深圳地區(qū)血紅蛋白G的分子特征與血液學(xué)表型*

李育敏，金瀟，張宇英，張力軍，陳亞瓊，覃俊龍，張秀明

(深圳市羅湖區(qū)人民醫(yī)院a.醫(yī)學(xué)檢驗科，b.感染管理科，廣東深圳518001)

異常血紅蛋白病是由于珠蛋白基因缺陷導(dǎo)致珠蛋白分子的一級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變引起的一組遺傳性血紅蛋白病[1]。血紅蛋白G(HbG)病于 1954 年由 Edington等[2]首次報道。我國流行病學(xué)調(diào)查顯示,在中國人群中發(fā)現(xiàn)的HbG種類有Hb G-Honolulu(Hb G-Chinese)、Hb G-Taipei、Hb G-Coushatta、Hb G-Waimanalo、Hb G-San José、Hb G-Siriraj和Hb G-Makassar等，南方地區(qū)以Hb G-Honolulu和Hb G-Taipei為主，北方以Hb G-Coushatta和Hb G-Taipei為主[3-10]。目前報道中國人群HbG病個別類型的臨床表型的案例較少[7,10]。鑒于不同類型的HbG可位于同一毛細(xì)管電泳分區(qū)內(nèi)，并可由α珠蛋白基因或是β珠蛋白基因缺陷所致，需通過DNA測序才能鑒定其類型，本研究通過篩查72 397例毛細(xì)管電泳樣本，對所檢出的異常血紅蛋白進(jìn)行珠蛋白基因序列分析，總結(jié)和分析鑒定出的HbG的分子特征和血液學(xué)表型，為血紅蛋白疾病的篩查和遺傳咨詢提供參考。

1 對象和方法

1.1研究對象 連續(xù)選擇2016年6月至2019年5月來我院門診和住院且檢測血紅蛋白電泳者共72 397例。

1.2標(biāo)本采集 采集各研究對象就診時的外周靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，2～8 ℃保存，用于紅細(xì)胞參數(shù)，血紅蛋白電泳分析，地貧基因和DNA測序檢測。

1.3儀器與試劑 Capillarys2全自動毛細(xì)管電泳儀及其配套試劑 (法國Sebia公司)；XN-1000血細(xì)胞分析儀及其配套試劑(日本Sysmex公司)；T960擴(kuò)增儀(中國黑馬公司)；ChemiDocTMMP全自動凝膠成像分析儀(美國Bio-Rad公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；YN-H16恒溫雜交儀及其配套試劑(深圳亞能公司)；3730XL遺傳分析儀(美國ABI公司)。

1.4血液學(xué)分析 采用毛細(xì)管電泳法進(jìn)行血紅蛋白分析，電泳圖分為Z1～Z15區(qū)，分區(qū)鑒別Hb條帶的類型，并分析各條帶所占相對比例的含量。對毛細(xì)管電泳檢出的異常血紅蛋白樣本采用全自動血液分析儀進(jìn)行各項紅細(xì)胞參數(shù)分析，檢測指標(biāo)為Hb、MCV和MCH。以上檢測均按照儀器及試劑盒說明書進(jìn)行。MCV參考區(qū)間為82～100 fL，MCH參考區(qū)間為27～34 pg，Hb參考區(qū)間為成年男性：130～175 g/L；成年女性：115～150 g/L[11]。

1.5地貧基因檢測 對毛細(xì)管電泳檢出的異常血紅蛋白樣本采用Gap-PCR法檢測3種中國人群常見的缺失型α地貧基因(--SEA、-α3.7和-α4.2)；采用PCR-RDB法檢測常見的3種非缺失α地貧基因(αQS、αCS、αWS)和17種β地貧基因點突變類型(-28、-29、CD17、CD41-42、CD43、βE、CD71-72、IVS-Ⅱ-654、-32、-30、CAP、Initiation condon、CD14-15、CD27-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、CD31)。以上檢測操作及結(jié)果判讀均按照儀器及試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6珠蛋白基因序列分析 珠蛋白基因測序由深圳亞能公司檢測。對毛細(xì)管電泳檢出的異常血紅蛋白樣本采用PCR法擴(kuò)增α1、α2和β珠蛋白基因[12-13]；采用Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行珠蛋白基因序列測定；采用Vector NET 8.0軟件進(jìn)行測序結(jié)果比對，于人類異常血紅蛋白和地中海貧血數(shù)據(jù)庫(http://globin.bx.psu.edu)查找突變位點。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1HbG的分子特征 經(jīng)珠蛋白基因序列分析，共鑒定出6種異常HbG(圖1)，發(fā)生率為0.047%(34/72 397)，發(fā)生于α鏈的為Hb G-Honolulu(15例)和Hb G-Waimanalo(2例)，發(fā)生于β鏈的為Hb G-Taipei(9例)、Hb G-Coushatta(5例)、Hb G-San José(2例)和Hb G-Siriraj(1例)，其中3例為新生兒(2例Hb G-Taipei和1例Hb G-Coushatta)，其余均為成人。除1例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-654及αIVS-Ⅱ-55(G→T)突變雜合子(圖2A)，2例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-81(C→T)突變雜合子(圖2B)和1例Hb G-Honolulu合并αCD118(+TCA)突變雜合子(圖2C)外，其余均為單純HbG雜合子。

注：A，Hb G-Honolulu；B，Hb G-Waimanalo；C，Hb G-Taipei；D，Hb G-Coushatta；E，G-San José；F，Hb G-Siriraj；↓，突變位點。

注：A，IVS-Ⅱ-55；B，IVS-Ⅱ-81；C，CD118；↓，突變位點。

圖2 IVS-Ⅱ-55、IVS-Ⅱ-81和CD118突變的DNA測序結(jié)果

2.2血液學(xué)表型分析 成人各類型單純HbG雜合子、Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-81突變雜合子和Hb G-Honolulu合并αCD118突變雜合子的Hb、MCV、MCH和HbA2均正常；Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-654及αIVS-Ⅱ-55突變雜合子的MCV和MCH均降低,HbA2升高，以上各類型的HbG含量見表1。毛細(xì)管電泳分析示新生兒Hb G-Taipei的含量為(2.3±0.6)%；Hb G-Coushatta的含量為4.1%，其余見表2。

表1 成人不同HbG類型的血液學(xué)表型

注：*，以上指標(biāo)在本院檢驗科檢測；△，α鏈HbG的HbA2為HbA2+變異體，β鏈為HbA2。

表2 3例新生兒HbG雜合子的毛細(xì)管電泳分析

注：*，以上指標(biāo)在本院檢驗科檢測。

3 討論

本次研究共納入深圳地區(qū)72 397例樣本進(jìn)行大規(guī)模的群體異常血紅蛋白病篩查，結(jié)果顯示HbG的發(fā)生率為0.047%，共發(fā)現(xiàn)了6種HbG類型，與我國南方地區(qū)HbG的種類分布相符合[3-7]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)2種位于α鏈的HbG，分別為G-Honolulu和Hb G-Waimanalo，均為雜合子，以Hb G-Honolulu為主，占44.1%，發(fā)生率為0.021%。Hb G-Honolulu(Hb G Chinese)于1958年由Vella等[14]在新加坡華人中首次發(fā)現(xiàn)。筆者曾報道Hb G-Honolulu在深圳地區(qū)α鏈異常血紅蛋白中分布最高[7]。Hb G-Waimanalo于1971年由Blackwell等[15]首先在美國夏威夷具有菲律賓血統(tǒng)的人群中發(fā)現(xiàn)。兩者均廣泛分布于我國南方地區(qū)[3-7]。本研究顯示兩者的單純雜合子臨床表型均正常，HbG的含量均在23%左右，與HbVar記錄相符合。另外，本研究發(fā)現(xiàn)了1例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-654和αIVS-Ⅱ-55雜合突變，1例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-81雜合突變，以及1例Hb G-Honolulu合并αCD118雜合突變。βIVS-Ⅱ-654、αIVS-Ⅱ-55和βIVS-Ⅱ-81突變位點均發(fā)生于內(nèi)含子上。內(nèi)含子由于不形成翻譯產(chǎn)物，不受自然選擇的壓力，可能比外顯子累積更多的突變。而發(fā)生于珠蛋白基因非編碼內(nèi)含子區(qū)域的突變通常是影響mRNA剪切使珠蛋白鏈合成受限，因此，目前在HbVar 數(shù)據(jù)庫上記錄的影響血紅蛋白功能的大部分內(nèi)含子突變也位于剪接位點。IVS-Ⅱ-654(C>T)突變即是由于內(nèi)含子序列發(fā)生改變影響了轉(zhuǎn)錄后的正常剪切，產(chǎn)生異常剪接產(chǎn)物使β鏈合成減少，屬于β+地貧。IVS-Ⅱ-81突變(HBB:c.315+81C>T)在HbVar記錄發(fā)生于印度人群，可能為中性多態(tài)性位點。筆者[7]也曾報道1例Hb Queens合并βIVS-Ⅱ-81雜合突變，其表型正常。IVS-Ⅱ-55(G>T)突變尚未在HbVar記錄，但其突變發(fā)生于內(nèi)含子的非剪接位點。筆者[16]曾報道單純αIVS-Ⅱ-55雜合突變的臨床表型正常。以上研究提示αIVS-Ⅱ-55和βIVS-Ⅱ-81均可能為中性多態(tài)性位點，不影響珠蛋白基因的表達(dá)，其合并單純Hb G-Honolulu雜合子的臨床表型正常。因此，本例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-654和αIVS-Ⅱ-55攜帶者符合輕型β地貧特征，表現(xiàn)為MCV、MCH降低和HbA2升高，但其Hb G-Honolulu含量較單純Hb G-Honolulu雜合子降低，這可能與βIVS-Ⅱ-654雜合突變導(dǎo)致β珠蛋白基因表達(dá)減少有關(guān)。由于未進(jìn)行家系調(diào)查，尚不清楚其Hb G-Honolulu和IVS-Ⅱ-55是否發(fā)生于同一條α鏈。同樣，本例Hb G-Honolulu合并βIVS-Ⅱ-81雜合突變的臨床表型正常。CD118突變(HBA1:c.357_358insTCA)發(fā)生于α1基因，在HbVar上未見記錄，但在中國人群中有報道，屬于α+地貧[1]。筆者[7]曾報道Hb Ube-2合并αCD118雜合突變的表型正常，表明CD118突變對珠蛋白基因的功能影響較小，其合并同樣不影響血紅蛋白功能的異常血紅蛋白的臨床表型正常。因此，本研究中的Hb G-Honolulu合并αCD118攜帶者的表型正常。

本研究發(fā)現(xiàn)位于β鏈的HbG有4種，分別為Hb G-Taipei、Hb G-Coushatta、Hb G-San José和Hb G-Siriraj，均為雜合子，以前兩者為主，各占26.5%和14.7%，發(fā)生率分別為0.012%和0.007%。Hb G-Taibei由Blackwell等[17]于1967年首先在中國臺灣漢族人群中發(fā)現(xiàn)；Hb G-Coushatta由Vella等[18]于1958年首先在美國印第安人群中發(fā)現(xiàn)；兩者廣泛分布于我國南方和北方地區(qū)[4-10]。本研究顯示Hb G-Taipei、Hb G-Coushatta、Hb G-San José和Hb G-Siriraj單純雜合子的臨床表型均正常，前三者HbG的含量均在40%左右，Hb G-Siriraj的含量相對較低，為32.3%，與HbVar記錄及王妍等[8]報道相符合。

本研究還發(fā)現(xiàn)了2例新生兒Hb G-Taipei雜合子，其HbG的含量為(2.3±0.6)%；以及1例新生兒Hb G-Coushatta雜合子，其HbG的含量為4.1%。新生兒地貧篩查是地貧防控的重要環(huán)節(jié)之一，本研究提供的臨床資料對新生兒血紅蛋白疾病的篩查具有參考價值：第一，不同年齡段的血液學(xué)參數(shù)不同，新生兒與成人的血紅蛋白條帶存在明顯差異；第二，臍帶血血紅蛋白電泳分析在新生兒地貧篩查中較傳統(tǒng)的紅細(xì)胞脆性試驗及血細(xì)胞分析篩查效果更佳[19]；第三，本研究顯示新生兒的以上兩種HbG的含量均較低，在(1.8～4.1)%之間，提示臨床應(yīng)注意鑒別新生兒HbG的毛細(xì)管電泳特征，必要時可做DNA測序鑒定其類型，并與其他異常血紅蛋白進(jìn)行區(qū)別。