玳玳花精油的成分及其抗氧化活性研究

蘇 瑾 潘兆平 肖 媛 梁曾恩妮,3 付復(fù)華,3

(1. 湖南大學(xué)研究生院隆平分院，湖南 長(zhǎng)沙 410125；2. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410125；3. 果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410125)

玳玳是蕓香科柑橘屬酸橙的一個(gè)變種，廣泛種植于中國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)。玳玳花是一種藥食兼用資源，具有理氣寬胸、開胃止嘔、活血調(diào)經(jīng)、緩解抑郁、焦慮等精神系統(tǒng)疾病的功效[1-3]。研究[4]表明，玳玳花中含有精油、黃酮和生物堿等活性物質(zhì)，此外還含有多種苷類化合物及豐富的維生素類、人體必需氨基酸、纖維類、香豆素類以及礦物質(zhì)類等。但玳玳花花期很短，不利保存，因此可將玳玳花加工成精油，高效利用資源，增加其經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，癌癥、炎癥及衰老等備受關(guān)注的健康問題均與機(jī)體的氧化損傷相關(guān)。由于當(dāng)前合成類抗氧化藥物的高毒副作用和耐受性等安全問題，尋找新型高效、低毒且耐受性好的抗氧化劑對(duì)于臨床研究具有重要意義。玳玳花精油作為玳玳花主要的香氣、活性成分，資源豐富、天然安全，具有很好的抗氧化潛力，日益受到人們的關(guān)注與歡迎，然而其理化性質(zhì)及抗氧化活性鮮見報(bào)道。試驗(yàn)擬對(duì)玳玳花精油的成分、理化性質(zhì)和抗氧化能力進(jìn)行研究分析，以期為玳玳花精油在天然抗氧化劑及食品保鮮、護(hù)膚等方面的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

玳玳花：漣源康橙生物科技有限公司；

無水乙醇、濃硫酸、磷酸鈉、鉬酸銨、過硫酸鉀、七水硫酸亞鐵、水楊酸、30%過氧化氫等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；

VC標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH、ABTS：分析純，上海瑞永生物科技有限公司。

1.1.2 儀器

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：7890A-5975C型，美國(guó)Agilent公司；

紫外—可見分光光度計(jì)：UV-1800型，島津儀器(蘇州)有限公司；

折光儀：Abbemat 200型，奧地利安東帕(中國(guó))有限公司；

旋光儀：MCP 500型，奧地利安東帕(中國(guó))有限公司；

水浴恒溫振蕩器：SHA-B型，常州澳華儀器有限公司；

多功能粉碎機(jī)：RS-FS1401型，合肥榮事達(dá)小家電有限公司。

1.2 方法

1.2.1 玳玳花精油的提取 將新鮮玳玳花去除雜質(zhì)后用粉碎機(jī)粉碎，放入揮發(fā)油提取器中隔水蒸餾提取，2 h后精油餾出量不再增加，收集精油用無水硫酸鈉干燥過夜后，-20 ℃密封保存。

1.2.2 GC-MC分析條件 參考呂品等[7]的方法略有改動(dòng)。

(1) 色譜條件：色譜柱為HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；載氣為高純度氦氣，分流比為10∶1，流速1 mL/min；進(jìn)樣量1 μL，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測(cè)器溫度280 ℃；升溫程序：起始溫度70 ℃，保持1 min，3 ℃/min升溫至150 ℃保留2 min，然后以2 ℃/min 升溫至220 ℃，然后1 ℃/min升溫至236 ℃，再以2 ℃/min升溫至240 ℃，保留13 min；溶劑延遲4 min。

(2) 質(zhì)譜條件：EI源，電離電壓70 eV，離子溫度230 ℃，掃描范圍50～500 (m/z)。

1.2.3 精油理化指標(biāo)分析 對(duì)玳玳花精油的色狀、香氣、相對(duì)密度、折光指數(shù)、旋光度、溶混度、酸值、酯值等理化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，分析方法參照QB/T 4232—2011。

1.2.4 總抗氧化能力測(cè)定 采用磷鉬絡(luò)合法[8-10]。用無水乙醇稀釋精油得到質(zhì)量濃度分別為0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mg/mL的精油—乙醇溶液。取0.4 mL樣品液和4 mL磷鉬試劑(含0.6 mol/mL硫酸、28 mol/mL磷酸鈉和4 mmol/mL鉬酸銨)于干凈試管，搖勻后在95 ℃恒溫加熱90 min，冷卻至室溫后，在695 nm下測(cè)定吸光值。相同濃度的VC溶液為陽(yáng)性對(duì)照，用0.4 mL無水乙醇代替樣品液作空白。相關(guān)操作重復(fù)3次。

1.2.5 DPPH自由基清除率測(cè)定 根據(jù)文獻(xiàn)[11-12]修改如下：取19.716 mg DPPH于500 mL容量瓶中，加乙醇定容，得到0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液。2 mL不同濃度樣品液與2 mL DPPH溶液混合后，避光反應(yīng)30 min，517 nm下測(cè)定吸光值A(chǔ)i，2 mL乙醇代替樣品液測(cè)得吸光值A(chǔ)0，VC作為陽(yáng)性對(duì)照。平行操作重復(fù)3次，清除率按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

R——清除率，%；

A0——乙醇代替樣品測(cè)得吸光值；

Ai——樣品組吸光值。

1.2.6 ABTS自由基清除率測(cè)定 將等體積的7 mmol/L ABTS與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，避光12～16 h，無水乙醇調(diào)節(jié)734 nm下吸光度為0.68～0.72，得到ABTS儲(chǔ)備液。將1 mL不同濃度的樣品液與2 mL上述儲(chǔ)備液混合后暗處反應(yīng)30 min，734 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)i，無水乙醇代替樣品液測(cè)得A0，相同濃度VC為陽(yáng)性對(duì)照。每組測(cè)定重復(fù)3次，按式(1)計(jì)算清除率[13-14]。

1.2.7 羥基自由基清除率測(cè)定 用無水乙醇將精油稀釋成系列濃度梯度，取2 mL不同濃度精油樣品液加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，1 mL水楊酸—乙醇溶液和0.2 mL H2O2溶液，充分混勻，37 ℃水浴30 min后，510 nm 下測(cè)定吸光值為Ai，無水乙醇代替樣品液相同方法測(cè)得A0，蒸餾水代替H2O2測(cè)得Aj。等濃度VC為陽(yáng)性對(duì)照。每組測(cè)定重復(fù)3次，清除率按式(2)計(jì)算[15]：

(2)

式中：

R1——清除率，%；

Ai——樣品組吸光值；

Aj——蒸餾水代替H2O2測(cè)得吸光值；

A0——乙醇代替樣品測(cè)得吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 玳玳花精油的GC-MS分析

GC-MS分析玳玳花精油的總離子流圖見圖1，通過計(jì)算機(jī)檢索與NIST 08圖譜庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比，判定精油中各化學(xué)成分，運(yùn)用面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量，結(jié)果如表1所示，共鑒定出41種成分，占總成分95.80%，其中包括13種醇類化合物，占總成分59.34%，16種萜烯類化合物，占22.82%，4種烷烴類化合物、3種酸、3種酯類、1種吲哚和1種酚類化合物(詳見表1)。這些化合物是玳玳花精油特征香氣和生物活性的主要貢獻(xiàn)者。

含量超過1%的共13種，含量最高的為3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇(34.27%)，是一種無環(huán)單萜芳樟醇；其次是檸檬烯，占總成分的13.02%，具有檸檬香氣，與劉廷禮等[16]測(cè)得的結(jié)果相似；α，α-4-甲基-3-環(huán)己烯-1-甲醇(7.48%)又稱α-松油醇，有丁香味，是調(diào)配丁香型香精的主要原料；2-氨基苯甲酸酯-3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇占6.58%；(E)-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯(6.04%)和(Z)-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇乙酸酯(3.39%)屬于橙花乙酸酯，是國(guó)家允許的食用香精，常用以配制蘋果、桃子及柑橘類等水果型香精；(E)-3，7，11-三甲基-1，6，10-十二碳三烯-3-醇(3.09%)；(Z)-3，7-二甲基-1，3，6-辛二烯(2.94%)；(1S)-6，6-二甲基-2-亞甲基-雙環(huán)[3.1.1]庚烷(2.35%)；3，7，11-三甲基-2，6，10-十二碳三烯-1-醇(2.14%)；(E)-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇(2.02%)又稱香葉醇，是玫瑰香精的主劑，也可作增甜劑添加于食品中；石竹烯(1.63%)；(Z)-3，7-二甲基-2，6-辛二烯-1-醇(1.25%)別名橙花醇，有令人愉悅的香氣，是國(guó)標(biāo)允許的食用香精，可用于食品和化妝品香精的調(diào)制。

圖1 玳玳花精油成分總離子圖

Figure 1 Total ion chromatograms of essential oil extracted fromCitrusaurantiumL.var.amaraEngl

表1 玳玳花精油化學(xué)成分

檸檬烯是柑橘屬精油最常見的主要成分，已被廣泛報(bào)導(dǎo)有良好的抗氧化抑菌作用[17-18]，常用于食品的防腐保鮮。松油醇可抗菌、抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，Gouveia等[19]最近還發(fā)現(xiàn)α-松油醇可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和抑制iNOS來減輕癌癥疼痛。孫豐慧等[20]通過抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)香葉醇有明顯的體外抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性，且能夠增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類抗生素的活性，降低其用量。香葉醇還可以通過抑制癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡來抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與浸潤(rùn)。石竹烯在許多神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病中起到保護(hù)作用，包括疼痛、焦慮、痙攣、驚厥、抑郁、酗酒和阿爾茨海默癥等，此外還具有局部麻醉劑樣活性，可以保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)免受氧化應(yīng)激和炎癥，并可作為免疫調(diào)節(jié)劑。

2.2 玳玳花精油的理化性質(zhì)

水蒸氣蒸餾法提取的玳玳花精油為琥珀色澄清液體，保留了玳玳花的特征香氣。由表2可知，在20 ℃條件下測(cè)得相對(duì)密度為0.872，折光指數(shù)1.463，旋光度為11.230，精油在溶于3.5倍體積80%乙醇時(shí)仍然澄清透明，測(cè)得酸值為0.59 mg KOH/g，酯值為52 mg KOH/g，以上指標(biāo)均達(dá)到玳玳花(精)油中國(guó)輕工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)QB/T 4232—2011要求。

表2 玳玳花精油的理化性質(zhì)

2.3 玳玳花精油的抗氧化能力

2.3.1 總抗氧化能力 磷鉬絡(luò)合法測(cè)定精油的總抗氧化能力，吸光值越高，總抗氧化能力越強(qiáng)。由圖2可知，在0.2～10.0 mg/mL濃度范圍內(nèi)，玳玳花精油的總抗氧化能力隨著濃度的增加而增強(qiáng)。低濃度時(shí)VC與精油的總抗氧化能力均隨濃度的升高顯著上升，但精油低于VC，VC在濃度2 mg/mL以后抗氧化活性不再隨濃度變化而明顯改變，4 mg/mL時(shí)精油的抗氧化活性超過VC，并且有繼續(xù)增強(qiáng)的趨勢(shì)，可能是由于VC成分單一，達(dá)到作用上限后VC的總抗氧化能力不再增加，而精油中活性成分復(fù)雜，隨著精油濃度升高，更多活性成分累積，總抗氧化能力更強(qiáng)。

圖2 玳玳花精油總抗氧化能力

Figure 2 Total antioxidant capacity ofCitrusaurantiumL.var.amaraEngl essential oil

2.3.2 DPPH自由基清除能力 由圖3可知，在10～50 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，玳玳花精油清除DPPH自由基的能力呈劑量依賴性增強(qiáng)，濃度為50 mg/mL時(shí)清除能力達(dá)到73.51%，且有繼續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，IC50值為32.3 mg/mL， 但與VC相比，玳玳花精油清除DPPH自由基能力較弱。Choi等[21]測(cè)得尤力克檸檬、里斯本檸檬等34種柑橘類精油對(duì)DPPH自由基的清除率為17.7%～64.0%，低于同濃度的γ-萜品烯，高于d-檸檬烯和α-松油醇，且γ-萜品烯含量越高的精油有越強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。說明柑橘屬精油中清除DPPH自由基的主要作用成分是γ-萜品烯，而玳玳花精油中未檢測(cè)出γ-萜品烯可能是其對(duì)DPPH自由基清除能力較弱的原因。

圖3 DPPH自由基清除能力

Figure 3 The DPPH scavenging activity ofCitrusaurantiumL.var.amaraEngl essential oil

2.3.3 ABTS自由基清除能力 由圖4可知，在2～10 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，玳玳花精油對(duì)ABTS自由基清除能力隨精油濃度增加而增強(qiáng)，濃度為2 mg/mL時(shí)清除率為42.94%，濃度為10 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到85.63%，并且有繼續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，IC50值為2.78 mg/mL。結(jié)果表明玳玳花精油具有良好的清除ABTS自由基能力。

圖4 ABTS自由基清除能力

Figure 4 The ABTS scavenging activity ofCitrusaurantiumL.var.amaraEngl essential oil

2.3.4 羥基自由基清除能力 由圖5可知，各濃度VC對(duì)羥基自由基的清除率均超過90%以上。2 mg/mL的玳玳花精油對(duì)羥基自由基的清除能力較弱，清除率僅為20%；在2～10 mg/mL濃度范圍內(nèi)，玳玳花精油對(duì)羥基自由基的清除能力隨濃度升高而增強(qiáng)，當(dāng)濃度增加到10 mg/mL 時(shí)，玳玳花精油對(duì)羥基自由基的清除率達(dá)到94.87%，接近于同濃度VC的清除活性。玳玳花精油的清除羥基自由基的IC50值為4.96 mg/mL。章斌等[22]研究檸檬果皮精油不同組分的抗氧化活性時(shí)發(fā)現(xiàn)檸檬烯和α-松油醇等成分對(duì)羥基自由基的清除作用均隨濃度增大而增強(qiáng)，它們協(xié)同增加精油的自由基清除作用，與試驗(yàn)結(jié)果相似，且在高濃度時(shí)α-松油醇相比其他成分對(duì)羥基自由基有更好的清除效果，試驗(yàn)中高濃度時(shí)玳玳花精油的清除效果更佳，可能與α-松油醇含量較高而α-松油醇在高濃度時(shí)貢獻(xiàn)權(quán)重更大有關(guān)。

圖5 羥基自由基清除能力

Figure 5 The Hydroxyl scavenging activity ofCitrusaurantiumL.var.amaraEngl essential oil

2.3.5 玳玳花精油的抗氧化能力對(duì)比 玳玳花精油清除自由基能力的回歸方程和IC50值如表3所示，對(duì)3種自由基都有一定清除能力，對(duì)DPPH自由基清除能力較弱，IC50值為32.30 mg/mL，清除ABTS和羥基自由基的IC50值分別為2.78 mg/mL和4.96 mg/mL，清除自由基能力的排序?yàn)椋篈BTS自由基>羥基自由基>DPPH自由基。

表3玳玳花精油的抗氧化能力對(duì)比

Table3ComparisonoftheantioxidantofCitrusaurantiumL.var.amaraEnglessentialoil

抗氧化能力回歸方程R2IC50值清除DPPH自由基Y=1.274 7x+8.8330.998 032.30清除ABTS自由基Y=5.163 5x+35.6710.977 72.78清除羥基自由基Y=9.757 5x+1.6290.979 94.96

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用水蒸氣蒸餾法提取出的玳玳花精油呈琥珀色澄清液體，具有玳玳花特征香氣，通過GC-MS檢測(cè)分析出41種化合物，含有大量醇類、萜烯類和烷烴等芳香化合物，成分多樣。

玳玳花精油具有良好的總抗氧化能力，在4 mg/mL時(shí)超過VC的作用效果；對(duì)DPPH自由基清除能力較弱，50 mg/mL時(shí)清除率為73.51%；在精油濃度為10 mg/mL 時(shí)ABTS和羥基自由基的清除率分別達(dá)到85.63%和94.87%，清除自由基能力的排序?yàn)椋篈BTS自由基>羥基自由基>DPPH自由基。綜上所述，玳玳花精油是一種成分豐富，應(yīng)用價(jià)值較高的天然產(chǎn)物，有良好的抗氧化活性，在天然抗氧化劑和抗氧化、抗衰老的藥品、護(hù)膚品中有著廣闊的應(yīng)用前景與價(jià)值。