關(guān)山櫻大鼠亞慢性毒性研究

張成香 李世芬 王玉邦 張璐璐 嚴(yán) 婷 朱雪峰

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 211166；2. 江蘇省醫(yī)藥農(nóng)藥獸藥安全性評(píng)價(jià)與研究中心，江蘇 南京 211166)

關(guān)山櫻俗稱“紅纓”，是八重櫻的一個(gè)代表性品種。屬于薔薇科落葉小喬木，喜陽植物，在中國(guó)廣泛栽種。櫻花不僅極具觀賞價(jià)值，因其含有如總黃酮[1]、多糖[2]、多酚、揮發(fā)油[3-4]、多種維生素、氨基酸和微量元素[5-6]等人體所需的豐富的藥理活性物質(zhì)，其食用和藥用價(jià)值也被越來越多的專家學(xué)者認(rèn)可，各種櫻花制品如櫻花果醬、櫻花糕點(diǎn)、櫻花麻薯、櫻花蛋糕等制法已有相關(guān)專利[7-10]。李飛陽等[1]通過對(duì)關(guān)山櫻中總黃酮含量分析及抗氧化作用研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)山櫻中的總黃酮對(duì)亞硝酸鹽的清除作用強(qiáng)于傳統(tǒng)抗氧化劑VC；杜麗娟等[11]研究表明櫻花葉中的總黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性；李友偉等[2]研究發(fā)現(xiàn)櫻花多糖提取物也具有明顯的抗氧化活性；文飛龍等[3]研究發(fā)現(xiàn)櫻花中的揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基、ABTS+、亞硝酸鈉有明顯的清除作用；徐廣新等[12]通過櫻花提取物對(duì)酸奶發(fā)酵特性的影響研究發(fā)現(xiàn)，櫻花提取物的添加不僅促進(jìn)乳酸菌增殖，還可抑制酸奶的后酸化,且可提高酸奶的抗氧化活性； 王瑞瑞等[13]研究發(fā)現(xiàn)朱櫻花不僅有很強(qiáng)的抗氧化作用，而且還有一定的抗炎作用。雖然關(guān)于櫻花的成分和活性有很多報(bào)道，但櫻花是否可以食用以及長(zhǎng)期食用安全性未見相關(guān)報(bào)道。

試驗(yàn)擬以關(guān)山櫻為材料，SD大鼠為試驗(yàn)對(duì)象，經(jīng)過連續(xù)13周喂養(yǎng)，觀察其毒性作用，為其食用安全性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 試驗(yàn)材料

關(guān)山櫻干燥花：揚(yáng)州華而實(shí)食品有限公司，經(jīng)研磨成黃色粉末，冷藏保存，保質(zhì)期12個(gè)月；

試驗(yàn)動(dòng)物：SPF(Specific Pathogen Free，無特定病原體)級(jí)健康離乳SD大鼠100只，雌雄各半，上海西普爾—必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；

輻照鼠用滅菌飼料：江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限公司。

1.1.2 主要儀器

電子天平：T-1000型、JJ-100型，常熟市雙杰測(cè)試儀器廠；

離心機(jī)：TG1650-WS型，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；

顯微鏡：BX53型，日本奧林巴斯株式會(huì)社；

全自動(dòng)生化分析儀：7100型，日立高新國(guó)際貿(mào)易有限公司；

血液分析儀：ADVIA 2120i型，西門子股份公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng) 動(dòng)物飼養(yǎng)在溫度為20～26 ℃、相對(duì)濕度為40%～70%的屏障環(huán)境中。

1.2.2 劑量設(shè)定、分組及飼料配制方法 關(guān)山櫻人體推薦劑量人均3.0 g/d，以60 kg體重計(jì)算，受試樣品摻入基礎(chǔ)飼料百分含量最大為10%，故設(shè)高劑量為8.0 g/(kg·BW·d)(Ⅲ組)，中劑量為2.5 g/(kg·BW·d)(Ⅱ組)，低劑量為1.0 g/(kg·BW·d)(Ⅰ組)，分別相當(dāng)于人體推薦劑量的160，50，20倍，另設(shè)一個(gè)未處理對(duì)照組(C1組)及一個(gè)處理對(duì)照組(C2組)均為0 g/(kg·BW·d)。按動(dòng)物體重隨機(jī)分成5組，每組20只，雌、雄各半。

關(guān)山櫻按逐步稀釋的方法摻入基礎(chǔ)飼料中，基礎(chǔ)飼料的營(yíng)養(yǎng)成分為水分9.7%、粗纖維3.2%、粗脂肪5.4%、粗蛋白19.1%、粗灰分5.3%、總磷0.67%、鈣1.05%。按體重的8%折算，高、中、低劑量組摻入基礎(chǔ)飼料的百分含量分別為10.00%，3.13%，1.25%。高劑量組飼料中受試樣品摻入百分含量>5%，因此處理對(duì)照組飼料中填充甲基纖維素，摻入量等同高劑量，使其與高劑量組的飼料營(yíng)養(yǎng)素水平保持一致。同時(shí)設(shè)未處理對(duì)照組喂飼正?；A(chǔ)飼料[14-16]。高劑量組日糧組成為90.00%基礎(chǔ)飼料+10.00%關(guān)山櫻，中劑量組日糧組成為96.87%基礎(chǔ)飼料+3.13%關(guān)山櫻，低劑量組日糧組成為98.75%基礎(chǔ)飼料+1.25%關(guān)山櫻，處理對(duì)照組日糧組成為90.00%基礎(chǔ)飼料+10.00%甲基纖維素，未處理對(duì)照組日糧組成為100.00%基礎(chǔ)飼料。連續(xù)喂養(yǎng)13周，動(dòng)物自由進(jìn)食飲水。

1.2.3 方法及觀察指標(biāo) 每天觀察并記錄動(dòng)物的一般表現(xiàn)、行為、中毒表現(xiàn)和死亡情況。每周稱1次體重和1次食物攝入量。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行尿液常規(guī)檢查，包括外觀、尿蛋白、比重、pH值、葡萄糖、潛血等。試驗(yàn)結(jié)束后，隔夜禁食，逐只稱重，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血兩份，一份用抗凝采血管采血，測(cè)其血常規(guī)指標(biāo)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類、血紅蛋白濃度、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、紅細(xì)胞壓積、血小板計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間等，另一份用無抗凝劑的干燥管采血，離心，取血清，測(cè)其血生化指標(biāo)，包括血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、尿素、肌酐、血糖、總蛋白、白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、氯、鉀、鈉等。采血之后進(jìn)行大體解剖，分離腦、心臟、胸腺、腎上腺、肝臟、腎臟、脾臟、睪丸、附睪、子宮、卵巢，用生理鹽水洗凈，濾紙吸水后稱重，分別計(jì)算各臟器相對(duì)重量(臟/體)。對(duì)處理對(duì)照組、未處理對(duì)照組和高劑量組的這些臟器用甲醛固定，石蠟包埋，切片，HE染色后進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

1.3 試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS軟件(SPSS Statistics V22.0 標(biāo)準(zhǔn)版)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)體重、攝食量、臟器重量、血常規(guī)指標(biāo)、血生化學(xué)指標(biāo)和尿液指標(biāo)等原始數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，滿足方差齊性要求的數(shù)據(jù)資料用采用Mean±SD進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，采用單因素方差分析及SNK法進(jìn)行兩兩比較；對(duì)方差不齊的數(shù)據(jù)或等級(jí)數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)山櫻對(duì)大鼠體重的影響

各組大鼠在整個(gè)試驗(yàn)中生長(zhǎng)正常，試驗(yàn)前后體重均有增長(zhǎng)，但各組間體重比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別統(tǒng)計(jì)雌雄，見表1)，提示不同劑量關(guān)山櫻喂食大鼠13周對(duì)其體重并無影響。

2.2 關(guān)山櫻對(duì)大鼠攝食量的影響

喂養(yǎng)期間，經(jīng)口給予大鼠不同劑量的關(guān)山櫻13周，各組攝食量經(jīng)方差分析及SNK法兩兩比較，僅在第7周2.5 g/(kg·BW·d)組雌性大鼠(Ⅱ組)低于未處理對(duì)照組(C1組，P<0.05)。其余時(shí)間段及其他各組間雌雄分別比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)，提示關(guān)山櫻喂養(yǎng)大鼠對(duì)其攝食量影響不明顯，偶可見攝食量減少。

2.3 關(guān)山櫻對(duì)大鼠尿常規(guī)指標(biāo)的影響

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，尿常規(guī)檢查尿液外觀、尿蛋白、比重、pH、葡萄糖、潛血。采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，各組間雌雄分別統(tǒng)計(jì)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表3)，提示關(guān)山櫻喂養(yǎng)大鼠對(duì)尿常規(guī)無明顯影響。

表1 關(guān)山櫻對(duì)大鼠體重的影響

表2 各組大鼠攝食量的比較?

? *表示與C1組比較，P<0.05。

表3 關(guān)山櫻對(duì)大鼠尿常規(guī)指標(biāo)的影響?

? “-”表示陰性；“+-”表示弱陽性；“+”表示陽性。

2.4 關(guān)山櫻對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

經(jīng)口給予大鼠不同劑量的關(guān)山櫻第13周，測(cè)定各劑量組大鼠血液紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及其分類等、紅細(xì)胞壓積、血小板計(jì)數(shù)、凝血酶原時(shí)間、活化部分凝血活酶時(shí)間等指標(biāo)。采用單因素方差分析以及SNK法進(jìn)行兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。各組間雌雄分別統(tǒng)計(jì)，各項(xiàng)指標(biāo)組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表4)，提示關(guān)山櫻喂養(yǎng)大鼠對(duì)血常規(guī)無明顯影響。

表4 關(guān)山櫻對(duì)大鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

2.5 關(guān)山櫻對(duì)大鼠血生化指標(biāo)的影響

經(jīng)口給予大鼠不同劑量的關(guān)山櫻第13周，生化指標(biāo)檢查發(fā)現(xiàn)，除雄性大鼠尿素指標(biāo)2.5 g/(kg·BW·d)組(Ⅱ組)低于未處理對(duì)照組(C1組)外，其余血生化指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表5)，提示關(guān)山櫻喂養(yǎng)大鼠對(duì)生化指標(biāo)(包括肝腎功能、血糖血脂、血電解質(zhì))無明顯影響。

表5 關(guān)山櫻對(duì)大鼠血生化指標(biāo)的影響

? *表示與C1組比較，P<0.05。

2.6 關(guān)山櫻對(duì)大鼠臟器絕對(duì)重量及相對(duì)重量的影響

由表6可見，各劑量組主要臟器絕對(duì)重量及相對(duì)重量，組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示關(guān)山櫻喂養(yǎng)大鼠對(duì)重要臟器重量無明顯影響。

2.7 組織病理學(xué)檢查

各劑量組雌雄大鼠大體解剖觀察均未見異常變化。病理組織學(xué)檢查(圖1)發(fā)現(xiàn)，C1組肝臟輕微脂肪變性3例，C2組肝臟輕微脂肪變性4例，Ⅲ組肝臟輕微脂肪變性1例，其他器官組織均未見異常病理改變。由此可見，未見關(guān)山櫻引起的SD大鼠各臟器毒性病理改變，無損害作用。

圖1 C1組和Ⅲ組SD大鼠的臟器組織石蠟切片觀察結(jié)果

表6關(guān)山櫻對(duì)大鼠臟器重量的影響

Table6EffectofCerasuslannesianaalbo-roseaonvisceraweightinrats(n=10)

性別組別停食后體重/g肝重/g肝/體/%脾重/g脾/體/%腎重/g腎/體/%C1組274.8±29.77.14±0.892.61±0.240.51±0.050.19±0.021.69±0.120.62±0.07Ⅰ組259.4±16.86.75±0.472.60±0.090.48±0.060.18±0.021.68±0.130.65±0.03雌Ⅱ組248.3±28.56.23±0.732.51±0.140.49±0.110.20±0.041.55±0.170.63±0.05Ⅲ組253.7±25.46.50±0.702.56±0.140.48±0.060.19±0.031.58±0.170.63±0.05C2組231.2±30.26.20±0.732.69±0.210.47±0.060.21±0.021.54±0.170.67±0.06C1組527.2±29.713.54±1.172.57±0.180.82±0.080.16±0.023.08±0.250.58±0.04Ⅰ組490.8±37.013.18±1.362.68±0.150.84±0.060.17±0.023.01±0.220.61±0.03雄Ⅱ組502.2±45.813.32±1.802.65±0.170.80±0.070.16±0.022.89±0.180.58±0.05Ⅲ組459.9±31.811.79±1.722.58±0.430.71±0.080.16±0.032.83±0.330.62±0.08C2組437.8±37.811.40±1.052.61±0.140.70±0.110.16±0.032.58±0.160.59±0.04性別組別性腺重/g性腺/體/%腦重/g腦/體/%心重/g心/體/%胸腺重/gC1組0.15±0.020.06±0.011.74±0.110.64±0.080.97±0.140.36±0.040.42±0.13Ⅰ組0.14±0.020.05±0.011.76±0.070.68±0.050.88±0.050.34±0.020.40±0.09雌Ⅱ組0.12±0.010.05±0.011.69±0.110.69±0.060.86±0.080.35±0.040.38±0.09Ⅲ組0.13±0.030.05±0.011.71±0.080.68±0.070.88±0.120.35±0.030.37±0.07C2組0.14±0.020.06±0.011.52±0.110.67±0.080.81±0.090.35±0.040.35±0.08C1組3.00±0.140.57±0.052.17±0.150.41±0.021.64±0.080.31±0.020.65±0.16Ⅰ組3.00±0.270.61±0.082.03±0.100.41±0.031.63±0.140.33±0.030.58±0.14雄Ⅱ組3.02±0.410.60±0.101.99±0.050.40±0.041.59±0.160.32±0.030.60±0.14Ⅲ組2.88±0.140.63±0.061.96±0.070.43±0.041.49±0.180.33±0.030.47±0.09C2組2.58±0.230.59±0.051.87±0.120.43±0.041.46±0.160.33±0.040.45±0.05性別組別胸腺/體/%腎上腺重/g腎上腺/體/%子宮重/g子宮/體/%附睪重/g附睪/體/%C1組0.15±0.040.068±0.0110.025±0.0040.53±0.240.20±0.11Ⅰ組0.16±0.030.051±0.0130.020±0.0050.53±0.150.21±0.06雌Ⅱ組0.15±0.030.053±0.0140.022±0.0080.56±0.120.23±0.05Ⅲ組0.15±0.030.049±0.0070.020±0.0030.48±0.110.19±0.04C2組0.15±0.020.058±0.0190.025±0.0090.55±0.200.24±0.09C1組0.12±0.030.056±0.0160.011±0.0031.22±0.130.23±0.03Ⅰ組0.12±0.030.063±0.0080.013±0.0021.27±0.070.26±0.03雄Ⅱ組0.12±0.030.058±0.0130.012±0.0021.15±0.210.23±0.05Ⅲ組0.10±0.020.047±0.0130.010±0.0021.08±0.100.24±0.03C2組0.10±0.010.051±0.0190.012±0.0031.09±0.100.25±0.02

3 結(jié)論

給予SD大鼠人體推薦劑量160倍的關(guān)山櫻，未觀察到有害作用，表明亞慢性毒性是安全的。但試驗(yàn)僅從長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)方面對(duì)關(guān)山櫻的安全性作了探討，在此基礎(chǔ)上，還可開展遺傳毒性試驗(yàn)、功能性試驗(yàn)，為關(guān)山櫻的食用安全性和功效性提供更多的數(shù)據(jù)支持。