火力楠花粉活力測(cè)定、貯藏條件及培養(yǎng)基篩選

粟莉圓 盧晨升 蘇懂朝 陳瑩瑩 梁機(jī)

摘 要：本試驗(yàn)以火力楠種子園內(nèi)5個(gè)無(wú)性系花粉為材料，測(cè)定了不同無(wú)性系間的花粉生活力，研究了花粉貯藏的適宜溫度及花粉離體萌發(fā)的最佳培養(yǎng)基。結(jié)果表明，（1）各無(wú)性系間花粉活力存在差異，無(wú)性系序號(hào)排序由大到小為42>14>51>48>7;（2）各無(wú)性系花粉在不同貯藏溫度下活力隨時(shí)間的增長(zhǎng)呈逐漸下降趨勢(shì)，常溫條件下火力楠花粉活力下降較快，而-20℃貯藏條件下活力保存最好，在-20℃貯藏14 d后42號(hào)無(wú)性系花粉活力仍可達(dá)到39.28 %;（3）火力楠5個(gè)無(wú)性系花粉的最佳培養(yǎng)基配方為100 g/L蔗糖+50 mg/L硼酸+1 %瓊脂粉。

關(guān)鍵詞：火力楠 花粉活力 花粉貯藏 培養(yǎng)基

中圖分類(lèi)號(hào)：S722.8+3? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：Pollens from five different clones in Michelia macclurei clonal seed orchard were used as materials to measure pollen viability and study the suitable storage temperature and the best medium for pollen germination in vitro. Results showed that，（1） Pollen viability was different among clones，ranking as follows： 42>14>51>48>7. （2） Pollen viability decreased gradually over time at different storage temperatures，declined rapidly at room temperature，and kept best at -20℃.The pollen viability of No.42 clone was up to 39.28% at -20℃for 14 days. （3） The best medium for five M. macclurei clones pollen was sucrose 100 g/L + boric acid 50 mg/L + agar 1%.

Key words：Michelia macclurei; pollen viability，pollen storage，medium

火力楠（Michelia macclurei），木蘭科含笑屬常綠喬木，又稱(chēng)醉香含笑，是我國(guó)南方重要的鄉(xiāng)土闊葉用材樹(shù)種，適應(yīng)性強(qiáng)[1]，生長(zhǎng)迅速，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，花與果實(shí)可榨油;成林具有一定的抗火能力，可營(yíng)造防火林，已被國(guó)家林業(yè)局列入國(guó)家儲(chǔ)備林樹(shù)種目錄?；鹆﹂ǚ塾尚廴镏械幕ㄋ幃a(chǎn)生，到達(dá)雌蕊使胚珠授粉?；ǚ墼谟谢盍l件下到達(dá)可授性的柱頭，才能保證受精過(guò)程的順利進(jìn)行[2]。學(xué)者們對(duì)不同樹(shù)種花粉活力與壽命的研究已經(jīng)開(kāi)展了大量的工作。關(guān)于花粉活力，張傳杰等[3]研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度和暴露時(shí)間的增加，茶花的花粉萌發(fā)率降低;在20 ～ 40℃貯藏3 d后，幾乎無(wú)花粉萌發(fā);劉曉玲等[4]曾研究了校園內(nèi)醉香含笑的花粉活力，發(fā)現(xiàn)在開(kāi)花中期的花粉活力最高。此外，貯藏條件對(duì)花粉活力與壽命的影響和花粉培養(yǎng)基方面也有較多研究。潘磊等[5]發(fā)現(xiàn)煙草花粉活力在-196℃和-80℃保存16個(gè)月后未出現(xiàn)明顯下降，而4℃貯藏的花粉在保存5個(gè)月后即喪失活力。付強(qiáng)等[6]采用離體萌發(fā)法測(cè)定思茅松花粉活力時(shí)，發(fā)現(xiàn)H3BO3溶液較CaCl2溶液更適于作為萌發(fā)培養(yǎng)基。種子園是由選擇的優(yōu)良無(wú)性系或家系組成的人工林，能生產(chǎn)遺傳品質(zhì)和播種品質(zhì)兼優(yōu)的林木種子，作為林業(yè)生產(chǎn)上的重要良種基地。有關(guān)火力楠種子園不同無(wú)性系花粉活力的比較研究還尚未見(jiàn)報(bào)道，本試驗(yàn)可為種子園內(nèi)火力楠交配設(shè)計(jì)及良種生產(chǎn)提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

玉林市林科所火力楠種子園位于東經(jīng)110°34′，北緯22°48′，海拔140 m，屬于亞熱帶季風(fēng)氣候。收集了來(lái)自廣西和廣東地區(qū)多個(gè)火力楠優(yōu)良無(wú)性系按照完全隨機(jī)方式進(jìn)行配置，于1978年嫁接，占地面積2.8 hm2，處于種子盛產(chǎn)期。平均氣溫約21.5℃，最高氣溫39.4℃，最低氣溫3℃，年降雨量1665.1 mm，無(wú)霜期為355 d。土壤為赤紅壤，pH值4.6，土層厚度0.8 ～1 m。

1.2 TTC法檢測(cè)花粉活力

采集適量盛花期的7、14、42、48、51號(hào)無(wú)性系花粉，取部分測(cè)量新鮮花粉活力;其余花粉干燥后放入小型離心管內(nèi)置于常溫、4℃、-20℃下保存。采用TTC染色法[7]分別檢測(cè)新鮮花粉活力及各樣品保存1 d、7 d、14 d后的花粉活力。在顯微鏡下觀(guān)察花粉被染成紅色則表示有生活力。每個(gè)樣品隨機(jī)選擇3個(gè)視野，以染色率統(tǒng)計(jì)花粉活力。

1.3 最適花粉培養(yǎng)基探索

影響花粉萌發(fā)活性的主要因素是蔗糖、硼酸的濃度，因此設(shè)置含100 g/L蔗糖及0、15、25、50、100 mg/L硼酸的5種花粉培養(yǎng)基，詳見(jiàn)表1。將花粉均勻撒播在培養(yǎng)基上，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中4 h。在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察花粉萌發(fā)情況，每個(gè)培養(yǎng)基處理上選取3個(gè)花粉分布均勻且數(shù)量在50粒以上的視野進(jìn)行觀(guān)察。統(tǒng)計(jì)花粉管伸長(zhǎng)為花粉粒直徑長(zhǎng)度2倍及以上的花粉個(gè)數(shù)，并計(jì)算萌發(fā)率。

萌發(fā)率（%）=花粉管伸長(zhǎng)為花粉粒直徑長(zhǎng)度2倍及以上的花粉個(gè)數(shù)/花粉總數(shù)量×100。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法和數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel進(jìn)行匯總和處理，SPSS軟件進(jìn)行顯著性比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 火力楠不同無(wú)性系花粉活力的比較

由圖1可以看出，各無(wú)性系間新鮮花粉活力存在顯著差異（P<0.05），42號(hào)花粉活力最高，為61.31%，14號(hào)花粉活力次之（56.64 %），7號(hào)花粉活力最低為37.93%。各無(wú)性系花粉活力由大到小為42>14>51>48>7，說(shuō)明人工控制授粉時(shí)用42號(hào)無(wú)性系做父本有利于提高授粉成功率。

2.2 貯藏溫度對(duì)火力楠不同無(wú)性系花粉活力的影響

火力楠各無(wú)性系花粉在不同貯藏溫度下花粉活力隨時(shí)間的增加呈逐漸下降趨勢(shì)（圖2），且存在差異（表2，P<0.05）。在常溫條件下貯藏1 d后，花粉活力為27.13 %～48.15 %;貯藏14 d后，各無(wú)性系花粉活力下降至3.46 %～11.72 %;而在-20℃下儲(chǔ)存14 d后，花粉活力仍保持在23.34 %～39.28 %?？梢?jiàn)-20℃溫度條件更適宜存放火力楠無(wú)性系花粉。

常溫下，花粉活力下降較快，7號(hào)無(wú)性系花粉常溫儲(chǔ)存14 d后活力僅為3.46%。-20℃貯藏條件下花粉活力保持較好，42號(hào)無(wú)性系花粉在-20℃下儲(chǔ)藏1 d后活力為57.29%，14 d后活力仍可達(dá)到39.28%;14號(hào)次之，其在-20℃下儲(chǔ)藏1 d和14 d后花粉活力分別為54.46%、36.28%。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)火力楠無(wú)性系花粉萌發(fā)的影響

由表3、4可得，火力楠不同無(wú)性系花粉在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)率有差異（P<0.01）。除7號(hào)無(wú)性系外，各無(wú)性系花粉在4號(hào)培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，14、42、48、51號(hào)無(wú)性系花粉萌發(fā)率分別46.53 %、51.15 %、43.14 %、36.25 %。7號(hào)無(wú)性系花粉在3號(hào)培養(yǎng)基上萌發(fā)率最高，為28.22 %，但其在4號(hào)培養(yǎng)基上的萌發(fā)率（22.81 %）僅次于3號(hào)，因此選用4號(hào)培養(yǎng)基的配方更有利于大部分無(wú)性系花粉萌發(fā)，即蔗糖100? g/L、硼酸50 mg/L、瓊脂10 g/L。

3 結(jié)論與討論

花粉活力的研究為雜交育種過(guò)程中選配優(yōu)良授粉品種提供重要依據(jù)，其中花粉活力的高低是授粉成功率大小的重要保證[8]。種子園是集約經(jīng)營(yíng)管理和為生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)種子的單位，選用花粉活力高的無(wú)性系作為父本可有效提高種子產(chǎn)量與質(zhì)量，并為種子園配置及更新提供理論依據(jù)。本研究發(fā)現(xiàn)42號(hào)花粉活力最高，其次為14號(hào)，在將來(lái)的雜交育種中優(yōu)先選用42號(hào)無(wú)性系作為父本，而7號(hào)無(wú)性系花粉則不建議作為父本進(jìn)行應(yīng)用。

溫度對(duì)花粉生活力有影響，不同溫度作用下可促進(jìn)花粉萌發(fā)或延長(zhǎng)花粉儲(chǔ)存時(shí)間。前人對(duì)花粉儲(chǔ)藏溫度的研究結(jié)果大致相同，發(fā)現(xiàn)花粉貯藏在4℃、-20℃甚至-80℃、-196℃均可延長(zhǎng)花粉壽命，而在常溫儲(chǔ)存下花粉活力喪失快[8-10]。如木槿在4℃條件下有利于延長(zhǎng)花粉的貯藏時(shí)間[11];黃瓊等[9]研究發(fā)現(xiàn)薄殼山核桃在-80℃下能儲(chǔ)存200 d左右，而在常溫下30 d后就完全失去活力;天女木蘭25℃花粉的活力降低最快，5 d后花粉萌發(fā)率接近于0℃，4℃冰箱儲(chǔ)存的花粉約8.5 d失去萌發(fā)能力，而-10℃冰箱儲(chǔ)存的花粉活力能夠保持10.5 d [10]。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知火力楠各無(wú)性系花粉保存在-20℃溫度條件下可適當(dāng)延長(zhǎng)花粉生活力。

硼酸可增加植物糖的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，促進(jìn)花粉壁果膠物的合成，與蔗糖結(jié)合可提高花粉萌發(fā)率[8]。一般情況下花粉中的硼酸含量是不足的，因此在離體培養(yǎng)中均需要添加一定量的硼酸[12]。史春風(fēng)和葉利民均研究過(guò)含笑花粉離體萌發(fā)條件，在培養(yǎng)基中添加50? mg/L硼酸可促進(jìn)含笑花粉萌發(fā)[13-14]，所不同的是所添加的蔗糖含量有差異。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在固定蔗糖濃度為100 g/L條件下，添加50 mg/L硼酸更適合火力楠無(wú)性系花粉的萌發(fā)。

本實(shí)驗(yàn)采用TTC染色法與培養(yǎng)基法對(duì)火力楠花粉進(jìn)行檢測(cè)得到的花粉活力范圍分別為37.92 %～61.31 %和28.22 %～51.15 %，這兩種花粉活力測(cè)定方法雖然精度存在差異，但活力測(cè)定結(jié)果趨勢(shì)是一致的;染色法雖快捷，可結(jié)果比較間接[15]，相比之下花粉培養(yǎng)基萌發(fā)法測(cè)定結(jié)果更接近自然狀態(tài)下的花粉真實(shí)活力，數(shù)據(jù)更可靠。

綜上，本實(shí)驗(yàn)研究了火力楠種子園5個(gè)無(wú)性系的花粉活力差異、在三種貯藏溫度下的活力對(duì)比以及在不同培養(yǎng)基上的萌發(fā)表現(xiàn)，可為指導(dǎo)火力楠種子園的營(yíng)建、花粉管理及無(wú)性系配置提供科學(xué)依據(jù)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步的研究方向?yàn)椴煌瑹o(wú)性系間雜交組合的親合度及對(duì)座果率、種子質(zhì)量的影響。

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