3種寄生真菌發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲4號生理小種毒力研究

許艷麗，魯建聰，宋 潔,2

(1.中國科學院 東北地理與農業(yè)生態(tài)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2.哈爾濱商業(yè)大學，黑龍江 哈爾濱 150028)

0 引 言

大豆長期連作會使土壤產生對大豆胞囊線蟲(Soybean cyst nematodes,SCN)的抑制性，即人們所說的“線蟲抑制性土壤”[1-2]，大豆是我國北方的優(yōu)勢作物，黑龍江省是我國大豆的最大產區(qū)，播種面積占全國的50%左右[3]。在大豆主產區(qū)由于種植歷史悠久，大豆胞囊線蟲病發(fā)生比較普遍，在大豆適宜種植區(qū)常連作或迎茬種植，近年“線蟲抑制性土壤”這種現(xiàn)象在我國大豆產區(qū)也有報道[4-7]，孫漫紅等研究認為大豆胞囊線蟲抑制性土壤中空胞囊數(shù)量增多是由食線蟲真菌所致[8]。Crump認為大豆胞囊線蟲病的土壤中雌蟲寄生真菌有厚垣輪枝菌(Verticilliumchlamydosporium)等[9]，孫玉秋等研究發(fā)現(xiàn)連作15 a和16 a豆田大豆胞囊線蟲二齡幼蟲(J2)蟲口密度低于迎茬和輪作田,二齡幼蟲被毛孢菌(Hirsutellaminnesotensis)寄生率均高于其他大豆茬口[10]。宋潔等分離了大豆22 a連作、3 a連作和22 a小麥-玉米-大豆輪作土壤中大豆胞囊線蟲寄生真菌，發(fā)現(xiàn)22 a連作土壤中厚垣輪枝菌遠高于3 a連作和22 a連作的土壤。在22 a連作和輪作土中可檢測到淡紫擬青霉，但3 a連作土中則沒有分離到該菌。連作22 a大豆田分離的大豆胞囊線蟲卵寄生真菌中厚垣輪枝菌和淡紫擬青霉明顯高于連作3 a和輪作，因此，認為厚垣輪枝菌和淡紫擬青霉是該抑制性土壤中的優(yōu)勢寄生真菌[11]。孫玉秋等在黑龍江省、吉林省等地的大豆田土壤中分離到的真菌中淡紫擬青霉最多[12]。王克寧等從遼寧省、吉林省、黑龍江省、河北省、內蒙古自治區(qū)和山東省等地區(qū)的大豆連作土壤中分離到了真菌19個屬，也包括淡紫擬青霉、厚垣輪枝菌和鐮孢菌屬[12]。

隨著研究的不斷深入，人們逐漸將研究重點轉移到這些寄生真菌對大豆胞囊線蟲的抑制作用上。厚垣輪枝菌作為兼性寄生菌，可寄生在大豆胞囊線蟲的各個蟲態(tài)，自然條件下可控制植物寄生線蟲種群密度，有報道厚垣輪枝菌在黑龍江省、吉林省和遼寧省大豆田為優(yōu)勢大豆胞囊線蟲卵寄生真菌[13]。趙曉輝等離體研究認為，大豆胞囊線蟲抑制性土壤中分離的厚垣輪枝菌對大豆胞囊線蟲3號生理小種二齡幼蟲有強烈致死作用[14]。范圣長等在我國北方大豆田土中分離出了厚垣輪枝菌，該菌對線蟲胞囊寄生率達100%[15]。淡紫擬青霉菌也能寄生多種植物線蟲的卵和幼蟲等，該菌在代謝過程中產生抑制線蟲活性的物質，以此抑制植物線蟲卵孵化，并強烈抑制J2活性，減少植物線蟲密度，被認為是重要的生防真菌[16]。孫漫紅等報道了淡紫擬青霉M-14菌株代謝產物可強烈抑制大豆胞囊線蟲卵孵化[17]。鐮孢菌屬(Fusariumspp.)是一類龐大真菌，可引起作物枯萎病和根腐病，該屬的某些種也是植物病原物的生防菌。陳立杰等在6 a連作大豆田分離真菌，發(fā)現(xiàn)鐮孢菌分離比例最高[18]。趙曉輝等也報道鐮孢菌在大豆胞囊線蟲抑制性土壤中和線蟲胞囊上分離頻率最高，其中禾谷鐮孢菌(F.graminearum)和尖鐮孢菌芬芳變種(F.oxysporumvar.，現(xiàn)更名為芬芳鐮孢(Fusariumredolens))可明顯抑制大豆胞囊線蟲3號生理小種卵孵化，并對J2有致死作用[19]。在美國也有報道稱鐮孢菌是大豆胞囊線蟲胞囊的優(yōu)勢寄生菌[20]。

我國以往研究寄生真菌對大豆胞囊線蟲的抑制作用多是以3號生理小種為靶目標，但除3號小種外，其他小種在我國也有分布，其中4號小種在我國分布也很普遍，該小種主要分布在山西省、江蘇省、山東省、河南省、河北省及安徽省等地[5]，且4號生理小種毒性較強。因此，本研究旨在探討北方分離的大豆胞囊線蟲優(yōu)勢寄生真菌對在其他地區(qū)分布的4號小種毒性，明確寄生真菌對其抑制作用，采用大豆胞囊線蟲優(yōu)勢寄生菌發(fā)酵液，測定對大豆胞囊線蟲4號小種胞囊、卵孵化抑制和對二齡幼蟲致死作用，為我國大豆生產中胞囊線蟲的生物生態(tài)防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試真菌和供試線蟲

供試真菌有淡紫擬青霉(Paecilomyceslilacinus)4個菌株(P-1、P-V、P-40和P-E)、鐮孢菌屬(Fusariumspp.)4個菌株(F-1、F-5、F-9和F-V)和厚垣輪枝菌(Verticilliumchlamydosporium)4個菌株(V-25、V-1、V-2和V-21)。供試真菌菌株均由中國科學院黑土區(qū)農業(yè)生態(tài)重點實驗室從大豆胞囊線蟲抑制性土壤中分離、鑒定并保存。供試大豆胞囊線蟲4號生理小種取自山西太原，在溫室盆栽大豆苗上保存。

1.2 寄生真菌發(fā)酵原液制備

菌株活化供試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)[21]。挑取供試菌株的菌絲在PDA培養(yǎng)基上活化7 d，然后打取直徑4 mm菌塊，接種到PDB培養(yǎng)液中，30 ℃、180 r·min-1震蕩培養(yǎng)24 h，作為種子液。取種子液接種到PDB中，再以相同條件震蕩培養(yǎng)5d，4 ℃離心20 min (10 000 r·min-1)，用細菌過濾器對上清液過濾，成為寄生真菌發(fā)酵液原液[22]。

1.3 分離大豆胞囊線蟲胞囊和卵及制備卵和二齡幼蟲懸浮液

取盆栽大豆根圍5～20 cm土進行線蟲胞囊分離。將新鮮土在燒杯中加清水攪拌，然后浸泡1h后過套篩(20目和80目)，將80目篩上殘留物收集(用63%蔗糖)到離心管內，離心5 min(2 500 r·min-1)，將殘留物過濾，挑取成熟飽滿的胞囊放4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

飽滿胞囊在套篩(200目和500目)中進行研磨，收集殘留物，用0.5% NaClO溶液消毒，再用清水進行沖洗，用滅菌水制備成線蟲卵懸浮液，濃度為5 000個·mL-1，放到4℃冰箱保存。

將保存的線蟲卵放置在420目篩網(wǎng)布上，放入內裝有0.4 mmol·L-1ZnCl2溶液的卵孵化池中，在25 ℃培養(yǎng)箱里孵化，根據(jù)試驗要求制成相應濃度的J2懸浮液。

1.4 寄生真菌發(fā)酵原液和稀釋液對大豆胞囊線蟲胞囊孵化毒力測定

將分離出的新鮮飽滿胞囊放置于24孔細胞培養(yǎng)板內(每孔放10個)，在每孔里分別加入2 mL寄生真菌發(fā)酵原液、5×、10×、20×和50×稀釋液，對照加滅菌水，3次重復，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3d記錄孵化出線蟲數(shù)量，計算孵化抑制率。

線蟲孵化抑制率(%)=(對照孵化線蟲數(shù)-處理孵化線蟲數(shù))/對照孵化線蟲數(shù)×100%

1.5 寄生真菌發(fā)酵原液和稀釋液對大豆胞囊線蟲卵孵化毒力測定

在細胞培養(yǎng)板中加入大豆胞囊線蟲卵懸浮液，每孔加0.4 μL(約200粒)，各孔再分別加入2 mL寄生真菌發(fā)酵液原液、5×、10×、20×和50×稀釋液，以滅菌水為對照，3次重復，在25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3 d記錄孵化出線蟲數(shù)。并計算線蟲孵化率和相對抑制率。

線蟲孵化率(%)=孵化線蟲數(shù)/供試卵數(shù)×100%

相對抑制率(%)=(對照孵化率-處理孵化率)/對照孵化率×100%

1.6 寄生真菌發(fā)酵原液和稀釋液對大豆胞囊線蟲J2毒力測定

在細胞培養(yǎng)板中加入大豆胞囊線蟲J2懸浮液(每孔約加入50條)，各孔里再加入2mL寄生真菌發(fā)酵液原液或5×、10×、20×和50×稀釋液，以滅菌為對照，3次重復，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別在1 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后記錄線蟲死亡數(shù)量，并計算線蟲死亡率。

線蟲死亡率(%)=死亡線蟲數(shù)/供試線蟲數(shù)×100%

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Microsoft Excel 2007和SPSS 17.0進行數(shù)據(jù)分析及處理。

2 結果與分析

2.1 寄生真菌發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲胞囊孵化的毒力

2.1.1 寄生真菌發(fā)酵原液對大豆胞囊線蟲胞囊孵化抑制作用。孵化處理20 d后對大豆胞囊線蟲在真菌發(fā)酵原液中胞囊孵化調查顯示，3個屬寄生真菌發(fā)酵原液對線蟲胞囊孵化均有抑制作用(表1)。對胞囊孵化抑制率在50.6%～85.6%；其中鐮孢菌F-9菌株發(fā)酵液和淡紫擬青霉的P-E菌株發(fā)酵液的抑制率在相同菌中抑制率最高，分別是82.6%和85.6%，均與相同菌中其他3個菌株差異顯著(P<0.05)。

2.1.2 寄生真菌發(fā)酵稀釋液對大豆胞囊線蟲胞囊孵化抑制作用。孵化20 d后對大豆胞囊線蟲在寄生真菌發(fā)酵稀釋液中胞囊孵化結果調查表明，12個菌株稀釋液均對大豆胞囊線蟲胞囊孵化有抑制作用(表2)，其抑制作用隨發(fā)酵菌液的稀釋倍數(shù)升高而逐漸降低，5×稀釋液的抑制作用較其他稀釋濃度都強，50×稀釋液的抑制作用最弱。5×稀釋液中， F-9、P-E、V-25、V-2菌液抑制率都接近80%，顯著高于相同菌的其他菌株；50×發(fā)酵稀釋液對胞囊仍有抑制作用，抑制率范圍在28.3%～39.3%。3種菌液里F-9、P-E和V-25在不同稀釋倍數(shù)菌液中，都對胞囊孵化有明顯的抑制作用。

表1 寄生真菌發(fā)酵原液中大豆胞囊線蟲胞囊孵化抑制率Table 1 Hatch inhibition rates of SCN cyst in fermentation filtrates of parasitic fungi

注:數(shù)字后字母為Duncan′S新復極差測驗結果，小寫英文字母表示差異顯著(P<0.05),字母相同為差異不顯著。下同。

Note：Means in column followed by the same letter indicate no significant differences according to the Duncan′s multiple range test.The same is as below.

表2 寄生真菌發(fā)酵稀釋液中大豆胞囊線蟲胞囊孵化抑制率Table 2 Hatch inhibition rates of SCN cyst of race 4 in fermentation filtrate diluents of parasitic fungi

2.2 寄生真菌發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲卵孵化毒力

2.2.1 寄生真菌發(fā)酵原液對大豆胞囊線蟲卵孵化抑制作用。處理20 d后對大豆胞囊線蟲在寄生真菌發(fā)酵原液中卵孵化結果調查顯示，12個寄生真菌菌株發(fā)酵原液對大豆胞囊線蟲卵孵化均具有抑制性，在不同的發(fā)酵液之間，抑制作用不同(表3)。12個寄生真菌發(fā)酵原液卵孵化率在2.8%～4.4%，相對抑制率在51.3%～69.7%，卵孵化率均低于滅菌水(9.1%)，且與滅菌水的卵孵化率存在顯著差異(P<0.05)；其中P-E和V-25的發(fā)酵原液卵孵化率最低，為2.8%，相對抑制率最高，為69.7%，與其他發(fā)酵原液相比存在顯著差異，說明P-E和V-25發(fā)酵原液對大豆胞囊線蟲卵孵化具有明顯的抑制作用。

表3 寄生真菌發(fā)酵原液中大豆胞囊線蟲卵孵化率和相對抑制率Table 3 Hatch rates and relative hatch inhibition rates of SCN eggs in fermentation filtrate of parasitic fungi

2.2.2 寄生真菌發(fā)酵稀釋液對大豆胞囊線蟲卵孵化抑制作用。處理20 d后對大豆胞囊線蟲在寄生真菌發(fā)酵稀釋液中卵孵化結果調查表明，卵孵化率隨寄生真菌菌液稀釋倍數(shù)的增加而升高(表4)，卵孵化抑制率相反(表5)。5×稀釋液中卵孵化量最低，相對孵化抑制率高，50×稀釋液卵孵化量高，卵孵化抑制率低，但均與對照產生顯著性差異(P<0.05)。

表4 寄生真菌發(fā)酵稀釋液中大豆胞囊線早卵孵化率Table 4 Hatch rates of SCN eggs in fermentation filtrate diluents of parasitic fungi

5×稀釋液中F-9發(fā)酵稀釋液孵化率最低(2.3%)，相對抑制率最高(83.0%)，代謝物F-5、V-2孵化率均最高(3.0%)，相對抑制率最低(78.0%)。而在50×稀釋液中，V-21卵孵化率最高(7.2%)，相對抑制率最低(47.6%)，代謝物F-5孵化率最低(6.1%)，孵化抑制率最高(55.5%)。10×菌液中，孵化率范圍為3.1%～4.1%，相對抑制率范圍70.1%～77.4%，20×稀釋液中，孵化率范圍在5.1%～5.8%，相對抑制率范圍在57.9%～62.8%，各菌液的孵化抑制率和相對抑制率分布較為均勻，但均與對照孵化率13.7%差異顯著(表4)(P<0.05)。

12株寄生真菌發(fā)酵液5×稀釋液中，對大豆胞囊線蟲卵相對抑制率達到78.0%以上， 50×稀釋液中，卵相對抑制率都在47.6%以上，對卵孵化相對抑制作用顯著。

表5 寄生真菌稀釋液中SCN卵孵化相對抑制率Table 5 Relative hatch inhibition rates of SCN eggs in fermentation filtrate diluents of parasitic fungi

2.3 寄生真菌發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲J2毒力

2.3.1 寄生真菌發(fā)酵原液對大豆胞囊線蟲J2毒力。處理72 h后對大豆胞囊線蟲在寄生真菌發(fā)酵原液中J2死亡率調查表明，滅菌水對照里J2在處理12 h時才有19%的死亡率，而處理1 h時，12株寄生菌發(fā)酵液里就有10株有J2死亡，說明它們對J2的擊倒作用迅速；處理6 h開始12株寄生真菌菌株發(fā)酵液里都有J2死亡，之后12株寄生菌發(fā)酵液均對大豆胞囊線蟲二齡幼蟲致死作用高于滅菌水，并隨著作用時間的延長抑制作用增強；在48 h時， F-9發(fā)酵原液中J2死亡率高達97.3%，與對照差異顯著；在72 h時12株寄生菌發(fā)酵液的J2死亡率都在98%以上，其中在菌株F-9、F-V、P-E、P-V、V-25、V-2和V-21發(fā)酵原液中J2死亡率達到100%，12株寄生菌都與對照差異顯著(表6)。

2.3.2 寄生真菌發(fā)酵稀釋液對大豆胞囊線蟲J2毒力。處理后對大豆胞囊線蟲在寄生真菌發(fā)酵稀釋液中J2死亡率調查表明，12個寄生菌株發(fā)酵稀釋液對大豆胞囊線蟲J2均具有致死作用，并隨著發(fā)酵稀釋液倍數(shù)的升高，J2的死亡率在降低，但隨著作用時間的延長，J2死亡率逐步升高(7)。在不同的稀釋倍數(shù)中，5倍稀釋液毒力最高，50倍的最弱。

在處理1 h時5倍-20倍發(fā)酵稀釋液中就有 J2出現(xiàn)死亡，6 h時所有12個菌株的5倍～50倍發(fā)酵稀釋液中均有J2出現(xiàn)死亡，而此時滅菌水中仍沒有出現(xiàn)J2死亡。滅菌水對照在12 h以后開始出現(xiàn)J2死亡，但死亡率遠低于12個菌株。在12個菌株在12 h、24 h、72 h的5倍和10倍發(fā)酵稀釋液里和48 h的5倍、10倍和20倍發(fā)酵稀釋液里J2死亡率都明顯高于對照，與滅菌水差異顯著(P<0.05)；12個菌株中F-9和V-25對J2致死作用明顯，在24 h時，5倍稀釋液中，J2死亡率達到50%以上，高于其他發(fā)酵稀釋液。在72 h時，菌株F-9、P-E、V-25和V-21的5倍稀釋液中J2死亡率已經(jīng)達到了93%～96%，均與對照差異顯著(P<0.05)。F-9、P-E、V-25發(fā)酵液在不同時段不同稀釋倍數(shù)中對J2的抑制作用明顯高于其他菌株。

表6 寄生真菌發(fā)酵原液中大豆胞囊線蟲J2死亡率Table 6 Death rate of SCN J2 in fermentation filtrates of parasitic fungi

表7 寄生真菌發(fā)酵稀釋液中大豆胞囊線蟲J2死亡率Table 7 Death rate of SCN J2 in fermentation filtrate diluents of parasitic fungi

3 結論和討論

供試的12株寄生真菌發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲4號小種都具有抑制作用，能夠抑制其胞囊和卵孵化，并對二齡幼蟲具有致死作用。其中，菌株F-9、P-E、V-25發(fā)酵原液及稀釋發(fā)酵液對大豆胞囊線蟲作用顯著，胞囊孵化抑制率高的可達85%以上，稀釋發(fā)酵液對卵孵化相對抑制率可達83.0%，對卵抑制作用高于對胞囊抑制作用。原液在72 h時，J2致死率達到100%，作用顯著。

有關生防真菌代謝物(發(fā)酵液)對大豆胞囊線蟲作用機制尚不完全明確，有報道代謝物產生酶類物質、產生毒素及其他對線蟲有毒害的次生代謝物質[23]，認為生防菌代謝物中存在具有抑制線蟲或殺死線蟲的活性物質。不同真菌產生不同的代謝產物，因此殺線活性也不盡相同。淡紫擬青霉菌可寄生胞囊線蟲等多種植物病原線蟲的各個蟲態(tài)，并在代謝過程中產生具有殺線蟲活性的物質，抑制線蟲卵孵化，并強烈抑制二齡幼蟲活性，從而控制線蟲密度[16]。鐮孢菌是一類龐大的真菌類群，種和同種菌株之間的特性也存在很大差異，在本研究中不同菌株間對大豆胞囊線蟲抑制作用存在差異。Chen等[24]研究在大豆胞囊線蟲胞囊上分離獲得的茄腐鐮孢菌(Fusariumsolani)的發(fā)酵液對二齡幼蟲有毒力作用，而尖鐮孢菌(F.oxysporum)對二齡幼蟲和卵均沒有抑制作用。試驗中的3種寄生真菌對線蟲的胞囊和卵孵化有抑制作用，也對二齡幼蟲具有致死作用，在生防真菌中應用發(fā)酵液對胞囊孵化的作用尤為重要，胞囊可在土壤中長期存活，抑制其孵化即可抑制對寄主的侵染，守住第一道防線。生產上應用應以發(fā)酵液為主，活體菌劑雖然也有效，但應用量大，且易受土壤環(huán)境因素影響。因此，應加快開發(fā)寄生菌發(fā)酵濾液，促進病蟲害生物防治技術，改善農田生態(tài)環(huán)境質量[25]。連作大豆田會引起大豆根際微生物群落結構的改變，近年我國在該領域研究取得了許多進展[26-27]，還應在利用生態(tài)環(huán)境控制作物土傳病蟲害上開展深入研究，為大豆胞囊線蟲等植物寄生線蟲的生物生態(tài)控制提供理論依據(jù)。

致謝

感謝山西省農業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所劉學義研究員提供大豆胞囊線蟲4號生理小種。