大豆GmWRKY86基因的克隆及表達(dá)

王 靜 付 晶 李曉偉

(1. 滄州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 滄州 061001；2. 河北大學(xué)，河北 保定 071002)

WRKY基因家族是高等植物最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一。1994年Ishiguro等[1]從甘薯中克隆了第一個WRKY蛋白，近年來隨著越來越多植物基因組的公布，不同物種間大量的WRKY成員在相繼得到克隆和鑒定[2]。WRKY基因編碼的蛋白除了WRKYGQK核心序列外，還存在保守的鋅指結(jié)構(gòu)[2]。依據(jù)WRKY蛋白結(jié)構(gòu)域及鋅指基序數(shù)量和模式的不同，WRKY蛋白分為3個亞類，其中第Ⅰ類含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，第Ⅱ類和第Ⅲ類雖只含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域，但第Ⅱ類的鋅指結(jié)構(gòu)模式為C2H2，而第Ⅱ類的鋅指結(jié)構(gòu)模式為C2HC[3]。

作為重要的轉(zhuǎn)錄因子成員，植物WRKY蛋白已被證明參與對生物和非生物脅迫的響應(yīng)以及發(fā)育過程[3]。有研究表明，WRKY蛋白不僅在抵抗細(xì)菌、真菌和病毒病原體等生物脅迫過程中發(fā)揮重要作用[4-5]，還廣泛參與了胚發(fā)生[6]、衰老[7]、休眠[8]、毛狀體發(fā)育[9]、種子發(fā)育[10]等過程，以及由植物激素如赤霉酸[11]、脫落酸(ABA)[12]或水楊酸[13]介導(dǎo)的一些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。同時，有證據(jù)[14]表明WRKY蛋白參與了對各種非生物脅迫的響應(yīng)。在擬南芥中過表達(dá)AtWRKY28蛋白可提高植物對多種非生物脅迫的抵抗力[15]；在水稻中過表達(dá)來自玉米的ZmWRKY114蛋白可提高陽性植株對鹽脅迫的耐受性；在水稻中過表達(dá)OsWRKY42蛋白雖然對生物脅迫無效果，但顯著延緩胼胝質(zhì)降解并增強(qiáng)對鹽脅迫的耐受性[16-17]。

雖然植物WRKY蛋白的研究已取得了很大的進(jìn)展，但對這個重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)家族的了解仍然有限。大豆是重要的農(nóng)作物，是人類植物蛋白質(zhì)、食用油和其他有益于健康的營養(yǎng)物質(zhì)的主要來源[18]。目前有多個團(tuán)隊(duì)[19-20]鑒定了大豆的WRKY蛋白家族，但主要是根據(jù)保守結(jié)構(gòu)域的電子鑒定。試驗(yàn)擬利用PCR技術(shù)克隆GmWRKY86，并利用qRT-PCR技術(shù)分析其在不同組織及非生物脅迫下的表達(dá)模式，為進(jìn)一步分析該基因的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙醇：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

大豆(Glycinemax)：富豆7號，黑龍江天昊種業(yè)有限公司；

總RNA快速提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒：北京百泰克生物科技有限公司；

ZT4-Blunt快速克隆試劑盒、qRT-PCR Mix試劑盒：北京莊盟生物科技有限公司。

1.1.2 主要儀器

紫外分光光度計(jì)：UV-360型，北京金石生物技術(shù)有限公司；

梯度PCR儀：MP60201型，珠海莫納生物科技有限公司；

熒光定量PCR儀：Lightlyder 2.0(RoChe)型，羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；

微孔板離心機(jī)：GC60101型，普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集

正常田間管理，植株生長30 d后，收集根、莖和葉組織，待植株開花后，收集花器官，用于RNA提取。幼苗生長30 d后，用50% PEG6000和200 mmol/L NaCl溶液進(jìn)行干旱和鹽脅迫處理，處理1，3，5，7 d后取上部葉片進(jìn)行基因表達(dá)分析。每個樣品取3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3 大豆總RNA提取及cDNA第一鏈合成

1.3.1 大豆總RNA提取 采用總RNA快速提取試劑盒Ultrapure RNA提取。使用UV-360紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度和純度。

1.3.2 cDNA第一鏈合成 采用含DNase的Fast Super RT Kit cDNA第一鏈合成試劑盒對總RNA進(jìn)行去除基因組DNA，再通過反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

1.4 GmWRKY86基因的克隆

設(shè)計(jì)引物GmWRKY86-F：5′-ATGTCCACTCCCAACACCGATTC-3′和GmWRKY86-R：5′-TTATACTATG ATTTGCTCTT CTTTCA-3′擴(kuò)增GmWRKY86的ORF序列，以大豆葉片的cDNA作為第一鏈為模板，進(jìn)行PCR鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)，再使用零背景ZT4-Blunt快速克隆試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接，將獲得的陽性克隆送往上海美吉生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN7預(yù)測GmWRKY86蛋白的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量；使用SMART在線預(yù)測分析保守區(qū)，利用NCBI中的BlastP程序進(jìn)行氨基酸一致性分析。進(jìn)化樹的構(gòu)建采用iTOL在線軟件操作。

1.6 熒光定量PCR分析

設(shè)計(jì)GmWRKY86基因熒光定量引物，GmWRKY86-qF：5′-TGGAAATGTAACTGTTCAGCC-3′和GmWRKY86-qR：5′-TCACTTGACCCAGGTAGTAGTTG-3′。大豆肌動蛋白基因作為內(nèi)參基因，引物序列為5′-CTTCCCTCAGCACCTTCCAA-3′和5′-GGTCCAGCTTTCACACTCCAT-3′，熒光定量反應(yīng)體系根據(jù)2×SYBR qPCR Mix說明書進(jìn)行操作。試驗(yàn)過程中選用LightCycler 2.0 (RoChe)型PCR進(jìn)行分析，需要重復(fù)3次試驗(yàn)操作。目的基因的mRNA水平采用2-ΔΔCT方法給予分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmWRKY86克隆及分析

課題組前期從鹽脅迫轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定到多個差異表達(dá)的GmWRKY成員，其中GmWRKY86變化模式最為顯著。利用大豆葉片的cDNA對GmWRKY86基因進(jìn)行克隆。經(jīng)測序分析發(fā)現(xiàn)GmWRKY86基因包含3個內(nèi)含子和4個外顯子，其開放閱讀框長度為1 572 bp，編碼523個氨基酸，所編碼蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為8.15，預(yù)測分子量為56.82 kDa。在Smart平臺對其氨基酸序列分析，結(jié)果表明GmWRKY86蛋白含有2個典型的WRKY結(jié)構(gòu)域，分別位于第228～286個氨基酸和第409～468個氨基酸(圖1)?；蚪M定位分析表明GmWRKY86定位于大豆基因組Chr08：20546448～20551296 reverse位置，含有3個內(nèi)含子組成和4個外顯子(圖2)。

為了進(jìn)一步分析該基因功能，從NCBI獲取陸地棉(Gossypiumhirsutum，AIE43850)、麻楓樹(Jatrophacurcas，KT935498)、苦蕎(Tartarybuckwheat，MK910374)、玉米(Zeamay，AIB05859)、野生棉(Gossypiumaridum，AIY62459)、水稻(OryzaSativa，AAT84154)、橡膠樹(Heveabrasiliensis，AEE81757)、草莓(Fragariavesca，APP13924)、葡萄(Vitisvinifera，AY596466)、高粱(Solanumlycopersicum，ADZ15316.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_193551.1) 11個物種的經(jīng)功能鑒定的WRKY成員，與大豆的GmWRKY86蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹。結(jié)果顯示這些成員可分為3個亞類，GmWRKY86蛋白與來自草莓的FvWRKY42蛋白和葡萄的VvWRKY2蛋白聚為一支(圖3)。

圖1 GmWRKY蛋白在大豆中的WRKY保守結(jié)構(gòu)域分析

圖2 大豆GmWRKY86蛋白結(jié)構(gòu)

圖3 GmWRKY86蛋白進(jìn)化樹分析

2.2 GmWRKY86的組織特異性分析

為了進(jìn)一步分析該基因功能，用熒光定量PCR方法分析了該基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示：在所有檢測的大豆組織中都存在GmWRKY86基因表達(dá)，其中在花中的表達(dá)量最高，種子中的表達(dá)量最低，其他組織中的表達(dá)量依次為葉>根>莖，提示GmWRKY86基因可能在大豆根莖葉感知逆境信號和激素信號中發(fā)揮重要作用，也說明GmWRKY86基因在大豆中廣泛發(fā)揮功能(圖4)。

圖4 GmWRKY86基因在大豆不同器官中的表達(dá)

2.3 非生物脅迫對GmWRKY86表達(dá)的影響

為了進(jìn)一步分析該基因的功能，利用熒光定量PCR技術(shù)分析了干旱和鹽脅迫前后該基因的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，GmWRKY86均能被干旱和鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，其中在第7天時鹽脅迫下的表達(dá)量為第0天的4倍左右，而同時期干旱脅迫下的表達(dá)量不到第0天的2倍(圖5)，表明該基因?qū)}脅迫更為敏感。Wei等[21]在擬南芥中過表達(dá)草莓的FvWRKY42基因，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中的SOD和CAT酶活顯著上升，并提高了對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受力。Mzid等[22]發(fā)現(xiàn)在煙草中過表達(dá)草莓的VvWRKY2蛋白也可以提高轉(zhuǎn)基因植株對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受力。試驗(yàn)結(jié)果表明GmWRKY86蛋白在抵抗鹽脅迫和干旱脅迫方面可能具有類似的功能。

圖5 干旱和鹽脅迫下GmWRKY86基因的表達(dá)

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用PCR和熒光定量方法，對大豆GmWRKY86基因進(jìn)行了克隆和表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)GmWRKY86基因含有兩個典型的WRKY保守結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)保守性決定了功能的特異性，在GmWRKY蛋白進(jìn)化樹分析基礎(chǔ)上，研究顯示大豆GmWRKY86蛋白與來自草莓的FvWRKY42和葡萄的VvWRKY2聚為一支，進(jìn)一步的組織特異性分析及干旱和鹽脅迫前后該基因的相對表達(dá)量分析，明確了大豆GmWRKY86蛋白在抵抗鹽脅迫和干旱脅迫方面發(fā)揮了重要作用。鹽脅迫和干旱會嚴(yán)重影響作物生長、滲透調(diào)節(jié)和光合作用，降低作物產(chǎn)量。因此，了解干旱和鹽脅迫的分子機(jī)制是生產(chǎn)此類作物的先決條件。但深刻闡述大豆GmWRKY86基因功能和分子機(jī)制，還需使用多種試驗(yàn)方法，包括轉(zhuǎn)基因大豆過表達(dá)或CRISPR-Cas9缺失表達(dá)，以進(jìn)一步揭示大豆WRKY基因家族和GmWRKY86生物學(xué)功能、分子機(jī)制和調(diào)控通路。