揉面過程中面團(tuán)面筋蛋白結(jié)構(gòu)的變化

孟 蓮 周惠明,2 朱科學(xué) 郭曉娜

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2. 江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210000)

揉面是手搟面制作工藝中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)之一，也是手搟面口感爽滑筋道，深受人們喜愛的原因之一。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)面條工藝的研究主要集中于和面、熟化。楊玉玲等[1]研究了和面方式對(duì)面團(tuán)流變學(xué)特性及面條品質(zhì)的影響；Don等[2]發(fā)現(xiàn)面團(tuán)中麥谷蛋白大聚體含量隨熟化時(shí)間的延長(zhǎng)而升高；陳潔等[3]研究了熟化溫度，以期通過調(diào)整醒面溫度獲得不同用途的面團(tuán)。而關(guān)于傳統(tǒng)工藝中揉面這一環(huán)節(jié)的研究很少。Scepanovic等[4]通過Tanner多模損傷模型，模擬理想揉面機(jī)幾何形狀，數(shù)值化研究了面團(tuán)揉捏過程的微觀結(jié)構(gòu)損傷及流動(dòng)行為。該研究是從力學(xué)角度探索理想化的揉面條件，未涉及揉捏對(duì)面團(tuán)這一黏彈體系產(chǎn)生的作用和貢獻(xiàn)。邵麗芳等[5]研究發(fā)現(xiàn)，揉面可使冷凍熟面質(zhì)構(gòu)品質(zhì)顯著提升，手工揉面比機(jī)器揉面效果更為顯著。但仍缺乏關(guān)于面團(tuán)揉捏過程中面筋蛋白結(jié)構(gòu)變化和交聯(lián)機(jī)制的研究。

面筋形成過程主要是蛋白質(zhì)分子通過氫鍵發(fā)生水合作用，蛋白質(zhì)分子自身通過二硫鍵發(fā)生聚集[6]。由于水合作用，面筋蛋白產(chǎn)生一定的內(nèi)聚性和黏附性[7]。通過SH-SS交換或在分子水平上發(fā)生非共價(jià)相互作用(氫鍵或疏水)，誘導(dǎo)大分子聚集，并改變面筋的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使面團(tuán)的物理和流變特性發(fā)生變化[8]。麥醇溶蛋白使面團(tuán)具有黏性和延展性，而麥谷蛋白通過聚合物網(wǎng)絡(luò)的形成在面團(tuán)的彈性中起關(guān)鍵作用，故面團(tuán)的麥醇溶蛋白與麥谷蛋白的比例(Gli/Glu)影響面團(tuán)的形成[9]。此外，二硫鍵或疏水性相互作用可能會(huì)加速麥谷蛋白的聚集[10-11]。

試驗(yàn)擬對(duì)手工揉面過程中面團(tuán)面筋蛋白的結(jié)構(gòu)變化規(guī)律及交聯(lián)作用進(jìn)行深入研究，為面條的品質(zhì)改良和傳統(tǒng)工藝發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

小麥粉：金龍魚麥芯粉，含水量14.43%，蛋白質(zhì)含量9.95%，益海嘉里糧油有限公司；

十二烷基硫酸鈉、尿素、乙二胺四乙酸、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、異丙醇等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

二硫蘇糖醇、Ellman試劑、β-巰基乙醇：分析純，美國(guó)Sigma公司；

乙腈：色譜純，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

和面機(jī)：JHMZ-200型，北京東孚久恒儀器技術(shù)有限公司；

生化培養(yǎng)箱：LRH-250型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

物性分析儀：TA-XT plus型，英國(guó)SMS公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：NEXUS型，美國(guó)尼高力儀器公司；

高效液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 面團(tuán)的制備 稱取200 g小麥粉，96 g去離子水與2 g鹽于針式和面機(jī)中，混合5 min，分別揉面2，4，6，8，10，15 min后，放置于30 ℃，濕度80%的恒溫箱中靜置20 min，冷凍干燥，研磨成粉，過80目篩備用，每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3.2 面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性的測(cè)定

(1) 硬度和彈性：用A/DP裝置制備測(cè)試面團(tuán)，采用P/1S型號(hào)探頭，測(cè)試前、中、后速度分別為2，1，5 mm/s，形變35%，接觸時(shí)間1 s，觸發(fā)力5 g。

(2) 黏性：用A/DSC裝置制備測(cè)試面團(tuán)，采用P/25型號(hào)探頭，測(cè)試前、中、后速度分別為0.5，0.5，10.0 mm/s，應(yīng)力40 g，接觸時(shí)間0.1 s，觸發(fā)力5 g。

1.3.3 面團(tuán)中游離巰基與二硫鍵含量的測(cè)定 根據(jù)Beveridge等[12-13]的方法稍作修改。將冷凍面團(tuán)(0.4 g)分散于10.0 mL 0.2 mol/L Tris-Gly緩沖液(pH 8.0，含8 mol/L尿素，3 mmol/L EDTA，1% SDS)中，攪拌提取1 h。懸浮液13 600 r/min離心10 min，收集上清液。測(cè)定游離巰基時(shí)，在4 mL上清液中加入0.1 mL 10 mmol/L DTNB，室溫反應(yīng)20 min，412 nm處讀取吸光度。測(cè)定總巰基時(shí)，將0.1 mLβ-巰基乙醇和4 mL 0.2 mol/L Tris-Gly緩沖液加入1 mL上層清液，室溫下振蕩混合1 h，加入10 mL 12%的三氯乙酸，再振蕩混合1 h，5 000 r/min離心10 min，取上清，重復(fù)3次，收集最終沉淀物，于10 mL 0.2 mol/L Tris-Gly緩沖液中溶解，加入0.1 mL 10 mmol/L DTNB混合，測(cè)定吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將L-半胱氨酸溶解在0.2 mol/L Tris-Gly緩沖液中，制備巰基標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.00，0.02，0.03，0.04，0.05，0.06 μmol/mL)。將4 mLL-半胱氨酸溶液與0.1 mL 10 mmol/L DTNB溶液混合，測(cè)定溶液吸光度。建立巰基濃度與吸光度的關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線，按式(1)、(2)分別計(jì)算巰基、二硫鍵含量。

(1)

(2)

式中：

m——巰基含量，μmol/g；

C——冷凍面團(tuán)濃度，g/mL；

S——巰基濃度，μmol/mL；

n——上層清液稀釋系數(shù)。

m2——二硫鍵含量，μmol/g；

m1——總巰基含量，μmol/g；

m3——游離巰基含量，μmol/g。

1.3.4 面團(tuán)蛋白質(zhì)分子間作用力的測(cè)定 參考Gómez-Guillén等[14]的方法并修改，取A、B、C 3組樣品各0.1 g，A樣品加入5 mL 0.6 mol/L NaCl(SA)溶液，B樣品加入5 mL 0.6 mol/L NaCl和1.5 mol/L尿素(SB)溶液，C樣品加入5 mL 0.6 mol/L NaCl和8 mol/L尿素(SC)溶液，混合均勻。4 ℃靜止1 h，3 000 r/min離心15 min，取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定上清液蛋白質(zhì)含量。溶解在SB與SA溶液的蛋白含量差表示氫鍵；溶解在SC與SB溶液的蛋白質(zhì)含量差表示疏水相互作用。

1.3.5 面團(tuán)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 參照Chompoorat等[15-16]的方法并加以修改，將樣品與KBr按比例(1∶50，質(zhì)量比)混合，研磨均勻，使用配套壓片機(jī)制得透明薄片，進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描(400～4 000 cm-1)，掃描次數(shù)16，分辨率4 cm-1。利用Omnic和Peak Fit v4.12軟件分析數(shù)據(jù)，進(jìn)行二階導(dǎo)數(shù)擬合，根據(jù)各結(jié)構(gòu)對(duì)應(yīng)的區(qū)間范圍計(jì)算其所占百分比含量。

1.3.6 面團(tuán)蛋白質(zhì)交聯(lián)程度的測(cè)定 參照Lagrain等[17]的方法并修改，準(zhǔn)確稱取一定量的面團(tuán)凍干樣品(含1.00 mg干基蛋白質(zhì))，溶解于1.0 mL的樣品緩沖液(含有2.0% SDS的0.05 mol/L，pH 6.8磷酸鹽緩沖液)中，室溫振蕩30 min，8 000 r/min離心10 min，取上清液過0.45 μm濾膜備用。采用美國(guó)Biosep-SEC-S4000色譜柱(300 mm×7.8 mm，15～500 kDa)，流動(dòng)相為50%乙腈(含有0.05%的三氟乙酸)，流速0.9 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量60 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm?？偯娼畹鞍椎奶崛∮煤?.0 mol/L尿素和1.0%二硫蘇糖醇的樣品緩沖液溶解樣品，其余操作步驟一致。

1.3.7 面團(tuán)蛋白質(zhì)亞基占比的測(cè)定 參考Bruneel等[18]的方法并稍作修改，準(zhǔn)確稱取含有50.00 mg干基蛋白質(zhì)的面團(tuán)凍干樣品，先用含有0.4 mol/L氯化鈉的1.5 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.6)提取兩次，棄上清液，再用1.5 mL的去離子水提取一次，棄上清液；將沉淀物用1.5 mL 60%乙醇提取3次，室溫離心(15 000 r/min)后收集上清液，即為麥醇溶蛋白的提取液；沉淀物用1.5 mL含有50%異丙醇，2.0 mol/L尿素，1.0%二硫蘇糖醇的Tris-HCl 緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.5)于60 ℃下提取3次，室溫離心(15 000 r/min)后收集上清液，即為麥谷蛋白的提取液，過0.45 μm濾膜后備用。選用德國(guó)Nucleosil 300-5 C8色譜柱，流動(dòng)相分別為含有0.1%的三氟乙酸的超純水(A液)和含有0.1%的三氟乙酸的乙腈(B液)，洗脫條件為二元高壓梯度洗脫，洗脫液中B的濃度為24.0%～56.0%。流動(dòng)相總流速1 mL/min，柱溫50 ℃，進(jìn)樣量100 μL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。參考Wieser等[19-20]的方法將各峰區(qū)分，并計(jì)算各亞基所對(duì)應(yīng)洗脫曲線的峰面積。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 采用SPSS 23.0在P<0.05檢驗(yàn)水平上進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)表示為(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)；采用Origin 2016制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 揉面過程中面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性的變化

由圖1可知，揉面可使面團(tuán)硬度、彈性和黏性增加，當(dāng)揉面時(shí)間為10～15 min時(shí)，硬度大幅增加，黏性和彈性發(fā)生輕微下降。這可能是由于揉面初期，在力的作用下，面團(tuán)中蛋白質(zhì)大分子相互纏結(jié)，形成部分應(yīng)力，使得面團(tuán)變得堅(jiān)韌和致密；揉面后期因外力作用時(shí)間過長(zhǎng)，在內(nèi)部產(chǎn)生的應(yīng)力經(jīng)熟化靜置后并未完全消去，存在殘余應(yīng)力使得面團(tuán)吸水能力和彈性性能輕微下降。

圖1 揉面過程中面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性的變化

Figure 1 Changes in dough texture characteristics during kneading

2.2 揉面過程中面團(tuán)巰基與二硫鍵含量的變化

由表1可知，隨著揉面時(shí)間的延長(zhǎng)，巰基—二硫鍵互換增多，二硫鍵逐漸增加，表明此階段，面筋蛋白內(nèi)部發(fā)生了二硫鍵交聯(lián)，且交聯(lián)程度不斷增強(qiáng)。當(dāng)揉面時(shí)間為2 min時(shí)，游離巰基的減少率與二硫鍵的增長(zhǎng)率分別為10.69%，4.48%，隨后緩慢互為轉(zhuǎn)換；當(dāng)揉面時(shí)間為6～10 min時(shí)，二者轉(zhuǎn)換速率幾乎為零；當(dāng)揉面時(shí)間為15 min時(shí)，互換速率增大，游離巰基的減少率與二硫鍵的增長(zhǎng)率分別為17.19%，5.09%。這可能是由于揉面初期，在力的作用下蛋白質(zhì)分子與水分子深度接觸，水合作用增強(qiáng)，水溶的氧分子促進(jìn)了游離巰基氧化為二硫鍵；隨著揉面時(shí)間的延長(zhǎng)，水合作用進(jìn)一步增強(qiáng)，直至飽和；揉面后期由于面團(tuán)長(zhǎng)時(shí)間被360°揉捏暴露于空氣中，蛋白質(zhì)分子與氧氣接觸增多，一定程度上促進(jìn)了氧化作用。

表1 揉面過程中面團(tuán)巰基與二硫鍵的變化?

? 同列字母不同表示有顯著性差異(P<0.05)。

2.3 揉面過程中面團(tuán)蛋白質(zhì)分子間作用力的變化

由圖2可知，揉面初期，氫鍵大量形成，隨后含量趨于穩(wěn)定；疏水相互作用先大幅下降后趨于平緩。當(dāng)揉面時(shí)間為0 min時(shí)，疏水相互作用相對(duì)處于較高水平，氫鍵處于較低水平，是由于揉捏使面團(tuán)中水分子與蛋白質(zhì)分子進(jìn)一步接觸，蛋白質(zhì)分子與水分子間的氫鍵結(jié)構(gòu)取代了水—水氫鍵結(jié)構(gòu)，蛋白質(zhì)與水相互作用增強(qiáng)直至趨于飽和狀態(tài)，此外，疏水相互作用與自由巰基的氧化有關(guān)，游離巰基氧化形成二硫鍵使蛋白質(zhì)疏水相互作用降低[21]。面團(tuán)蛋白質(zhì)分子與水分子的進(jìn)一步結(jié)合，疏水相互作用下降，面筋蛋白分子聚集和締合形成緊密的網(wǎng)絡(luò)，提高了蛋白質(zhì)的彈性，使其結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，增強(qiáng)了面團(tuán)的彈性，與上述質(zhì)構(gòu)特性結(jié)果一致。

圖2 揉面過程中面團(tuán)蛋白質(zhì)分子間作用力的變化

Figure 2 Changes of protein intermolecular forces in dough during kneading

2.4 揉面過程中面團(tuán)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

酰胺I帶對(duì)應(yīng)的拉曼光譜可用于表征蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，1 614～1 640 cm-1對(duì)應(yīng)的譜峰可歸于β-折疊，1 640～1 650 cm-1對(duì)應(yīng)的譜峰可歸于無(wú)規(guī)則卷曲，1 650～1 660 cm-1對(duì)應(yīng)的譜峰可歸于α-螺旋，1 660～1 685 cm-1對(duì)應(yīng)的譜峰可歸于β-轉(zhuǎn)角[22-24]。由圖3可知，揉面過程中面團(tuán)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)：α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角處于動(dòng)態(tài)波動(dòng)狀態(tài)，基本無(wú)變化；無(wú)規(guī)則卷曲揉面初期驟降56.52%，β-折疊揉面初期增加32.34%，隨后二者變化幅度較小。這表明揉面過程中面團(tuán)蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化主要取決于β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲，進(jìn)而影響面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成。β-折疊一般被認(rèn)為是所有二級(jí)結(jié)構(gòu)中最為穩(wěn)定的一種構(gòu)象。Choi等[25]研究表明，相比β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲，α-螺旋和β-折疊屬于比較有序化的構(gòu)象，具有較高的穩(wěn)定性。故揉面可大幅提升面筋蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性和有序性。隨著揉面的進(jìn)行，β-折疊有小幅度的增加和降低變化，與二硫鍵含量變化趨勢(shì)一致，可能是由于二硫鍵有促進(jìn)蛋白結(jié)構(gòu)更易于形成β-折疊的作用[26]。

圖3 揉面過程中面團(tuán)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

Figure 3 Changes of dough protein secondary structure during kneading

2.5 揉面過程中面團(tuán)面筋蛋白可萃取率的變化

Pareyt等[27]研究表明，SDS可萃取麥谷蛋白的保留時(shí)間為5.00～7.25 min，SDS可萃取麥醇溶蛋白的保留時(shí)間為7.25～10.50 min。由圖4可知，隨著揉面的進(jìn)行，麥谷蛋白的峰面積下降趨勢(shì)不明顯，麥醇溶蛋白的峰面積有不同程度的下降，揉面后期，麥醇溶蛋白峰面積有一定程度增加，但仍然低于0 min的。這表明在揉面階段，麥醇溶蛋白發(fā)生聚合，而麥谷蛋白僅有輕微下降，結(jié)果不明顯，有待進(jìn)一步研究認(rèn)證。

由圖5可知，隨著聚集過程的進(jìn)行，SDS可提取部分減少，SDS不可提取部分增加[28]。揉面過程中，麥谷蛋白萃取率下降幅度雖然較小，但不同樣品間具有顯著性差異(P<0.05)，麥醇溶蛋白萃取率揉面初期下降，揉面后期(8～15 min)有所提升，但仍然低于0 min的，與圖4結(jié)果一致。揉面后期麥醇溶蛋白和麥谷蛋白的萃取率發(fā)生不同程度提升，可能是因?yàn)槿嗝婧笃诿鎴F(tuán)已充分水合，且施加作用力時(shí)間過長(zhǎng)，產(chǎn)生的機(jī)械可導(dǎo)致蛋白發(fā)生輕微解聚，或是使蛋白構(gòu)象發(fā)生一定變化。

圖4 揉面過程中SDS可萃取面筋蛋白的SE-HPLC圖譜

Figure 4 SE-HPLC chromatogram of SDS extractable gluten protein during kneading

圖5 揉面過程中面團(tuán)面筋蛋白SDS可萃取率的變化

Figure 5 Changes in SDS extractable rate of dough gluten protein during kneading

2.6 揉面過程中面團(tuán)蛋白質(zhì)亞基占比的變化

面筋提取物可分為兩大類，分別是麥醇溶蛋白亞基(ω-、α-、γ-麥醇溶蛋白)和麥谷蛋白亞基(HMW-GS和LMW-GS)，其中LMW-GS又可分為B/C-LMW-GS和D-LMW-GS[29-30]。由圖6可知，揉面過程中，ω-麥醇溶蛋白亞基峰面積無(wú)明顯變化，γ-麥醇溶蛋白亞基峰面積僅在揉面初期(2 min)發(fā)生下降，隨后與初始值差異不大，α-麥醇溶蛋白亞基峰面積明顯下降，尤其是揉面初期最為顯著，與麥醇溶蛋白的SDS可萃取率下降趨勢(shì)一致。

圖6 揉面過程中面團(tuán)蛋白亞基的變化

Figure 6 Changes in dough protein subunits during kneading

揉面過程中α-麥醇溶蛋白亞基峰面積分別降低了22.42%，10.87%，11.59%，12.87%，9.22%，4.35%，表明隨著揉面的進(jìn)行，面團(tuán)黏性和延展性得到加強(qiáng)。麥谷蛋白的B/C-LMW-GS峰面積顯著增加，HMW-GS峰面積無(wú)明顯變化，說(shuō)明揉面過程中麥谷蛋白交聯(lián)程度增強(qiáng)主要是以低分子量麥谷蛋白為主。LMW-GS是小麥面筋蛋白的主要成分之一，決定著面團(tuán)的面筋強(qiáng)度和彈性[31]。揉面過程中B/C-LMW-GS峰面積分別增加了4.56%，2.61%，4.11%，6.73%，3.18%，0.81%，表明隨著揉面的進(jìn)行，面團(tuán)彈性得到增強(qiáng)。

3 結(jié)論

隨著揉面的進(jìn)行，面團(tuán)黏彈性增強(qiáng)，揉面初、中期(0～8 min)面團(tuán)的游離巰基下降，二硫鍵增多，氫鍵增多，疏水作用力下降；二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β-折疊增多，無(wú)規(guī)則卷曲下降，α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角無(wú)明顯變化；面筋蛋白、麥醇溶蛋白、麥谷蛋白的SDS可萃取率均有不同程度下降；麥谷蛋白主要是以低分子量蛋白發(fā)生交聯(lián)聚合，麥醇溶蛋白的α-、γ-麥醇溶蛋白亞基參與了面筋蛋白的交聯(lián)聚合反應(yīng)。揉面后期(10～15 min)，各指標(biāo)或是趨勢(shì)變得平緩或是發(fā)生不同程度反彈，但依然區(qū)別于初始值(0 min)。因此，在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，可增加揉面工藝，選取適當(dāng)時(shí)間，可一定程度上改善面團(tuán)的黏彈性，進(jìn)而改善面條品質(zhì)。試驗(yàn)僅從面團(tuán)面筋蛋白結(jié)構(gòu)構(gòu)象或成分含量的變化解釋面團(tuán)黏彈性變化，后續(xù)可從非線性力學(xué)角度(如流變學(xué)特性等)定量或定性表征揉面過程中面團(tuán)面筋蛋白黏彈性變化，使研究更加完善。