豆芽中生長調(diào)節(jié)劑類違禁添加物的檢測方法研究進(jìn)展

孟繼秋 曹金博 孫亞寧 胡驍飛 李兆周 陳秀金 鄧瑞廣 王 耀

(1. 河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471003；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

豆芽作為一種營養(yǎng)豐富的蔬菜，食用方便，價(jià)格低廉，因而受到廣大消費(fèi)者的喜愛[1]。豆芽在生長過程中會(huì)產(chǎn)生大量的酚類和黃酮類等物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值高和抗氧化能力強(qiáng)[2]。隨著中國芽菜產(chǎn)業(yè)迅速發(fā)展，“問題豆芽”事件頻發(fā)[3]，植物生長調(diào)節(jié)劑的危害也逐漸引起了人們的關(guān)注及熱議，為確保豆芽及其制品食用安全，根據(jù)《中華人民共和國食品安全法》《中華人民共和國農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全法》等相關(guān)法律的規(guī)定，原國家食品藥品監(jiān)督管理總局、農(nóng)業(yè)部、國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)在2015年發(fā)布公告，嚴(yán)禁在豆芽生產(chǎn)過程中使用6-芐基腺嘌呤等植物生長調(diào)節(jié)劑類物質(zhì)。2018年美國也將6-芐基腺嘌呤在水果蔬菜中的最低限量下調(diào)至0.01 μg/g。因此，為了滿足食品安全監(jiān)管的需要，豆芽中生長調(diào)節(jié)劑檢測方法的研究備受重視。文章擬介紹豆芽中常見違禁添加的生長調(diào)節(jié)劑的作用與危害，并對(duì)國內(nèi)外目前應(yīng)用較為廣泛的檢測方法進(jìn)行綜述，以期為豆芽中生長調(diào)節(jié)劑檢測方法的深入研究提供參考。

1 豆芽中主要生長調(diào)節(jié)劑的作用及危害

豆芽生產(chǎn)過程中違法添加的植物生長調(diào)節(jié)劑主要有6-芐基氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)、4-氯苯氧乙酸鈉(Sodium 4-Chlorophenoxyacetate，4-CPANa)以及2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D)，其分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。6-BA是第一個(gè)人工合成的腺嘌呤型細(xì)胞分裂素，廣泛應(yīng)用于水果和蔬菜中，可有效增產(chǎn)保鮮，提高質(zhì)量，延長貨架壽命[4]。6-BA還可抑制根的生長，有研究表明，用0.5～25.0 mg/L的濃度處理豆芽可以使其色澤光亮、口感酥脆[5]，并縮短其生長周期[6]。然而6-BA的濫用，不僅使其大量殘留于食品中，威脅人身健康[7]，同時(shí)也污染環(huán)境。6-BA的毒性主要表現(xiàn)在損害生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)，甚至導(dǎo)致性早熟、急性中毒和癌癥[8]。4-CPANa又稱防落素，是一種內(nèi)吸、廣譜、高效、多功能植物生長調(diào)節(jié)劑[9]，作為植物生長調(diào)節(jié)劑使用時(shí)，可抑制豆芽生根、促進(jìn)生長[10]。其在體內(nèi)大量蓄積，可誘發(fā)肝腎衰竭，心臟腫大，肺部淤血等癥狀[11]。此外，有研究[12]表明，4-CPANa在不改變血液中激素水平的條件下，可誘導(dǎo)大鼠性腺細(xì)胞凋亡。2，4-D是一種苯氧化合物，高濃度時(shí)常用作除草劑，低濃度時(shí)用作細(xì)胞分裂素[13]，用于豆芽的生產(chǎn)時(shí)，能縮短發(fā)芽期，促進(jìn)產(chǎn)量，減少須根比例[14]。其在體內(nèi)的蓄積毒性主要表現(xiàn)為急性充血、內(nèi)分泌紊亂、中樞神經(jīng)退化甚至癌癥的發(fā)生[15]。植物生長調(diào)節(jié)劑在豆芽中的違規(guī)濫用，不僅使其大量殘留在豆芽中，同時(shí)也隨水體、土壤等途徑污染環(huán)境。

(a) 6-芐基氨基嘌呤 (b) 4-氯苯氧乙酸鈉 (c) 2,4-二氯苯氧乙酸

圖1 豆芽中主要生長調(diào)節(jié)劑分子結(jié)構(gòu)式

Figure 1 Molecular formulae of main growth regulators in bean sprouts

2 主要檢測方法

目前應(yīng)用于豆芽中植物生長調(diào)節(jié)劑的檢測方法主要有高效液相色譜法、表面增強(qiáng)拉曼光譜法、電化學(xué)方法、免疫分析方法、生物傳感器等方法。

2.1 高效液相色譜法

高效液相色譜(high-performance liquid chromatography，HPLC)是一種最常用的色譜分析技術(shù)，適用于測定農(nóng)獸藥殘留及各種小分子分析物。其檢測原理主要是根據(jù)待檢樣品中各成分極性的不同，在色譜柱流動(dòng)過程中將其分離，并在檢測器中分別進(jìn)行分析[16]。Wang等[17]建立了一種以氧化石墨烯/聚吡咯為吸附劑的高效液相色譜方法對(duì)豆芽中6-BA進(jìn)行了檢測，結(jié)果表明該方法在44～2 200 ng/g范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 8，回收率在92.5%～103.7%，此吸附劑具有理想的泡沫形貌，不僅保持了石墨烯的層狀結(jié)構(gòu)，而且結(jié)塊較少，大大提高了檢測的靈敏度。而Nian等[18]以聚[2-(二甲胺基)甲基丙烯酸乙酯-二甲基丙烯酸乙酯]為固相萃取吸附劑所建立的4-CPANa檢測方法，其線性區(qū)間為0.2～50.0 ng/mL，回收率為75.0%～93.3%，檢測限為1 ng/mL，此方法自動(dòng)化程度和吸附劑重復(fù)使用率高，既節(jié)省檢測時(shí)間又降低檢測成本。劉春生等[19]建立了超高效液相色譜—串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法檢測豆芽中6-BA與4-CPANa，其檢測結(jié)果在0.4～100.0 ng/mL區(qū)間具有良好的線性關(guān)系，檢測限分別為0.6，0.9 ng/mL，回收率為80.7%～115.0%。該方法雖然分辨率高、選擇性強(qiáng)、假陽性和假陰性率低，檢測準(zhǔn)確度高，但也存在儀器昂貴和操作繁瑣等弊端。

2.2 表面增強(qiáng)拉曼光譜法

表面增強(qiáng)拉曼光譜法(surface-enhanced raman spectroscopy，SERS)是一種高度靈敏的分析檢測技術(shù)，其原理為吸附在貴金屬納米粒子表面的目標(biāo)分子在激光的作用下受到局域電場的激發(fā)而產(chǎn)生拉曼散射[20]，由于其具有較高的信號(hào)增強(qiáng)因子，能達(dá)到百萬級(jí)的光譜增強(qiáng)能力，可以在分子水平提供光譜信息，通常用于痕量分析和檢測[21-22]。張萍等[23]采用快速溶劑提取前處理技術(shù)與SERS檢測技術(shù)建立豆芽中6-BA殘留物的快速定量檢測方法，其結(jié)果在0.1～2.0 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測限為20 ng/mL，回收率為82.3%～95.1%，此方法采用快速溶劑提取的前處理技術(shù)，縮短檢測耗時(shí)，提高檢測效率。Wang等[24]利用納米銀作為載體建立SERS檢測方法用于檢測豆芽中的6-BA，線性范圍為10～200 ng/mL，檢測限為3.3 ng/mL，回收率為85.5%～113.0%，借助納米金屬粒子，使該方法檢測限更低。Zhang等[25]開發(fā)出一種便攜式表面增強(qiáng)拉曼光譜儀，可用于現(xiàn)場快速檢測豆芽中6-BA殘留，該方法檢測線性范圍為0.1～5.0 μg/mL，檢測限為0.04 μg/g，回收率為81.7%～95.0%，由于其便攜性可直接用于現(xiàn)場檢測，使檢測過程更加簡單、快捷。

2.3 電化學(xué)方法

電化學(xué)方法是根據(jù)不同物質(zhì)的電化學(xué)特性差異，通過測定溶液中的電流、電位等電信號(hào)參數(shù)，判斷被測物成分及含量的一種分析方法[26]，靈敏度高、成本低，反應(yīng)速度快、試劑用量少、操作簡單、儀器使用方便，已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域[27]，但大多數(shù)電極材料對(duì)植物生長調(diào)節(jié)劑的氧化還原沒有催化能力或催化能力較差，復(fù)雜電化學(xué)行為以及電氧化和電聚合還會(huì)導(dǎo)致強(qiáng)電極鈍化(結(jié)垢)[28]。因此，為了檢測豆芽中的生長調(diào)節(jié)劑，現(xiàn)多致力于研究和開發(fā)新型電極材料。Zhu等[29]開發(fā)出一種液體基石墨烯分子印跡聚合物，對(duì)6-BA具有較高的催化活性和吸附能力，在優(yōu)化條件下，電流與6-BA線性關(guān)系范圍為0.5～50.0 μmol/L，檢測限為0.2 μmol/L，回收率為97.3%～108.0%，此方法使用的離子基液體交聯(lián)劑具有良好的電催化性能，顯著提高檢測的靈敏度和穩(wěn)定性。Gan等[30]合成出一種CuO@SiO2空心殼結(jié)構(gòu)，電化學(xué)測試結(jié)果表明其對(duì)6-BA有良好的電催化活性，并以此建立了一種簡單、快速的豆芽中6-BA檢測方法，峰值電流與6-BA的濃度在50 nmol/L～100 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，檢測限為2.6 nmol/L，回收率為97.2%～107.0%，此材料簡單易得、堆積效率高，既縮短檢測時(shí)間又降低檢測成本。Gan等[31]通過將多壁碳納米管與分子印跡殼聚糖充分混合，然后覆蓋在玻碳電極表面，制備了納米管，在優(yōu)化條件下，線性范圍濃度為0.1 nmol/L～10.0 mmol/L，檢測限為50 pmol/L，回收率為91%～103%，此材料會(huì)為6-BA提供更多的結(jié)合位點(diǎn)，以此材料制備的電極來檢測豆芽中的6-BA，受基質(zhì)效應(yīng)影響較小，靈敏度更高，檢測結(jié)果更加準(zhǔn)確。

2.4 免疫分析方法

免疫分析方法是基于抗原和抗體之間的特異性識(shí)別，利用酶、放射性同位素、熒光素等材料對(duì)抗原或抗體進(jìn)行標(biāo)記所建立的一種快速檢測方法[32]，主要包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、免疫印跡(immunoblotting)、免疫層析(immunochromatographic assay，ICA)等，該類方法靈敏度高、特異性強(qiáng)且操作簡單，但抗體制備周期較長且高親和抗體篩選難度大[33]。Zhang等[34]利用6-BA的代謝產(chǎn)物6-芐基腺苷(6-benzylaminopurine riboside，6-BAR)合成免疫原，通過免疫小鼠最終制備能同時(shí)特異性識(shí)別6-BAR和6-BA的單克隆抗體，并基于此抗體建立了6-BA的間接競爭ELISA檢測方法，該方法的線性范圍為3.6～106.0 ng/mL，半數(shù)抑制濃度(IC50)為18.9 ng/mL，回收率為104%～109%，在豆芽生長后期，部分6-BA已經(jīng)代謝為6-BAR，此方法亦可通過檢測6-BAR間接反映是否添加6-BA。Wang等[35]將SiO2納米材料結(jié)合在包被原上建立了一種直接競爭ELISA方法用于檢測豆芽中2，4-D殘留，該方法線性范圍為1～350 ng/mL，檢測限為0.079 ng/mL，平均回收率為93.2%，SiO2納米材料的使用可有效提高檢測靈敏度，降低檢測限。Li等[36]基于單克隆抗體開發(fā)出一種用于快速檢測豆芽中6-BA的膠體金免疫層析試紙，該抗體的IC50為2.25 ng/mL，試紙的檢測范圍為10～80 ng/mL，該方法不但操作簡單，而且在短時(shí)間內(nèi)便可得到肉眼可見的結(jié)果，適合豆芽中6-BA的現(xiàn)場快速篩查。

2.5 生物傳感器

生物傳感器最早于1962年由Clark和Lyons最先提出和使用，主要包括生物識(shí)別單元和換能器兩個(gè)重要組成部分[37]，其原理是將具有特異性識(shí)別能力的生物材料固定在固相載體上，形成功能膜，當(dāng)膜與被測物質(zhì)接觸時(shí)，敏感物質(zhì)首先與被測物質(zhì)發(fā)生選擇性吸附，然后發(fā)生一系列反應(yīng)，并將結(jié)果轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，最后由儀器將檢測結(jié)果直觀地表現(xiàn)出來[38]。根據(jù)生物敏感單元的不同主要可分為酶傳感器、免疫傳感器、微生物細(xì)胞傳感器等[39]，此方法具有敏感性強(qiáng)，準(zhǔn)確性高等特點(diǎn)[40]。Lee等[41]利用非標(biāo)記的光流環(huán)諧振器(opto-fluidic ring resonator，OFRR)建立免疫傳感器對(duì)豆芽中6-BA進(jìn)行檢測，通過優(yōu)化OFRR毛細(xì)管和錐形光纜的制備工藝，制備了納米級(jí)別的OFRR生物傳感器，并用金納米粒子與6-BA抗體結(jié)合，通過直接夾心法使檢測限降至10 ng/mL。Liu等[42]研究發(fā)現(xiàn)2，4-D具有抑制過氧化氫酶的能力，并基于這種抑制能力建立一種2，4-D的快速檢測方法，該方法將過氧化氫酶固定于多孔磷酸鈣納米材料上，將2，4-D與過氧化氫同時(shí)注入反應(yīng)體系，由于2，4-D的抑制作用使得過氧化氫的還原電流降低，還原電流與2，4-D濃度在6.63～663.00 ng/mL內(nèi)呈線性關(guān)系，檢測限為3.3 ng/mL，該方法準(zhǔn)確性好且重復(fù)性高。Paolo等[43]利用2，4-D對(duì)堿性磷酸酶的抑制作用原理，開發(fā)了一種快速、簡單、廉價(jià)的檢測2，4-D的生物傳感器，在優(yōu)化條件下，該傳感器的線性范圍為2.1～110.0 ng/mL，檢測限為1.0 ng/mL，添加回收試驗(yàn)結(jié)果表明運(yùn)用該傳感器檢測2，4-D具有良好的重現(xiàn)性，此方法所使用的酶傳感器相較于免疫傳感器具有成本低廉，重復(fù)使用率高等特點(diǎn)，整體檢測性能更為優(yōu)異。

3 展望

高效液相色譜、表面增強(qiáng)拉曼光譜等傳統(tǒng)的儀器檢測方法具有檢測限低、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，在實(shí)驗(yàn)室確證檢測中得到了廣泛應(yīng)用，但這些方法仍存在儀器價(jià)格昂貴、操作繁瑣等弊端，且目前便攜式檢測裝備的研發(fā)仍較為缺乏。因此，未來仍須開發(fā)簡便、快速、靈敏、特異的檢測方法，以滿足大批量樣品快速篩查的需求。相比之下，免疫分析方法和生物傳感器法利用高親和力或強(qiáng)敏感性識(shí)別物對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行快速識(shí)別，特異性強(qiáng)、靈敏度高且操作簡便，在大批量樣品的現(xiàn)場快速篩查方面具有極大的優(yōu)勢(shì)，若進(jìn)一步將多種檢測手段相互融合，優(yōu)化檢測條件，提高方法準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性，并探索利用廣譜性識(shí)別物建立高靈敏的多殘留檢測方法，將對(duì)植物生長調(diào)節(jié)劑違法濫用情況的高效監(jiān)控提供有力保障。