慢性念珠菌病動(dòng)物模型的有效建立仍有待進(jìn)一步探索。

1.4 OSF動(dòng)物模型

OSF是一種口腔癌前病變，其黏膜上皮萎縮、玻璃樣病變，主要臨床表現(xiàn)為感覺(jué)口腔干燥，灼痛，進(jìn)食刺激性食物時(shí)感到疼痛，嚴(yán)重者可致張口和進(jìn)食困難。

Sumeth Perera等[29]曾采用檳榔提取物滴小鼠口腔黏膜，建模成功，但建模時(shí)間長(zhǎng)達(dá)300～600 d，時(shí)間太長(zhǎng)。有文獻(xiàn)[30]報(bào)道在8周時(shí)間內(nèi)，在麻醉狀態(tài)下，每天向SD大鼠兩側(cè)頰黏膜下注射1 g·L-1的博來(lái)霉素稀釋液，可制備出實(shí)驗(yàn)性O(shè)SF大鼠模型。博來(lái)霉素是治療惡性腫瘤效果較好的重要化療藥物，但其主要不良反應(yīng)為肺纖維化，也正是因?yàn)樵撍幬锏倪@種不良反應(yīng)，博來(lái)霉素成為了構(gòu)建肺纖維化模型的金標(biāo)準(zhǔn)[31]。實(shí)驗(yàn)者也嘗試?yán)貌﹣?lái)霉素的不良反應(yīng)效果構(gòu)建OSF，在他們的建模過(guò)程中，第2周即在實(shí)驗(yàn)組口腔黏膜發(fā)現(xiàn)了巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，而在這過(guò)程中，巨噬細(xì)胞可能分泌了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β1導(dǎo)致成纖維細(xì)胞（fibroblast，F(xiàn)B）向肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB）的轉(zhuǎn)變[32]，并在第4周時(shí)發(fā)現(xiàn)了動(dòng)物模型中干擾素（interferon，IFN）-γ表達(dá)的下降，這可導(dǎo)致其拮抗TGF-β1的能力下降[33]，進(jìn)而促進(jìn)OSF的發(fā)生。

目前沒(méi)有公認(rèn)的重復(fù)性較好的OSF動(dòng)物模型，相比較來(lái)看，博來(lái)霉素所誘導(dǎo)的動(dòng)物模型效果較好，同時(shí)OSF也是由于長(zhǎng)期咀嚼檳榔刺激而產(chǎn)生的，還需要對(duì)相關(guān)動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)條件、高敏動(dòng)物種屬等進(jìn)行進(jìn)一步的摸索與選擇。

2 口腔癌相關(guān)動(dòng)物模型

口腔癌是十大癌癥之一，預(yù)估在2018年，全球?qū)?huì)有超過(guò)30萬(wàn)的新發(fā)口腔癌患者[2]，口腔癌中90%為OSCC，口腔癌大多是由口腔黏膜癌前病變發(fā)展而來(lái)的。在我國(guó)，口腔癌發(fā)病率較高，因其解剖位置特別、累及面廣，危害較大，其5年生存率不足50%，亟待提高診治水平，因此口腔癌動(dòng)物模型的構(gòu)建十分重要。常見的口腔癌動(dòng)物模型建立方法包括：化學(xué)誘導(dǎo)法、原位移植法和轉(zhuǎn)基因法。

2.1 化學(xué)誘導(dǎo)法

化學(xué)誘導(dǎo)法是目前最為成熟的口腔癌模型建立方法，成本低、發(fā)生條件易控制、可大規(guī)模批量建立，深受科研工作者的青睞。

化學(xué)誘導(dǎo)法最為常用的2種化學(xué)藥物為9,10二甲基-1,2苯并蒽以及4NQO。9,10二甲基-1,2苯并蒽中存在苯環(huán)結(jié)構(gòu)，有直接致癌作用，常用液體石蠟或丙酮溶解進(jìn)行使用，但9,10二甲基-1,2苯并蒽容易破壞上皮細(xì)胞DNA的正常架構(gòu)。4NQO是一種水溶性的致癌物質(zhì)，經(jīng)口服可誘導(dǎo)口腔癌[34]，其代謝產(chǎn)物有導(dǎo)致鼠7號(hào)染色體突變的致癌作用[35]。

Nagini等[36]利用9,10二甲基-1,2苯并蒽的石蠟油溶液涂抹小鼠頰囊，持續(xù)14周，成功建立了OSCC動(dòng)物模型。有學(xué)者[37]對(duì)大鼠黏膜用4NQO水溶液進(jìn)行涂抹，持續(xù)28周后成功誘導(dǎo)出浸潤(rùn)性O(shè)SCC。飲水法也是4NQO常用誘導(dǎo)方法之一，一些學(xué)者[38]用4NQO喂養(yǎng)SD大鼠32周，也可成功構(gòu)建口腔癌動(dòng)物模型。隨后有研究者[39]結(jié)合基因敲除手段，發(fā)現(xiàn)視黃醇基因敲除小鼠被4NQO誘導(dǎo)成功的時(shí)間縮短。Lin等[40]連續(xù)8周用9,10二甲基-1,2苯并蒽涂抹小鼠頰囊，后連續(xù)4周繼續(xù)使用水解檳榔堿，最后成功建立OSCC動(dòng)物模型，大幅減少了DMBA單獨(dú)使用時(shí)的建模時(shí)間。

2.2 原位移植法

原位移植瘤模型是目前運(yùn)用較為廣泛的一類口腔癌誘導(dǎo)方法，除口腔癌之外也運(yùn)用到全身組織器官的腫瘤模型建立中，開辟了在人體外建立人類腫瘤模型的途徑。按照接種的形式可以分為活體腫瘤細(xì)胞株接種（cell line-derived xenograft，CDX）模型（即細(xì)胞源性異種移植模型）和腫瘤組織塊移植（patient-derived xenograft，PDX）模型（即人源腫瘤異種移植模型）[41]。按照接種的腫瘤來(lái)源可分為小鼠來(lái)源的腫瘤細(xì)胞和人源性腫瘤細(xì)胞，適用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象分別為小鼠和裸鼠。按照移植的部位可分為皮下移植瘤模型和原位移植瘤模型。皮下移植瘤模型就是將瘤組織或細(xì)胞用注射器注入動(dòng)物皮下（常為背部、腹股溝、前肢腋窩等處），因皮下血供較差、纖維結(jié)締組織豐富，腫瘤多為局限性生長(zhǎng)且位置表淺，容易觀察[42]。而口腔癌模型原位移植法則是將瘤細(xì)胞或組織移植到口腔內(nèi)相應(yīng)部位，讓腫瘤在其原發(fā)部位生長(zhǎng)，并具有向周圍侵襲擴(kuò)散的能力，這樣能客觀地反映口腔癌的生物學(xué)行為，吻合“種子與土壤理論”，能模擬出腫瘤細(xì)胞與宿主組織器官間相互作用的關(guān)系[42]。

裸鼠在口腔癌動(dòng)物模型的建立中是至關(guān)重要的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，是一種由第11對(duì)染色體的nu/nu基因純合雜交而形成的新品種無(wú)毛小鼠。由于胸腺先天性缺失，其特征表現(xiàn)為缺乏T細(xì)胞免疫產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)，在一定程度上可接受外來(lái)的移植細(xì)胞，因此廣泛地運(yùn)用到了移植法誘導(dǎo)口腔癌動(dòng)物模型中[43]。另外，由于金黃地鼠的口腔兩側(cè)有頰囊結(jié)構(gòu)，在此區(qū)域內(nèi)缺乏組織相容性抗原，可避免對(duì)移植組織的免疫排斥反應(yīng)，其可用于移植法建立口腔癌模型[44-46]。近年來(lái)，新西蘭大白兔也常被作為實(shí)驗(yàn)建模對(duì)象，相比于鼠科動(dòng)物來(lái)說(shuō)，其優(yōu)點(diǎn)在于體積較大，便于影像學(xué)檢測(cè)、抗癌藥物篩選及介入治療等相關(guān)研究項(xiàng)目的開展[47]。

Cal-27、HSC-3和SCC Ⅶ細(xì)胞系屬于較為經(jīng)典的用于OSCC腫瘤模型構(gòu)建的細(xì)胞系。而近年來(lái)VX2細(xì)胞株的誘導(dǎo)潛力被逐漸發(fā)掘，其具有誘導(dǎo)時(shí)間短、侵襲性強(qiáng)、成功率高的特點(diǎn)，并在生物學(xué)行為上與人OSCC較為相似[45]。Jefferis等[48]首先報(bào)道了用VX2細(xì)胞株構(gòu)建兔舌鱗癌的實(shí)驗(yàn)，取得了較好的結(jié)果。

綜上，原位移植法能較好地保留人類口腔癌的部分特性，在原位移植中可觀察到腫瘤擴(kuò)散浸潤(rùn)的生物學(xué)行為，能在一定程度上擬合人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。但移植法需具備一定的外科手術(shù)條件，確保嚴(yán)格無(wú)菌，以防實(shí)驗(yàn)動(dòng)物出現(xiàn)術(shù)后感染、傷口黏連等情況，這也增加了動(dòng)物模型建立的難度。

2.3 轉(zhuǎn)基因法

轉(zhuǎn)基因法是20世紀(jì)90年代新興的一種構(gòu)建口腔癌動(dòng)物模型的方法，它通過(guò)基因工程技術(shù)使目的基因整合于受體染色體，形成可將目的基因在后代中穩(wěn)定傳遞的個(gè)體，使受體生物及其家族均表現(xiàn)出研究者所需要的口腔癌性狀。2005年Opitz等[49]率先建立了第一個(gè)口腔癌轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，他們將目的基因注入受精卵的雄原核，得到C57BL/6鼠，并將其回交3代得到的較純轉(zhuǎn)基因鼠雜交得到具有口腔食道鱗狀細(xì)胞癌的鼠模型。而Caulin等[50]則首次在轉(zhuǎn)基因鼠上建立了具有可誘導(dǎo)性的口腔癌動(dòng)物模型，他們通過(guò)融合人類孕激素受體技術(shù)激活誘導(dǎo)性Cre重組酶的基因改造建立實(shí)驗(yàn)小鼠，然后與ROSA26受體鼠雜交，在小鼠懷孕14.5 d時(shí)，向其子宮注射100 μg·kg-1的RU486激活，之后不再暴露于RU486，其子代在5個(gè)月出現(xiàn)口腔癌。Huang等[51]則通過(guò)新興的規(guī)律間隔成簇短回文重復(fù)序列（clustered regularly inter spaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9技術(shù)建立p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素受體（p75 neurotrophin receptor，p75NTR）敲除的人舌鱗狀細(xì)胞癌SCC-9細(xì)胞株來(lái)探究p75NTR的生物學(xué)作用，CRISPR/Cas9技術(shù)的DNA切割僅僅依靠一小段RNA而不是整個(gè)基因工程蛋白，更加便捷高效[52]，同時(shí)可有效應(yīng)用于多種生物的基因編輯中[53-54]。這提示可將該技術(shù)與移植動(dòng)物模型相結(jié)合，有效建立多種口腔癌動(dòng)物模型，但其“脫靶”現(xiàn)象仍需進(jìn)一步深入研究來(lái)解決[55]。

轉(zhuǎn)基因法相比于其他構(gòu)建口腔癌動(dòng)物模型的方法來(lái)說(shuō)，其優(yōu)勢(shì)在于它使對(duì)腫瘤的研究深入至細(xì)胞和分子水平，精準(zhǔn)到基因表達(dá)的失活或增強(qiáng)；對(duì)于研究口腔正常組織發(fā)展到口腔黏膜癌前病變，進(jìn)而惡化形成口腔癌的分子機(jī)制，具有重要意義。但它也存在著一些局限性：難以控制產(chǎn)生單一部位的腫瘤，常有多部位出現(xiàn)瘤灶，不符合人體口腔癌癌變部位較為局限的性質(zhì)；轉(zhuǎn)基因常導(dǎo)致的基因增添或缺失，無(wú)法模擬腫瘤發(fā)生中的基因局部突變；同時(shí)其動(dòng)物模型成活率較低等。

3 展望

用于口腔黏膜癌前病變及口腔癌研究的動(dòng)物模型，已經(jīng)從腫瘤上皮細(xì)胞培養(yǎng)物，發(fā)展到體內(nèi)模擬口腔癌遺傳學(xué)、病理特征和腫瘤-基質(zhì)相互作用的系統(tǒng)性口腔癌患者的發(fā)展情況。在癌癥免疫治療和精準(zhǔn)治療時(shí)代，使用疾病模型進(jìn)行系統(tǒng)地測(cè)試，是口腔癌預(yù)防和治療干預(yù)的必要手段，也是研究口腔癌發(fā)生機(jī)制的重要方法。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。