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    肌肽在體外氧化反應(yīng)中的作用

    2018-07-04 10:19:02章詩琪
    關(guān)鍵詞:魯米諾肌肽中性

    章詩琪, 夏 莉, 章 秋

    肌肽是一種由β-丙氨酸和組氨酸組成的二肽(histidine containing dipeptides, HCD),是一種水溶性的晶體物質(zhì)。肌肽具有抗氧化、抗糖基化、抗炎、抗增殖等多種生物學(xué)作用[1]。在肌肽的眾多保護(hù)性作用中,抗氧化功能是最早被發(fā)現(xiàn),也是最為重要的作用。肌肽的保護(hù)性作用多是基于其抗氧化功能。例如,肌肽因其抗氧化作用而對(duì)糖尿病腎病具有一定的改善作用[2]。然而,有研究者發(fā)現(xiàn)肌肽可以增強(qiáng)鐵和碘引起的魯米諾氧化反應(yīng)[3-4]。這種相悖的結(jié)果很可能是由于衡量氧化反應(yīng)的系統(tǒng)不一致導(dǎo)致的。因此,該研究擬分別以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)或FeCl3為氧化劑,在藍(lán)四氮唑比色法[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]、3,3′-5,5′-四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5’-tetra-methyl-benzidine,TMB)及魯米諾反應(yīng)系統(tǒng)中分別評(píng)估肌肽對(duì)氧化反應(yīng)的作用。

    1 材料與方法

    1.1細(xì)胞、主要試劑與儀器人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical cord cells, HUVEC)購自德國(guó)Promo Cell公司;內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液購自德國(guó)Provitro公司;DMEM/F-12(GlutaMAXGibco?)及小牛血清(fetal calf serum, FCS)購自美國(guó)Gibco公司;豆蔻酸-12佛波醇-13乙酸酯(PMA)、FeCl3、肌肽、魯米諾及p-香豆酸均購自美國(guó)Sigma公司;HRP購自美國(guó)Vector Laboratories公司;TMB購自瑞士Roche公司;過氧化氫購自德國(guó)Merck公司;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Infinite M200)購自瑞士TECAN公司。

    1.2人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)用HUVEC來分析肌肽在MTT實(shí)驗(yàn)中對(duì)細(xì)胞的抗氧化作用。接種HUVEC前1 d,細(xì)胞培養(yǎng)板需要用1%明膠覆蓋過夜,隔日去除明膠,將HUVEC置于含有2% FCS的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液以及5% CO2、37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.3中性粒細(xì)胞的分離與培養(yǎng)本實(shí)驗(yàn)用中性粒細(xì)胞來分析肌肽在化學(xué)發(fā)光法中對(duì)細(xì)胞的促氧化作用。中性粒細(xì)胞從健康志愿者的EDTA全血中分離,志愿者均簽署知情同意書。中性粒細(xì)胞具體分離方法參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]。從全血中提取出的中性粒細(xì)胞由DMEM/F-12稀釋,以每孔105個(gè)細(xì)胞的濃度種植于96孔板。因PMA可以刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species, ROS),故1 μg/ml PMA以及不同濃度的肌肽隨之加入中性粒細(xì)胞中,并在37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育1 h。不同條件下中性粒細(xì)胞產(chǎn)生ROS的量采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)量。

    1.4MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率細(xì)胞在氧化劑FeCl3作用下可能發(fā)生細(xì)胞凋亡[6],而本實(shí)驗(yàn)則利用MTT實(shí)驗(yàn)衡量細(xì)胞在FeCl3和肌肽作用下的存活率。HUVEC在96孔板中連續(xù)培養(yǎng)2 d后,加入培養(yǎng)液(對(duì)照組)或溶有300 μmol/L FeCl3和(或)20 mmol/L肌肽的培養(yǎng)液(實(shí)驗(yàn)組)中孵育。每孔溶液的總量為100 μl。孵育24 h后于每孔中加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml),繼續(xù)在37 ℃孵育4~5 h。當(dāng)孔板中形成不溶的甲臜后,再加入100 μl以10%濃度溶于10 mmol/L鹽酸的十二烷基硫酸鈉。再次將96孔板孵育過夜直至甲臜結(jié)晶完全溶解。MTT實(shí)驗(yàn)詳細(xì)步驟如本項(xiàng)目另一文獻(xiàn)[6]所述。最終用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定細(xì)胞在540 nm波長(zhǎng)處的吸光值。對(duì)照組中HUVEC的細(xì)胞存活率被認(rèn)定為100%,其余實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞存活率根據(jù)相對(duì)吸光值計(jì)算。本實(shí)驗(yàn)中每一個(gè)處理?xiàng)l件均重復(fù)至少6次。

    1.5TMB實(shí)驗(yàn)TMB能夠與HRP發(fā)生反應(yīng)形成深藍(lán)色沉淀,從而檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中的氧化反應(yīng)。首先,將0.1 μg/ml HRP或300 μmol/L FeCl3作為氧化物,分別與水或20 mmol/L肌肽混勻以100 μl總量加入透明的96孔板,再將200 μl TMB加入溶液用以顯色。最終加入50 μl 1 mmol/L的硫酸終止顯色反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)共分為4組:去離子水對(duì)照組、肌肽對(duì)照組、HRP或 FeCl3組、HRP或FeCl3+肌肽組。顯色反應(yīng)激發(fā)的450 nm波長(zhǎng)的吸收光用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量。

    1.6魯米諾反應(yīng)魯米諾能夠與氧化劑反應(yīng)而激發(fā)出藍(lán)光。在細(xì)胞外的魯米諾反應(yīng)中,20 mmol/L肌肽、300 μmol/L FeCl3和0.1 μg/ml HRP以100 μl總量加入白色的96孔板。再加入2.5 mmol/L魯米諾、0.9 mmol/L p-香豆酸以及0.03%過氧化氫,10 min后再用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)量化學(xué)發(fā)光。此實(shí)驗(yàn)共分為4組:去離子水對(duì)照組、肌肽對(duì)照組、HRP或 FeCl3組、HRP或FeCl3+肌肽組。另外,本實(shí)驗(yàn)在魯米諾反應(yīng)中加入抗氧化物質(zhì)N-辛?;喟桶?N-octanoyl dopamine,NOD)、氯化鋅(ZnCl2)或鐵螯合劑去鐵胺(deferoxamine,DFO)進(jìn)一步證明肌肽在魯米諾反應(yīng)中的氧化作用。

    與上述細(xì)胞外的魯米諾反應(yīng)不同,在中性粒細(xì)胞中發(fā)生的魯米諾反應(yīng)則僅用魯米諾及p-香豆酸顯色,而不加入外源性過氧化氫。魯米諾反應(yīng)所需的過氧化氫是由PMA刺激中性粒細(xì)胞去顆粒化產(chǎn)生的。

    2 結(jié)果

    2.1MTT實(shí)驗(yàn)中肌肽對(duì)氧化反應(yīng)的作用MTT實(shí)驗(yàn)假定對(duì)照組中的HUVEC細(xì)胞存活率為100%,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果則顯示僅加入肌肽對(duì)HUVEC細(xì)胞存活沒有影響,但300 μmol/L FeCl3使HUVEC的細(xì)胞存活率顯著下降至(11.06±3.84)%(P<0.05)。而20 mmol/L肌肽能夠阻止FeCl3對(duì)HUVEC的影響,此組細(xì)胞的存活率再次上升至(158.79±3.91)%(P<0.05),見圖1。

    圖1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肌肽及FeCl3對(duì)HUVEC的影響

    1:對(duì)照組;2:20 mmol/L 肌肽;3:300 μmol/L FeCl3;4:20 mmol/L 肌肽+300 μmol/L FeCl3;與300 μmol/L FeCl3組比較:*P<0.05

    2.2TMB實(shí)驗(yàn)中肌肽對(duì)氧化反應(yīng)的作用在細(xì)胞外的TMB實(shí)驗(yàn)中,肌肽本身不能激發(fā)氧化反應(yīng)而產(chǎn)生光密度(P>0.05),見圖2A。氧化劑HRP(圖2A)和FeCl3(圖2B)均能增強(qiáng)光密度(P<0.05),且HRP的氧化能力明顯大于FeCl3(P<0.05)。另外,肌肽并不影響HRP和FeCl3導(dǎo)致的氧化反應(yīng)(P>0.05),見圖2。

    圖2 TMB實(shí)驗(yàn)觀察肌肽對(duì)HRP或FeCl3導(dǎo)致的氧化反應(yīng)的影響

    A:HRP;B:FeCl3;1:對(duì)照組;2: 20 mmol/L 肌肽;3: 0.1 μg/ml HRP;4: 0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L 肌肽;5:300 μmol/L FeCl3;6:300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L 肌肽;與對(duì)照組比較:*P<0.05

    2.3魯米諾實(shí)驗(yàn)中肌肽對(duì)氧化反應(yīng)的作用在細(xì)胞外的魯米諾實(shí)驗(yàn)中,肌肽本身可以不依賴任何氧化劑的催化而顯著增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)(P<0.05),然而,肌肽對(duì)魯米諾實(shí)驗(yàn)的氧化作用要遠(yuǎn)低于HRP的作用(P<0.05),見圖3A。但是如果在肌肽參與的反應(yīng)中加入HRP,化學(xué)發(fā)光的強(qiáng)度會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過單獨(dú)使用肌肽或HRP(P<0.05),見圖3A。本實(shí)驗(yàn)中FeCl3并未能氧化并催化魯米諾反應(yīng),只有加入肌肽才能顯著性提高其化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(P<0.05),見圖3B。

    另外,HRP或FeCl3催化的反應(yīng)中,抗氧化物質(zhì)N-辛酰基多巴胺(N-octanoyl dopamine,NOD)、氯化鋅(ZnCl2)或鐵螯合劑去鐵胺(deferoxamine,DFO)均能減弱肌肽激發(fā)的魯米諾發(fā)光強(qiáng)度(P<0.05),見圖4。

    圖3 肌肽對(duì)HRP或FeCl3催化的魯米諾反應(yīng)的影響

    A:HRP;B:FeCl3;1:對(duì)照組;2: 20 mmol/L 肌肽;3: 0.1 μg/ml HRP;4: 0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L 肌肽;5:300 μmol/L FeCl3;6:300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L 肌肽;與對(duì)照組比較:*P<0.05,**P<0.01;與2組比較:▲P<0.05;與5組比較:#P<0.05

    2.4PMA激活的中性粒細(xì)胞中肌肽對(duì)氧化作用的影響在中性粒細(xì)胞中,濃度小于5 mmol/L的肌肽在30 min內(nèi)不能刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生過氧化氫,從而激發(fā)魯米諾反應(yīng)。由圖5可知,0、1.25、2.5、5 mmol/L肌肽的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度均表現(xiàn)為低平曲線。而濃度大于10 mmol/L的肌肽,自15 min起可明顯增強(qiáng)中性粒細(xì)胞內(nèi)的魯米諾反應(yīng),化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)大于2倍,而且這種增強(qiáng)與肌肽的劑量相關(guān)。

    3 討論

    雖然大多數(shù)研究表明肌肽是一種抗氧化物質(zhì),但仍有少部分研究質(zhì)疑此結(jié)論。尤其是在體外實(shí)驗(yàn)當(dāng)中,多個(gè)研究[3,7]顯示肌肽有促氧化作用。而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,肌肽則一直表現(xiàn)出抗氧化的特性[2]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肌肽在MTT實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出抗氧化特性,在TMB實(shí)驗(yàn)為中性物質(zhì),而在魯米諾反應(yīng)系統(tǒng)中則表現(xiàn)出促氧化的性質(zhì)。因此,肌肽的抗氧化性質(zhì)很可能在不同的反應(yīng)系統(tǒng)中存在差異。

    圖4 NOD、ZnCl2和DFO對(duì)肌肽激發(fā)的、HRP和

    A:HRP;B:FeCl3;1:0.1 μg/ml HRP;2:0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L 肌肽;3:0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L肌肽+100 μmol/L NOD;4:0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L肌肽+10 mmol/L ZnCl2;5:0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L肌肽+1.6 mmol/L DFO;6: 300 μmol/L FeCl3;7:300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L肌肽;8:300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L肌肽+100 μmol/L NOD;9:300 μmol/L FeCl3+ 20 mmol/L肌肽+10 mmol/L ZnCl2;10:300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L肌肽+1.6 mmol/L DFO;與0.1 μg/ml HRP+20 mmol/L 肌肽組比較:*P<0.05;與300 μmol/L FeCl3+20 mmol/L肌肽組比較:▲P<0.05

    圖5 肌肽對(duì)PMA激發(fā)的中性粒細(xì)胞中氧化反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響

    本研究顯示肌肽能夠拮抗FeCl3對(duì)HUVEC的氧化毒性,與相關(guān)文獻(xiàn)[6]相似。一方面可能由于鐵離子可以和肌肽形成螯合物,使其不能進(jìn)入細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用;另一方面肌肽能夠下調(diào)HUVEC中鐵離子的轉(zhuǎn)運(yùn)載體(二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體),使鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)入細(xì)胞的量減少[6]。 另外,Reddy et al[8]發(fā)現(xiàn)肌肽的咪唑環(huán)可以和ROS或羥自由基中激活的電子形成共價(jià)鍵,形成穩(wěn)定的中間產(chǎn)物,從而達(dá)到拮抗后兩者氧化的作用。

    Achyuthan et al[3]研究顯示肌肽的抗氧化或促氧化作用事實(shí)上取決于肌肽的生產(chǎn)商。商業(yè)制劑中污染物肼的濃度決定了肌肽的性質(zhì)[14]。本實(shí)驗(yàn)使用的肌肽由Sigma公司生產(chǎn)。與Fluka或Research Organics公司生產(chǎn)的肌肽相比,Sigma公司生產(chǎn)的肌肽抗氧化活性最低。Achyuthan et al[3]研究還表明肌肽的作用受氧化劑的影響。如果化學(xué)發(fā)光反應(yīng)的氧化劑由較高濃度的H2O2和較低濃度的鐵組成,肌肽表現(xiàn)為抗氧化作用;如果氧化劑由較高濃度的鐵組成,肌肽則表現(xiàn)為促氧化作用。本實(shí)驗(yàn)的魯米諾反應(yīng)使用的鐵的濃度為肌肽濃度的3倍以上,這可能也是其表現(xiàn)為促氧化作用的原因。

    本研究結(jié)果顯示肌肽甚至可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞的氧化反應(yīng)。然而,Sharonov et al[15]使用了與本研究相同的實(shí)驗(yàn)條件,卻得出完全相反的結(jié)論:肌肽可以抑制由PMA激發(fā)的中性粒細(xì)胞的氧化反應(yīng)。但此二者結(jié)論矛盾的具體原因仍不明,有待于進(jìn)一步研究。

    盡管有不同的研究反復(fù)論證肌肽的抗氧化或促氧化性質(zhì),但到目前為止,還沒有研究表明肌肽是中性物質(zhì),亦沒有研究使用TMB系統(tǒng)測(cè)定肌肽的氧化作用。本實(shí)驗(yàn)中肌肽在TMB系統(tǒng)中既無抗氧化,也無促氧化作用。這可能是由于肌肽的作用被實(shí)驗(yàn)中的終止液H2SO4中和。TMB實(shí)驗(yàn)中H2SO4(1 mmol/L)的濃度高于p-香豆酸(0.9 mmol/L),而在這種情況下,肌肽不能形成肌肽-自由基加合物而促進(jìn)化學(xué)發(fā)光。迄今,F(xiàn)enton反應(yīng)不能在TMB系統(tǒng)中被激活的原因仍未知,有待于進(jìn)一步研究。

    事實(shí)上,肌肽被普遍定義為抗氧化劑,但它偶爾表現(xiàn)的促氧化作用一方面可能與溶劑的pH值有關(guān),另一方面與其作用的底物有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)為肌肽在未來的臨床應(yīng)用中提出相關(guān)注意事項(xiàng)及用藥禁忌。

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