• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    銅脅迫對(duì)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物的影響①

    2020-04-12 12:11:04王宵宵鐘文輝
    土壤 2020年1期
    關(guān)鍵詞:水稻影響研究

    王宵宵,鐘文輝,李 磊,洪 鑫,劉 標(biāo),韓 成*

    銅脅迫對(duì)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物的影響①

    王宵宵1,2,鐘文輝1,李 磊1,2,洪 鑫1,2,劉 標(biāo)3,韓 成1*

    (1 南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院,江蘇省物質(zhì)循環(huán)與污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210023;2 南京師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院,南京 210023;3 生態(tài)環(huán)境部南京環(huán)境科學(xué)研究所,國(guó)家環(huán)境保護(hù)生物安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,南京 210042)

    根際土壤微生物群落是聯(lián)系土壤環(huán)境與作物生長(zhǎng)的重要紐帶,也是轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評(píng)價(jià)的主要指標(biāo),而Cu脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物的影響目前尚不清楚。本研究基于盆栽試驗(yàn),采用高通量測(cè)序等技術(shù)研究Cu脅迫(Cu含量100 mg/kg)對(duì)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(hào)(HH)及其親本非轉(zhuǎn)基因水稻明恢63(MH)農(nóng)藝性狀及成熟期根際土壤微生物的影響,并以不施加Cu脅迫處理為對(duì)照。結(jié)果顯示:Cu脅迫顯著降低了水稻株高、生物量及產(chǎn)量;Cu脅迫改變了水稻根際土壤總氮、銨態(tài)氮含量及氧化還原電位值,而種植轉(zhuǎn)基因水稻僅降低了根際土壤氧化還原電位值;Cu脅迫沒(méi)有影響水稻根際土壤細(xì)菌豐度,但降低了細(xì)菌群落Alpha-多樣性,改變了水稻根際土壤細(xì)菌群落組成和群落結(jié)構(gòu);相同Cu含量脅迫下,HH和MH水稻生長(zhǎng)指標(biāo)及根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成差異較小。上述研究表明,Cu脅迫抑制了水稻農(nóng)藝性狀及根際土壤細(xì)菌群落,但種植抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻沒(méi)有影響水稻植株及根際土壤細(xì)菌群落對(duì)Cu脅迫的抗性。

    銅脅迫;細(xì)菌群落;轉(zhuǎn)基因水稻;根際土壤;環(huán)境安全評(píng)價(jià)

    近年來(lái),含Cu礦產(chǎn)的開(kāi)采、冶煉廠三廢的排放,含Cu殺菌劑的長(zhǎng)期大量使用和城市污泥的堆肥利用,使土壤含Cu量達(dá)到原始土壤的幾倍甚至幾十倍[1]。我國(guó)農(nóng)田土壤Cu污染現(xiàn)象日益嚴(yán)重,已威脅到環(huán)境生態(tài)的穩(wěn)定及人類的安全,甚至對(duì)植物、動(dòng)物及土壤微生物產(chǎn)生危害,引起了國(guó)內(nèi)外很多科研人員的關(guān)注。Cu是水稻生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素。但當(dāng)土壤中Cu含量超過(guò)一定量時(shí),將對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量產(chǎn)生影響[2]。趙江寧等[3]的研究表明,水稻成熟期土壤可交換態(tài)Cu含量與Cu脅迫下水稻抽穗和成熟期推遲的天數(shù)以及莖蘗發(fā)生、單位面積穗數(shù)、每穗穎花數(shù)和產(chǎn)量的下降幅度均呈顯著或極顯著正相關(guān)。因此,提高水稻的耐Cu性是應(yīng)對(duì)農(nóng)田土壤Cu污染的重要育種方向。土壤微生物活性和群落結(jié)構(gòu)的變化能敏感地反映土壤質(zhì)量和健康狀況,是土壤環(huán)境質(zhì)量評(píng)價(jià)不可缺少的重要生物學(xué)指標(biāo)[4]。當(dāng)Cu含量超過(guò)一定量時(shí),微生物的生長(zhǎng)代謝將會(huì)受到抑制,土壤微生物數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。Wang等[5]利用DGGE圖譜分析發(fā)現(xiàn),土壤中重金屬Cu不同提取態(tài)的含量與微生物多樣性Shannon指數(shù)呈負(fù)相關(guān),且由于生物可利用的重金屬含量超過(guò)土壤微生物的忍耐極限而導(dǎo)致微生物基因突變及種群更新。Liu等[6]采用PLFAs分析發(fā)現(xiàn),高含量的Cu脅迫下,土壤總細(xì)菌數(shù)量、微生物生物量碳及酶活性顯著降低。Cu脅迫下,李月靈等[7]發(fā)現(xiàn)接種土壤微生物可以減輕Cu脅迫對(duì)植株造成的傷害,提高植株耐受Cu脅迫的能力。目前應(yīng)用較多的分子生物學(xué)技術(shù)為PCR-DGGE技術(shù)、RFLP分析及定量PCR分析等[8],這些手段往往通量低、信息量小,本研究采用Illumina Hiseq測(cè)序技術(shù),可以更加全面準(zhǔn)確地分析Cu脅迫下水稻根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

    在環(huán)境惡化及水稻可種植面積縮小等農(nóng)業(yè)問(wèn)題的挑戰(zhàn)下,轉(zhuǎn)基因技術(shù)成為增產(chǎn)增收的重要手段和途徑[9]。轉(zhuǎn)基因水稻具有較強(qiáng)的抗逆性,崔榮榮等[10]研究發(fā)現(xiàn),無(wú)論在適宜季節(jié)或非適宜季節(jié),轉(zhuǎn)基因水稻的生存競(jìng)爭(zhēng)能力和繁育能力高于親本。轉(zhuǎn)基因技術(shù)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)利益的同時(shí),其環(huán)境安全評(píng)價(jià)備受關(guān)注。土壤生態(tài)研究是轉(zhuǎn)基因作物環(huán)境安全評(píng)價(jià)中的重要內(nèi)容,目前證明轉(zhuǎn)基因作物對(duì)生物多樣性的潛在影響與非轉(zhuǎn)基因作物存在本質(zhì)不同的科學(xué)依據(jù)較少[11]。吳立成等[12]研究表明抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)根際土壤微生物的影響較小,且不持續(xù)。相比于外源基因的插入,生長(zhǎng)環(huán)境的變化更易引起轉(zhuǎn)基因水稻性狀的改變[13]。然而,Cu脅迫是否會(huì)影響抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物群落尚不清楚。根據(jù)我國(guó)土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(GB15618—2008),一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)農(nóng)田土壤的Cu含量標(biāo)準(zhǔn)分別為35、100、400 mg/kg,且目前Cu污染稻田土壤Cu含量可高達(dá)101.2 mg/kg[14]。由此,本研究以抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(hào)及其親本水稻明恢63為研究材料,施加Cu含量100 mg/kg的Cu脅迫,測(cè)定不同處理下水稻的農(nóng)藝性狀,并采用定量PCR和Illumina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)水稻根際土壤細(xì)菌群落豐度和結(jié)構(gòu)變化情況進(jìn)行探究,以明確Cu脅迫對(duì)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻農(nóng)藝性狀及根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 供試土壤及水稻種子

    供試土壤為南京師范大學(xué)仙林校區(qū)(118°55′E,32°06′N)內(nèi)未經(jīng)人為干擾的自然土壤,去除表面植被、落葉及顆粒物后,采集0 ~ 15 cm深度土壤,室內(nèi)自然風(fēng)干后研磨過(guò)篩(2 mm),混勻后備用。土壤基本理化性質(zhì)為:pH 7.77,全氮 0.41 g/kg,總有機(jī)碳 2.7 g/kg,有機(jī)質(zhì) 4.65 g/kg,有效磷 3.53 mg/kg,銨態(tài)氮 0.28 mg/kg。該土壤未檢測(cè)到Cu等重金屬污染。供試水稻品種為明恢63(簡(jiǎn)稱MH)和華恢1號(hào)(簡(jiǎn)稱HH),其中明恢63為非轉(zhuǎn)基因水稻,華恢1號(hào)是將抗蟲基因/轉(zhuǎn)入明恢63中獲得的轉(zhuǎn)基因水稻。水稻種子由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院提供。

    1.2 試驗(yàn)設(shè)置及樣品采集

    本試驗(yàn)選用15 cm × 25 cm PVC塑料桶作為水稻盆栽用桶,每桶稱取相當(dāng)于5.0 kg干土重的風(fēng)干土壤,添加自來(lái)水使得盆栽桶中淹水4 ~ 5 cm,并添加不同量Cu對(duì)土壤進(jìn)行為期30 d的預(yù)處理。盆栽桶口覆膜以減少水分揮發(fā),膜上有孔以維持通氣狀態(tài)。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)Cu含量脅迫處理,為Cu0和Cu100處理,Cu(II)添加形態(tài)為CuCl2·3H2O,添加量分別為0、100 mg/kg(以Cu(II)含量計(jì)),每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)。

    重金屬預(yù)處理后,每桶施入N︰P︰K為1︰1︰1的復(fù)合肥作基肥,添加量為0.5 g/kg。將培養(yǎng)30 d后的HH和MH水稻幼苗分別移栽至桶中,每桶3株。水稻生長(zhǎng)期間桶內(nèi)保持4 ~ 5 cm淹水層,于移栽后12 d追施氮肥(尿素,0.05 g/kg),于移栽后30 ~ 37 d(水稻分蘗后期)進(jìn)行曬田,其他管理措施與田間相同。

    于移栽后112 d(水稻成熟期)對(duì)水稻植株進(jìn)行破壞性采樣,并測(cè)定株高、生物量、籽粒重金屬含量等水稻農(nóng)藝性狀。水稻成熟期破壞性采樣后,根據(jù)土壤在水稻根系表面抖落和粘著的程度區(qū)分根際土壤及非根際土壤[15]。采集時(shí)仔細(xì)地從土壤中移出水稻根系,劇烈、快速抖動(dòng)根系以將非根際土壤抖落,直至無(wú)法抖落土壤且可看清水稻根系;用無(wú)菌刮板輕輕刮取粘著在根系上的土壤(< 2 mm),盡可能剔除植物殘留碎片及根系后混勻作為一個(gè)根際土壤樣品。一部分根際土立即裝入2 ml的離心管中于–80 ℃保存,用于微生物分子生態(tài)學(xué)分析;一部分根際土用于土壤理化性質(zhì)分析。

    1.3 土壤理化指標(biāo)的測(cè)定

    土壤無(wú)機(jī)氮采用2 mol/L KCl溶液按5︰1(/)的水土比浸提,在20 ℃、200 r/min條件下振蕩1 h過(guò)濾,濾液用流動(dòng)分析儀(Skalar San Plus, Netherlands)測(cè)定;土壤pH用蒸餾水按2.5︰1(/)的水土比浸提,振蕩10 min,靜置30 min,采用臺(tái)式pH計(jì)(Mettler- Toledo)測(cè)定;土壤有效磷采用鹽酸-氟化銨按10︰1(/)的土水比浸提,鉬銻抗比色法測(cè)定;土壤全氮采用凱氏消煮法測(cè)定;土壤總有機(jī)碳采用TOC分析儀(島津TOC-L)測(cè)定。成熟期破壞性采樣前,采用微電極分析儀(Unisense Microsensor Multimeter Version 2.01)測(cè)定水稻盆栽水–土界面下3.8 cm處水稻根際土壤氧化還原電位值,測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[16]。

    1.4 土壤及植物各器官Cu含量的測(cè)定

    土壤樣品采用0.1 mol/L鹽酸溶液按5︰1(/)的水土比浸提,在25 ℃、250 r/min條件下振蕩1 h過(guò)濾,濾液由ICP-AES測(cè)定;植物樣品采用濃硝酸-高氯酸消煮,ICP-AES測(cè)定,測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[17]。

    1.5 土壤總DNA提取

    本研究采用試劑盒(FastDNA? Spin Kit for Soil, MP, Biomedicals, USA)提取土壤總DNA,按試劑盒的說(shuō)明,每個(gè)土壤樣品稱取鮮土0.5 g。DNA溶液的質(zhì)量和濃度采用NanoDrop 2000(Thermo, USA)進(jìn)行測(cè)定,提取好的DNA樣品稀釋10倍后保存于–20 ℃。

    1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

    采用基于SYBR green染料法的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定土壤細(xì)菌16S rRNA基因豐度來(lái)表征細(xì)菌群落豐度。測(cè)定機(jī)器為Biorad CFX96 Real-time PCR system(Biorad, USA),SYBR green試劑選用2 × SYBR Premix Ex Taq(Takara, Japan),采用通用引物515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)/907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)從土壤微生物DNA中擴(kuò)增16S rRNA基因。qPCR反應(yīng)體系為20.0 μl,包括10.0 μl的2 × SYBR Premix Ex Taq、上下游引物(20 pmol/μl)各0.3、1.0 μl樣品DNA模版(9.3 ~ 23.9 ng/μl)及8.4 μl滅菌超純水。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性,5 min;40個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s;52 ℃退火30 s;72 ℃延伸30 s),每循環(huán)結(jié)束后采集熒光數(shù)據(jù);40輪擴(kuò)增后,采用溶解曲線分析擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性,分析程序?yàn)椋簻囟葟?5 ℃上升到95 ℃,此期間每上升0.5 ℃便采集熒光數(shù)據(jù)。以含有細(xì)菌16S rRNA基因的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)DNA模版,根據(jù)質(zhì)粒濃度和阿伏伽德羅常數(shù)計(jì)算該基因的拷貝數(shù),分別以10倍梯度稀釋各模板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,其濃度范圍為9.61×102~ 9.61×108copies/μl。每個(gè)樣品3個(gè)技術(shù)重復(fù),擴(kuò)增效率為99.6%(2為0.992),同時(shí)設(shè)置3個(gè)無(wú)模板樣品為陰性對(duì)照。

    1.7 高通量測(cè)序分析

    以提取的基因組DNA為模板,采用V4 ~ V5區(qū)引物(515F/907R)擴(kuò)增16S rRNA基因以鑒定細(xì)菌群落組成及多樣性,高通量測(cè)序分析委托廣東美格基因科技有限公司采用Illumina Hiseq 2500平臺(tái)進(jìn)行分析。利用Trimmomatic軟件對(duì)Raw Reads數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾,得到質(zhì)控后的pair-end clean reads,采用FLASH拼接Hiseq測(cè)序產(chǎn)生的pair-end數(shù)據(jù),最小overlap長(zhǎng)度設(shè)置為10 bp,拼接序列最大錯(cuò)配比率為0.1,過(guò)濾后得到有效的拼接片段Clean Tags[18]。利用usearch軟件(http://www.drive5.com/usearch/)對(duì)所有Clean Tags進(jìn)行聚類,默認(rèn)以97% 的一致性將序列聚類成為OTU,在門(Phylum)水平上將相對(duì)豐度小于1% 細(xì)菌類群和無(wú)法分類的細(xì)菌類群合并在Others。進(jìn)行Alpha-多樣性、Beta多樣性分析,其中Chao1指數(shù)反映樣品中群落的豐富度,Shannon指數(shù)綜合考慮群落中物種的豐富度和均勻度。

    1.8 數(shù)據(jù)處理

    本研究采用SPSS 16.0(IBM, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析比較同一水稻品種各處理間的顯著性差異;采用雙因素方差分析比較不同處理及不同品種水稻農(nóng)藝性狀、根際土壤理化性質(zhì)、根際土壤細(xì)菌微生物群落組成及結(jié)構(gòu)的差異;采用Bray-Curtis距離及多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法主坐標(biāo)分析(PCoA,Principal coordinates Analysis)比較不同樣品間細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 Cu脅迫對(duì)水稻根際土壤理化性質(zhì)及水稻農(nóng)藝性狀的影響

    Cu脅迫處理下水稻根際土壤理化性質(zhì)發(fā)生明顯改變(表1)。與Cu0處理相比,Cu100處理下水稻根際土壤全氮、銨態(tài)氮含量顯著降低,水稻根際土壤有效Cu含量顯著升高,MH水稻根際土壤氧化還原電位值顯著上升;但水稻根際土壤pH、總有機(jī)碳含量無(wú)顯著性差異。相同Cu脅迫處理下,HH及MH水稻根際土壤pH、全氮、總有機(jī)碳、銨態(tài)氮及有效Cu含量均無(wú)顯著性差異,但HH水稻根際土壤氧化還原電位顯著低于MH水稻。雙因素方差分析顯示,水稻根際土壤全氮、銨態(tài)氮含量?jī)H受Cu脅迫顯著影響,根際土壤氧化還原電位值受水稻品種與Cu脅迫的交互影響顯著。可見(jiàn),Cu脅迫改變了水稻根際土壤全氮、銨態(tài)氮含量及氧化還原電位值,而種植轉(zhuǎn)基因水稻僅降低了根際土壤氧化還原電位值。

    表1 不同處理水稻根際土壤理化性質(zhì)

    注:表中數(shù)據(jù)均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(= 4);同列不同小寫、大寫字母分別表示HH水稻和MH水稻各指標(biāo)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)結(jié)果顯著(< 0.05);ND表示未檢測(cè)到Cu(II);*和**分別代表在< 0.05和< 0.01水平影響顯著。

    各處理水稻農(nóng)藝性狀顯著不同(圖1)。與Cu0處理相比,Cu100處理水稻株高、產(chǎn)量、生物量均顯著性降低。在Cu0處理下,移栽7周后HH水稻株高均顯著高于MH水稻,但HH與MH水稻成熟期生物量及產(chǎn)量無(wú)顯著差異;而Cu100處理下,HH與MH水稻株高、生物量及產(chǎn)量均無(wú)顯著差異。Cu脅迫下,兩種水稻各器官重金屬含量分布規(guī)律均為:根>莖>葉>籽粒(未檢測(cè)到),無(wú)Cu脅迫處理水稻各器官中未檢測(cè)到Cu。HH水稻根部Cu含量顯著低于MH水稻,而葉中Cu含量顯著高于MH水稻。可見(jiàn),Cu脅迫顯著降低了水稻株高、生物量及產(chǎn)量,品種對(duì)水稻生長(zhǎng)影響較??;HH和MH水稻對(duì)Cu的吸收富集程度不同。

    (圖中誤差線用標(biāo)準(zhǔn)誤表示,n = 4;圖1D中同一簇不同字母表示Cu脅迫下兩種水稻同一器官內(nèi)Cu含量具有顯著性差異,P < 0.05)

    2.2 Cu脅迫對(duì)水稻根際土壤細(xì)菌群落豐度及Alpha-多樣性的影響

    土壤16S rRNA基因數(shù)量可反映土壤中細(xì)菌群落豐度。HH-Cu0、MH-Cu0、HH-Cu100和MH-Cu100處理下水稻根際土壤細(xì)菌16S rRNA基因豐度分別為2.05 × 1010、1.80 × 1010、1.65 × 1010和1.95 × 1010拷貝數(shù)/g。不同含量Cu脅迫處理下,水稻根際土壤細(xì)菌群落豐度無(wú)顯著差異;同一處理下,HH與MH水稻根際土壤細(xì)菌群落豐度也無(wú)顯著差異??梢?jiàn),Cu脅迫及水稻品種對(duì)水稻根際土壤細(xì)菌群落豐度無(wú)顯著影響。

    細(xì)菌群落OTU數(shù)量的稀釋曲線能夠反映細(xì)菌群落的多樣性。Cu100處理下水稻Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)顯著低于Cu0處理,同一處理下,兩種水稻Chao1指數(shù)及Shannon指數(shù)無(wú)顯著性差異(圖2)。說(shuō)明無(wú)Cu脅迫水稻根際土壤細(xì)菌群落多樣性、豐富度及均勻度顯著高于Cu脅迫處理水稻。雙因素方差分析顯示,水稻根際土壤細(xì)菌群落多樣性僅受Cu處理的顯著影響??梢?jiàn),Cu脅迫沒(méi)有影響水稻根際土壤細(xì)菌豐度,但降低了細(xì)菌群落Alpha-多樣性;水稻品種對(duì)土壤微生物無(wú)顯著影響。

    2.3 Cu脅迫對(duì)水稻根際土壤細(xì)菌群落組成及群落結(jié)構(gòu)的影響

    土壤16S rRNA基因在分類水平上的相對(duì)豐度能反映土壤中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和組成。本研究4個(gè)處理共獲取15個(gè)相對(duì)豐度高于1% 的門水平上的細(xì)菌類群(圖3)。各處理中Proteobacteria(變形菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)共5個(gè)優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群落,占總細(xì)菌群落的70% 以上。其中Proteobacteria相對(duì)豐度最高,占總細(xì)菌群落的29.8% ~ 49.7%;Chloroflexi其次,占7.1% ~ 23.2%。與Cu0處理相比,Cu100處理下HH水稻Nitrospirae (硝化螺旋菌門)相對(duì)豐度顯著下降,根際土壤Bacteroidetes相對(duì)豐度顯著上升;與Cu0處理相比,Cu100處理下MH水稻根際土壤Actinobacteria相對(duì)豐度顯著下降,Bacteroidetes、OP11、TM7相對(duì)豐度顯著上升;同一處理下,兩種水稻根際土壤門水平上的細(xì)菌類群相對(duì)豐度無(wú)顯著差異。雙因素方差分析顯示,水稻根際土壤Actinobacteria、Bacteroidetes、Nitrospirae、OP11、TM7細(xì)菌門的相對(duì)豐度僅受Cu脅迫的顯著影響。上述結(jié)果表明,Cu脅迫并沒(méi)有改變水稻根際土壤中Proteobacteria、Chloroflexi、Acido-bacteria等類群的相對(duì)豐度,但改變了Actinobacteria、Bacteroidetes、Nitrospirae、OP11、TM7等類群的相對(duì)豐度。可見(jiàn),Cu脅迫改變了水稻根際土壤細(xì)菌群落組成,且Cu脅迫下HH與MH水稻根際細(xì)菌群落相對(duì)豐度顯著改變的門類不同;相同重金屬處理下,水稻品種沒(méi)有影響細(xì)菌群落組成。

    圖2 成熟期水稻根際土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性指數(shù)稀釋曲線

    (右表顯示Cu脅迫處理和水稻品種對(duì)細(xì)菌各門類群相對(duì)豐度影響的雙因素方差分析結(jié)果,*和**分別代表在P < 0.05和P < 0.01水平影響顯著)

    PCoA圖中每個(gè)點(diǎn)(樣品)間的空間距離表示細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異程度(圖4)。其中,第1、2主坐標(biāo)的方差貢獻(xiàn)率分別為22.92% 和8.25%。樣品在第1、2主坐標(biāo)排序中分為兩類,HH-Cu0和MH-Cu0處理樣品明顯聚為一組,兩者的Bray-Curtis相似度指數(shù)為0.12(=0.63);HH-Cu100和MH-Cu100處理樣品明顯聚為一組,兩者的Bray-Curtis相似度指數(shù)為0.18(=0.87)。這兩組樣品點(diǎn)顯著分開(kāi),其中HH-Cu0與HH-Cu100處理的Bray-Curtis相似度指數(shù)為1(< 0.05),MH-Cu0與MH-Cu100處理的Bray-Curtis相似度指數(shù)為1(<0.05),顯示Cu0與Cu100處理水稻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。而同一Cu脅迫處理下,兩種水稻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似。可見(jiàn),Cu脅迫改變了水稻根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu);相同重金屬處理下,水稻品種沒(méi)有影響根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

    (RAdonis代表非參數(shù)多因素方差分析(nonparametric MANOVA)指數(shù),由基于Bray-Curtis距離計(jì)算而來(lái);P值指示兩兩處理間的顯著差異)

    3 討論

    Cu是水稻生長(zhǎng)必需的微量元素,它在蛋白質(zhì)構(gòu)成、光合電子轉(zhuǎn)移、線粒體呼吸和細(xì)胞壁新陳代謝等方面起著重要作用,但過(guò)量的Cu會(huì)對(duì)水稻產(chǎn)生毒害作用。Cu脅迫對(duì)水稻的影響主要包括以下兩個(gè)方面:①Cu脅迫對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響;②Cu脅迫對(duì)水稻根際土壤理化性質(zhì)、土壤微生物群落組成、結(jié)構(gòu)及多樣性的影響。本研究以轉(zhuǎn)基因水稻華恢1號(hào)(HH)及其親本水稻明恢63(MH)為材料,根據(jù)我國(guó)土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的二級(jí)農(nóng)田土壤Cu含量標(biāo)準(zhǔn),添加100 mg/kg Cu(II)進(jìn)行脅迫處理,發(fā)現(xiàn)Cu脅迫改變了根際土壤理化性質(zhì),降低了水稻農(nóng)藝性狀、根際土壤微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)及組成,但HH和MH水稻上述指標(biāo)無(wú)顯著差異。

    3.1 Cu脅迫對(duì)水稻農(nóng)藝性狀的影響

    本研究結(jié)果顯示Cu脅迫后,水稻株高、產(chǎn)量、生物量均顯著降低,且兩種水稻各器官重金屬含量分布規(guī)律均為:根>莖>葉>籽粒(未檢測(cè)到)。徐加寬等[19]研究表明,土壤Cu處理使水稻產(chǎn)量顯著低于對(duì)照,且隨著土壤Cu含量的提高水稻產(chǎn)量及生物量下降幅度顯著增大;與本研究不同的是,Cu含量100 mg/kg處理對(duì)水稻株高幾乎沒(méi)有影響。Yan等[2]研究發(fā)現(xiàn),Cu含量100 mg/kg處理下幾種水稻的平均產(chǎn)量均顯著降低,且水稻產(chǎn)量與水稻穗數(shù)和每穗花穎數(shù)呈正相關(guān);與本研究不同的是,其檢測(cè)到水稻籽粒中Cu含量顯著高于對(duì)照,但未超過(guò)綠色大米Cu含量限制(10 mg/kg)[20],表明Cu含量100 mg/kg的水稻土不會(huì)通過(guò)食物鏈影響人類食物安全。顏士敏等[21]研究顯示,施加400 mg/kg Cu脅迫對(duì)不同品種水稻產(chǎn)量及結(jié)實(shí)率影響差異很大。Xu等[22]研究發(fā)現(xiàn),Cu含量100、300 ~ 500、1 000 mg/kg脅迫下,水稻產(chǎn)量分別下降10%、50%、90%,高濃度的Cu嚴(yán)重抑制了水稻的生長(zhǎng),且受Cu脅迫危害最大的水稻器官為根部;與本研究結(jié)果不同的是,其發(fā)現(xiàn)當(dāng)Cu含量低于150 ~ 200 mg/kg時(shí),水稻籽粒中Cu含量隨土壤Cu含量上升而升高。劉光榮等[23]研究顯示,Cu在水稻植株各部分的富集情況是:根>莖葉>籽粒,這與本研究結(jié)果相同。郭家文等[24]研究表明甘蔗根、莖、枯葉、梢頭對(duì)Cu的積累能力總體表現(xiàn)為根>莖>枯葉>梢頭。楊桂芬和李德波[25]的研究表明,高濃度Cu在水稻根部累積,會(huì)使水稻根系變粗,根毛變少,影響根系對(duì)養(yǎng)分的吸收,谷粒不飽滿,造成減產(chǎn);水稻各器官Cu累積量隨土壤施Cu量的增加而增加,其分配規(guī)律為:根>莖葉>籽粒。轉(zhuǎn)基因植物由于外源基因的導(dǎo)入,對(duì)重金屬積累模式會(huì)有深遠(yuǎn)的影響[26]。本研究中Cu脅迫降低了水稻的農(nóng)藝性狀,兩種水稻對(duì)Cu的吸收富集程度不同,其中HH水稻根部Cu含量顯著低于MH水稻,造成兩種水稻根部對(duì)Cu吸收富集程度差異的機(jī)制,及其是否與外源基因的轉(zhuǎn)入、根際土壤微環(huán)境不同有關(guān)等相關(guān)問(wèn)題有待于進(jìn)一步研究。

    3.2 Cu脅迫對(duì)水稻根際土壤理化性質(zhì)、微生物群落組成及結(jié)構(gòu)的影響

    本研究結(jié)果顯示,Cu脅迫后MH水稻根際土壤氧化還原電位值顯著上升,根際土壤理化性質(zhì)發(fā)生變化,這與Ben等[27]及Song等[28]的研究結(jié)果相似,Song等[28]認(rèn)為這可能與海藻糖的凈化機(jī)制相關(guān)。徐家寬等[29]研究發(fā)現(xiàn),隨著土壤Cu含量的增加,水稻拔節(jié)期、抽穗期和成熟期吸氮量均顯著下降,本研究中Cu脅迫后水稻根際土壤全氮含量顯著上升,是否與水稻受Cu脅迫后吸氮量降低相關(guān)?這有待進(jìn)一步對(duì)水稻植株氮素吸收利用等問(wèn)題進(jìn)行論證。

    本研究還發(fā)現(xiàn)Cu脅迫沒(méi)有影響水稻根際土壤細(xì)菌豐度。然而,王秀麗等[30]研究表明,冶煉廠周圍農(nóng)田土壤的全Cu含量隨離廠區(qū)距離的增加而漸降,土壤微生物生物量則隨離廠區(qū)距離的增加而增大;Ellis等[31]也報(bào)道,隨著土壤中全Cu含量的提高,土壤中的可培養(yǎng)微生物總量顯著減少,研究結(jié)果的差異可能與供試土壤、Cu脅迫濃度不同有關(guān)。本研究采用Illumina Hiseq高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)Cu脅迫降低了水稻根際土壤細(xì)菌多樣性,相似地,Mao等[32]通過(guò)向水稻根際土壤中添加Cu(II)脅迫,土壤中產(chǎn)甲烷菌及甲烷氧化菌群落多樣性和豐富度顯著降低;Li等[33]研究發(fā)現(xiàn)在Cu、Zn冶煉廠周圍,土壤微生物多樣性隨重金屬濃度增加而降低;張雪晴[34]利用PCR- DGGE研究發(fā)現(xiàn),隨著土壤Cu污染程度的加大,細(xì)菌群落豐富度及Shannon指數(shù)降低,細(xì)菌群落多樣性下降;Li等[35]利用T-RFLP技術(shù)研究Cu含量0 ~ 3 200 mg/kg 脅迫下土壤微生物群落組成及多樣性,其中Cu含量100 mg/kg脅迫下,土壤16S rRNA基因、氨氧化古菌和細(xì)菌群落數(shù)量顯著下降;微生物群落PCoA多樣性分析結(jié)果顯示,同一含量Cu脅迫樣品明顯聚為一組,且低Cu脅迫與高Cu脅迫樣品顯著分開(kāi),Cu脅迫改變了土壤微生物數(shù)量及多樣性。這些研究均表明,一定的Cu脅迫會(huì)降低土壤細(xì)菌群落多樣性。

    本研究中,Cu脅迫改變了水稻根際土壤細(xì)菌群落組成及群落結(jié)構(gòu)。Choudhary等[36]研究發(fā)現(xiàn),在Cu等重金屬的脅迫下,由于凈化機(jī)制,脯氨酸、丙二醛和超氧化物歧化酶含量上升,藻青菌(Cyanoba-cterium)的生長(zhǎng)受到抑制。Wang等[5]研究發(fā)現(xiàn)在距離Cu冶煉廠200 m處土壤磷酸酶活性明顯降低,通過(guò)PCR-DGGE分析證明重金屬影響土壤細(xì)菌及放線菌的群落結(jié)構(gòu)。本研究Cu脅迫下,HH水稻根際土壤細(xì)菌中Nitrospirae(硝化螺旋菌門)相對(duì)豐度顯著下降,根際土壤Bacteroidetes(擬桿菌門)相對(duì)豐度顯著上升;MH水稻根際土壤Actinobacteria(放線菌門)相對(duì)豐度顯著下降,Bacteroidetes、OP11、TM7相對(duì)豐度顯著上升。謝家輝等[37]利用DGGE技術(shù)對(duì)采集的Cu礦污染土壤樣品進(jìn)行微生物分子生態(tài)多樣性進(jìn)行研究,表明不同重金屬濃度對(duì)微生物多樣性的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,重金屬污染可能改變?cè)形⑸锶郝鋬?nèi)種群間的關(guān)系,新的耐受菌種產(chǎn)生,而原優(yōu)勢(shì)種群失去優(yōu)勢(shì)作用。本研究中HH與MH水稻根際土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度顯著改變的門類不同,說(shuō)明兩種水稻根際土壤內(nèi)Cu脅迫影響的優(yōu)勢(shì)種群不同,新的耐受菌種也不同,而造成這種差異的原因,及其是否與水稻品種、水稻根際土壤微環(huán)境的變化有關(guān)等問(wèn)題還有待進(jìn)一步研究。另外,土壤微生物的演變是長(zhǎng)期且復(fù)雜的過(guò)程,Cu脅迫對(duì)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物的影響需要長(zhǎng)期連續(xù)種植后進(jìn)行驗(yàn)證,且其影響機(jī)制也需要進(jìn)一步探究。

    4 結(jié)論

    相比于不施加Cu脅迫對(duì)照,Cu脅迫顯著抑制了水稻株高、生物量及產(chǎn)量,降低了根際土壤細(xì)菌群落Alpha-多樣性,改變了水稻根際土壤細(xì)菌群落組成和群落結(jié)構(gòu);相比于親本非轉(zhuǎn)基因水稻,種植抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻僅影響了水稻根際土壤氧化還原電位,改變了重金屬在水稻各器官的吸收富集程度。即Cu脅迫抑制了水稻農(nóng)藝性狀及根際土壤細(xì)菌群落,抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻和親本非轉(zhuǎn)基因水稻在Cu脅迫抗性上無(wú)明顯差異。本研究可為抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻生態(tài)安全評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

    [1] 陳衛(wèi)平, 楊陽(yáng), 謝天, 等. 中國(guó)農(nóng)田土壤重金屬污染防治挑戰(zhàn)與對(duì)策[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2018, 55(2): 261–272.

    [2] 陳杰, 宋靖珂, 張晶, 等. 不同鈍化劑對(duì)銅污染土壤原位鈍化修復(fù)[J]. 土壤, 2016, 48(4): 742–747.

    [3] 趙江寧, 王云霞, 沈春曉, 等. 土壤銅污染對(duì)水稻產(chǎn)量形成的影響: 5年定位試驗(yàn)[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境保護(hù), 2012(11): 2073–2081.

    [4] Maarit N R, Heiskanen I, Wallenius K, et al. Extraction and purification of DNA in rhizosphere soil samples for PCR-DGGE analysis of bacterial consortia[J]. Journal of microbiological methods, 2001, 45(3): 155–165.

    [5] Wang Y P, Shi J Y, Wang H L, et al. The influence of soil heavy metals pollution on soil microbial biomass, enzyme activity, and community composition near a copper smelter[J]. Ecotoxicology and environmental safety, 2007, 67(1): 75–81.

    [6] Liu A, Cao H, Yang Y, et al. Combinational effects of sulfomethoxazole and copper on soil microbial community and function[J]. Environmental Science and Pollution Research, 2016, 23(5): 4235–4241.

    [7] 李月靈, 金則新, 李鈞敏, 等. 接種土壤微生物對(duì)銅脅迫下海州香薷生長(zhǎng)及光合生理的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2015, 35(12): 3926–3937.

    [8] 紀(jì)洋, 于海洋, Conrad R, 等. 間隙灌溉和控釋肥施用對(duì)稻田土壤產(chǎn)甲烷微生物的影響[J]. 土壤, 2017, 48(6): 1132–1139.

    [9] 汪魏, 許汀, 盧寶榮. 抗除草劑轉(zhuǎn)基因植物的商品化應(yīng)用及環(huán)境生物安全管理[J]. 雜草科學(xué), 2010, (4): 1–9.

    [10] 崔榮榮, 韋穎, 孟攀潘, 等. 抗草銨膦轉(zhuǎn)基因水稻明恢86B雜草化潛力評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 2012, 26(4): 467–475.

    [11] Dale P J, Clarke B, Fontes E M. Potential for the environmental impact of transgenic crops[J]. Nature Biotechnology, 2002, 20(6): 567–574.

    [12] 吳立成, 李嘯風(fēng), 葉慶富, 等. 轉(zhuǎn)1基因水稻中毒蛋白的表達(dá)、分泌及其在土壤中的殘留[J]. 環(huán)境科學(xué), 2004, 25(5): 116–121.

    [13] Wang Y, Xu W T, Zhao W W, et al. Comparative analysis of the proteomic and nutritional composition of transgenic rice seeds with Cry1 ab/ac genes and their non- transgenic counterparts[J]. Journal of Cereal Science, 2012, 55(2): 226–233.

    [14] Cao Z H, Hu Z Y, Wong M H. Copper contamination in paddy soils irrigated with wastewater[J]. Chemosphere, 2000, 41(1/2): 3–6.

    [15] 劉微, 王樹(shù)濤, 陳英旭, 等. 轉(zhuǎn)Bt基因水稻根際土壤微生物多樣性的磷脂脂肪酸(PLFAs)表征[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, 22(3): 727–733.

    [16] Wang Z, Deng H, Chen L, et al. In situ measurements of dissolved oxygen, pH and redox potential of biocathode microenvironments using microelectrodes[J]. Bioresource Technology, 2013, 132(2): 387–390.

    [17] 白如霞, 劉海, 王玉書, 等. 四川省涼山州紫莖澤蘭的重金屬含量及其肥用安全性評(píng)價(jià)[J]. 土壤學(xué)報(bào), 2018, 55(2): 432–442.

    [18] 徐白璐, 鐘文輝, 黃欠如, 等. 長(zhǎng)期施肥酸性旱地土壤硝化活性及自養(yǎng)硝化微生物特征[J]. 環(huán)境科學(xué), 2017, 38(8): 3473–3482.

    [19] 徐加寬, 楊連新, 王志強(qiáng), 等. 土壤銅含量對(duì)水稻生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量形成的影響[J]. 中國(guó)水稻科學(xué), 2005, 19(3): 262–268.

    [20] 中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì). 食品中銅限量衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn): GB 15199—1994[S]. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社, 1994.

    [21] 顏士敏, 楊洪建, 楊連新, 等. 銅污染對(duì)不同水稻品種產(chǎn)量及其構(gòu)成因子的影響[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2008, 14(6): 67–70.

    [22] Xu J K, Yang L X, Wang Z Q, et al. Toxicity of copper on rice growth and accumulation of copper in rice grain in copper contaminated soil[J]. Chemosphere, 2006, 62(4): 602–607.

    [23] 劉光榮, 魏林根, 周榮嬌, 等. 水稻品種間對(duì)銅的富集和分布差異性特征初探[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 28(1): 12–15.

    [24] 郭家文, 崔雄維, 張躍彬, 等. 重金屬銅在甘蔗體內(nèi)的吸收及對(duì)甘蔗產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J]. 土壤, 2010, 42(4): 606–610.

    [25] 楊桂芬, 李德波. 我國(guó)南方某些銅礦附近水稻土銅污染的調(diào)查研究[J]. 農(nóng)村生態(tài)環(huán)境, 1990(4): 55–58.

    [26] Pavlikova D, Macek T, Mackova M, et al. The evaluation of cadmium, zinc and nickel accumulation ability of transgenic tobacco bearing different transgenes[J]. Plant, Soil and Environment - UZPI(Czech Republic), 2004, 50(12): 513–517.

    [27] Ben M M, Sakouhi L, Karmous I, et al. Protective role of exogenous phytohormones on redox status in pea seedlings under copper stress[J]. Journal of Plant Physiology, 2017, 221: 51–61.

    [28] Song Y F, Cui J, Zhang H X, et al. Proteomic analysis of copper stress responses in the roots of two rice (L.) varieties differing in Cu tolerance[J]. Plant and Soil, 2013, 366(1-2): 647–658.

    [29] 徐加寬, 楊連新, 王志強(qiáng), 等. 土壤銅含量對(duì)水稻氮素吸收利用及其產(chǎn)量的影響[J]. 揚(yáng)州大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2008, 29(2): 72–76.

    [30] 王秀麗, 徐建民, 謝正苗, 等. 重金屬銅和鋅污染對(duì)土壤環(huán)境質(zhì)量生物學(xué)指標(biāo)的影響[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版), 2002, 28(2): 190–194.

    [31] Ellis R J, Neish B, Trett M W, et al. Comparison of microbial and meiofaunal community analyses for determining impact of heavy metal contamination. J Microbiol Methods[J]. Journal of Microbiological Methods, 2001, 45(3): 171–185.

    [32] Mao T T, Yin R, Deng H. Effects of copper on methane emission, methanogens and methanotrophs in the rhizosphere and bulk soil of rice paddy[J]. Catena, 2015, 133: 233–240.

    [33] Li Z J, Xu J M, Tang C X, et al. Application of 16 S rDNA- PCR amplification and DGGE fingerprinting for detection of shift in microbial community diversity in Cu-, Zn-, and Cd-contaminated paddy soils[J]. Chemosphere, 2006, 62(8): 1374–1380.

    [34] 張雪晴. 銅礦重金屬污染對(duì)土壤微生物群落多樣性和酶活力的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2016, 25(3): 517–522.

    [35] Li J, Zheng Y M, Liu Y R, et al. Initial Copper Stress Strengthens the Resistance of Soil Microorganisms to a Subsequent Copper Stress[J]. Microbial Ecology, 2014, 67(4): 931–941.

    [36] Choudhary M, Jetley U K, Abash K M, et al. Effect of heavy metal stress on proline, malondialdehyde, and superoxidedismutase activity in the cyanobacterium Spirulina platensis- S5[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety, 2007, 66(2): 204–209.

    [37] 謝學(xué)輝, 范鳳霞, 袁學(xué)武, 等. 德興銅礦尾礦重金屬污染對(duì)土壤中微生物多樣性的影響[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2012, 39(5): 624–637.

    Effects of Cu Stress on Rhizosphere Soil Microorganisms of Insect-resistant Transgenic Rice

    WANG Xiaoxiao1,2, ZHONG Wenhui1, LI Lei1,2, HONG Xin1,2, LIU Biao3, HAN Cheng1*

    (1 Jiangsu Provincial Key Laboratory of Materials Cycling and Pollution Control, School of Geography Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China; 2 School of Environment, Nanjing Normal University, Nanjing 210023, China; 3 State Environmental Protection Key Laboratory of Biosafety, Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Ecology and Environment of the People’s Republic of China, Nanjing 210042, China)

    Soil environment and crop growth can be connected in rhizosphere soil, which is also the main indicator of the environmental safety assessment of the transgenic rice, but the effect of Cu stress on rhizosphere microorganisms of insect- resistant transgenic rice is still unclear. A pot experiment was conducted in this study and the Illumina Hiseq pyrosequencing technology was carried out to investigate the rhizosphere microbial community of insect-resistant transgenic rice Huahui1 (HH) and its non-transgenic parent line Minghui63 (MH) with or without 100 mg/kg Cu stress (abbreviated as Cu100 and Cu0, respectively). Results showed that Cu stress significantly reduced rice height, biomass and yield, and changed total N content, ammonium content and redox potential value in rice rhizosphere soil. Cu stress did not change the bacterial community abundance, but altered the composition and structure of bacterial community and decreased the Alpha-diversity of bacterial community. No effect on the rice growth and composition and structure of bacterial community was observed between HH and MH varieties with or without Cu stress. These findings indicate that Cu stress can suppress the agronomic traits of rice and the rhizosphere bacterial community, but planting insect-resistant transgenic rice does not change the resistance of rice and rhizosphere bacteria to Cu stress.

    Cu stress; Bacterial community; Transgenic rice; Rhizosphere soil; Environmental safety

    S154.3;Q938.1

    A

    10.13758/j.cnki.tr.2020.01.017

    王宵宵, 鐘文輝, 李磊, 等. 銅脅迫對(duì)抗蟲轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤微生物的影響. 土壤, 2020, 52(1): 119–126.

    農(nóng)業(yè)部轉(zhuǎn)基因生物新品種培育重大專項(xiàng)項(xiàng)目(2016ZX08012005)資助。

    王宵宵(1994—),女,江蘇徐州人,碩士研究生,主要從事土壤生態(tài)與環(huán)境微生物多樣性研究。E-mail:151302147@stu.njnu.edu.cn

    猜你喜歡
    水稻影響研究
    什么是海水稻
    FMS與YBT相關(guān)性的實(shí)證研究
    是什么影響了滑動(dòng)摩擦力的大小
    水稻種植60天就能收獲啦
    軍事文摘(2021年22期)2021-11-26 00:43:51
    遼代千人邑研究述論
    哪些顧慮影響擔(dān)當(dāng)?
    一季水稻
    文苑(2020年6期)2020-06-22 08:41:52
    視錯(cuò)覺(jué)在平面設(shè)計(jì)中的應(yīng)用與研究
    科技傳播(2019年22期)2020-01-14 03:06:54
    水稻花
    文苑(2019年22期)2019-12-07 05:29:00
    EMA伺服控制系統(tǒng)研究
    av网站在线播放免费| 蜜桃国产av成人99| 精品一品国产午夜福利视频| 国产有黄有色有爽视频| 热99re8久久精品国产| 中文字幕最新亚洲高清| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 大陆偷拍与自拍| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 久久久久国产精品人妻一区二区| av天堂在线播放| 亚洲精品美女久久av网站| 一级片免费观看大全| 色婷婷av一区二区三区视频| 成人黄色视频免费在线看| 蜜桃国产av成人99| 精品国产国语对白av| 在线 av 中文字幕| 久久久精品区二区三区| 男女午夜视频在线观看| 成年动漫av网址| 欧美性长视频在线观看| 大片电影免费在线观看免费| 国产精品亚洲av一区麻豆| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 免费人妻精品一区二区三区视频| 最近最新免费中文字幕在线| 欧美xxⅹ黑人| 国产av精品麻豆| 视频区欧美日本亚洲| videosex国产| 老司机影院毛片| 亚洲九九香蕉| 亚洲精华国产精华精| 国产精品成人在线| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 免费观看a级毛片全部| 亚洲精品自拍成人| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲一码二码三码区别大吗| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩欧美免费精品| 黄色视频,在线免费观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 欧美黄色片欧美黄色片| 91精品三级在线观看| 国产又色又爽无遮挡免| 亚洲成人国产一区在线观看| 青春草视频在线免费观看| 欧美精品高潮呻吟av久久| 美女午夜性视频免费| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲国产精品999| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 热re99久久精品国产66热6| 下体分泌物呈黄色| a 毛片基地| 97人妻天天添夜夜摸| 国产精品久久久久久精品古装| 欧美乱码精品一区二区三区| 成人国语在线视频| 香蕉丝袜av| 成人亚洲精品一区在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 五月开心婷婷网| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 日本vs欧美在线观看视频| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | videos熟女内射| 久久中文看片网| 亚洲九九香蕉| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产男人的电影天堂91| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 天堂8中文在线网| 精品久久久精品久久久| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 午夜福利视频精品| 99国产精品99久久久久| 我要看黄色一级片免费的| 黑人操中国人逼视频| 黄网站色视频无遮挡免费观看| av在线老鸭窝| av视频免费观看在线观看| 亚洲成av片中文字幕在线观看| www.999成人在线观看| videosex国产| 欧美在线一区亚洲| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 一区在线观看完整版| 欧美黄色淫秽网站| 91老司机精品| 国产免费一区二区三区四区乱码| 免费在线观看日本一区| 一区二区三区乱码不卡18| 精品久久久精品久久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 国产91精品成人一区二区三区 | 国产精品.久久久| 精品福利永久在线观看| 久久国产精品人妻蜜桃| 99久久人妻综合| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲人成电影观看| 青青草视频在线视频观看| 亚洲精品第二区| 搡老岳熟女国产| 亚洲成av片中文字幕在线观看| www.av在线官网国产| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲人成77777在线视频| 男女之事视频高清在线观看| 两性夫妻黄色片| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 欧美日韩一级在线毛片| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲五月婷婷丁香| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 国产av又大| 国产国语露脸激情在线看| 老司机福利观看| 久久ye,这里只有精品| 中文字幕av电影在线播放| 9色porny在线观看| 男女国产视频网站| 欧美国产精品一级二级三级| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 一本综合久久免费| 一区二区三区激情视频| 老熟女久久久| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 一个人免费在线观看的高清视频 | 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美午夜高清在线| 亚洲av美国av| videosex国产| 中文字幕人妻丝袜制服| 最近最新免费中文字幕在线| 日韩有码中文字幕| 人妻久久中文字幕网| 免费在线观看日本一区| 一级黄色大片毛片| 午夜精品国产一区二区电影| 久热这里只有精品99| 欧美激情极品国产一区二区三区| 午夜福利免费观看在线| 久久精品成人免费网站| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 男女高潮啪啪啪动态图| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 又紧又爽又黄一区二区| 涩涩av久久男人的天堂| 捣出白浆h1v1| 国产一区二区三区av在线| 国产成人a∨麻豆精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| 91成人精品电影| 久久天堂一区二区三区四区| 在线看a的网站| 性少妇av在线| 国产99久久九九免费精品| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 黑人欧美特级aaaaaa片| 午夜91福利影院| 国产av国产精品国产| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲精品av麻豆狂野| 秋霞在线观看毛片| 一个人免费看片子| 美国免费a级毛片| 亚洲 国产 在线| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 最新在线观看一区二区三区| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品国产三级国产专区5o| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 日韩三级视频一区二区三区| 男人操女人黄网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品久久久久成人av| 日本91视频免费播放| 叶爱在线成人免费视频播放| 亚洲伊人久久精品综合| 精品卡一卡二卡四卡免费| 男人舔女人的私密视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产精品成人在线| 淫妇啪啪啪对白视频 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 成人免费观看视频高清| av福利片在线| 在线观看免费高清a一片| 悠悠久久av| 十八禁网站免费在线| 亚洲天堂av无毛| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲熟女毛片儿| 宅男免费午夜| 大香蕉久久成人网| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 一级片免费观看大全| 午夜成年电影在线免费观看| 在线观看www视频免费| 人妻一区二区av| 国产成人影院久久av| 色视频在线一区二区三区| 亚洲 国产 在线| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 在线观看免费日韩欧美大片| 午夜久久久在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 好男人电影高清在线观看| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲国产欧美一区二区综合| 最新在线观看一区二区三区| 9191精品国产免费久久| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 99国产精品一区二区蜜桃av | 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 又大又爽又粗| √禁漫天堂资源中文www| 色老头精品视频在线观看| 美女中出高潮动态图| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 成年人黄色毛片网站| 又黄又粗又硬又大视频| 99国产精品免费福利视频| 精品久久蜜臀av无| 男人舔女人的私密视频| 18在线观看网站| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 欧美黑人欧美精品刺激| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产视频一区二区在线看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 亚洲精品av麻豆狂野| 考比视频在线观看| av网站在线播放免费| 999久久久国产精品视频| 麻豆av在线久日| 精品国产国语对白av| 免费在线观看完整版高清| 精品欧美一区二区三区在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲中文字幕日韩| 麻豆av在线久日| 午夜福利影视在线免费观看| 视频区欧美日本亚洲| 成人影院久久| 精品人妻在线不人妻| e午夜精品久久久久久久| 性色av一级| 亚洲七黄色美女视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲精品日韩在线中文字幕| 岛国在线观看网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产一区二区在线观看av| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 午夜免费成人在线视频| 国产一区二区激情短视频 | 在线观看免费高清a一片| 亚洲伊人色综图| 免费观看av网站的网址| 国产高清videossex| 国产高清视频在线播放一区 | 久久久久精品国产欧美久久久 | 久久中文看片网| 精品熟女少妇八av免费久了| 久久 成人 亚洲| 国产野战对白在线观看| 久久女婷五月综合色啪小说| 性少妇av在线| 国产精品久久久久成人av| 日韩欧美一区视频在线观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产99久久九九免费精品| 久久人人爽人人片av| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 一区二区三区精品91| 高潮久久久久久久久久久不卡| 热99国产精品久久久久久7| videos熟女内射| 国产有黄有色有爽视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产日韩欧美在线精品| 伊人亚洲综合成人网| 黑人猛操日本美女一级片| 不卡一级毛片| 黄色视频,在线免费观看| 精品欧美一区二区三区在线| 三上悠亚av全集在线观看| 十八禁人妻一区二区| 国产精品99久久99久久久不卡| 午夜福利免费观看在线| 国产99久久九九免费精品| 欧美激情 高清一区二区三区| 少妇的丰满在线观看| 久久精品国产a三级三级三级| 国产黄频视频在线观看| 不卡av一区二区三区| 欧美激情极品国产一区二区三区| 青青草视频在线视频观看| 国产免费av片在线观看野外av| 最新在线观看一区二区三区| 国产深夜福利视频在线观看| 最黄视频免费看| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 欧美人与性动交α欧美软件| 男女之事视频高清在线观看| av不卡在线播放| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美久久黑人一区二区| 国产一卡二卡三卡精品| 青春草亚洲视频在线观看| 青春草视频在线免费观看| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 老司机福利观看| 国产一区有黄有色的免费视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久久久久免费高清国产稀缺| av网站免费在线观看视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 中文字幕av电影在线播放| 91精品三级在线观看| 两个人看的免费小视频| 久久久精品免费免费高清| 各种免费的搞黄视频| 99久久人妻综合| 黄色片一级片一级黄色片| 婷婷成人精品国产| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲精品第二区| 亚洲精品自拍成人| 一区二区三区激情视频| 后天国语完整版免费观看| 日韩一区二区三区影片| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲精品国产区一区二| 午夜精品久久久久久毛片777| 亚洲欧美激情在线| tocl精华| 国产高清视频在线播放一区 | 新久久久久国产一级毛片| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 欧美日韩亚洲高清精品| 99久久国产精品久久久| 97在线人人人人妻| 成年女人毛片免费观看观看9 | 又黄又粗又硬又大视频| 满18在线观看网站| a 毛片基地| 伊人亚洲综合成人网| 精品福利观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲欧美激情在线| 成人黄色视频免费在线看| 丝袜在线中文字幕| 国产欧美日韩一区二区精品| 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久精品亚洲av国产电影网| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 欧美日韩一级在线毛片| 国产成人欧美| 母亲3免费完整高清在线观看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 久久精品国产a三级三级三级| 大型av网站在线播放| 国产精品一区二区免费欧美 | 视频区图区小说| 亚洲专区字幕在线| 热99久久久久精品小说推荐| 一区在线观看完整版| 欧美激情久久久久久爽电影 | 精品亚洲成a人片在线观看| 一级片免费观看大全| 精品少妇内射三级| 1024香蕉在线观看| 国产成人欧美在线观看 | 国产欧美日韩一区二区精品| 亚洲一区中文字幕在线| 久久女婷五月综合色啪小说| 看免费av毛片| 在线永久观看黄色视频| 成人国产av品久久久| 午夜免费鲁丝| 午夜福利视频在线观看免费| 亚洲欧美精品自产自拍| av国产精品久久久久影院| 午夜影院在线不卡| 免费看十八禁软件| 国产亚洲精品一区二区www | 亚洲av成人一区二区三| 在线永久观看黄色视频| 色婷婷av一区二区三区视频| 啦啦啦啦在线视频资源| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精品国产av成人精品| 深夜精品福利| 婷婷丁香在线五月| 欧美亚洲日本最大视频资源| 大陆偷拍与自拍| 青春草亚洲视频在线观看| 中文字幕制服av| 中国美女看黄片| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 99精品欧美一区二区三区四区| 日本一区二区免费在线视频| a 毛片基地| 大陆偷拍与自拍| 久久热在线av| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产成人精品无人区| 青青草视频在线视频观看| 啦啦啦免费观看视频1| 日韩有码中文字幕| 麻豆乱淫一区二区| 交换朋友夫妻互换小说| 中文字幕精品免费在线观看视频| 啦啦啦 在线观看视频| 欧美久久黑人一区二区| 另类亚洲欧美激情| 黄色怎么调成土黄色| videosex国产| 女性被躁到高潮视频| 视频在线观看一区二区三区| 久久久久久久大尺度免费视频| 免费在线观看黄色视频的| 自线自在国产av| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 超色免费av| 老熟妇乱子伦视频在线观看 | 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 欧美日韩黄片免| 男女免费视频国产| 欧美乱码精品一区二区三区| 午夜福利在线免费观看网站| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 精品国产一区二区三区四区第35| 99久久国产精品久久久| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 在线天堂中文资源库| svipshipincom国产片| 国产xxxxx性猛交| 欧美黄色淫秽网站| 乱人伦中国视频| 欧美日韩一级在线毛片| 日韩中文字幕欧美一区二区| 一级片免费观看大全| 女性被躁到高潮视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 99久久99久久久精品蜜桃| 在线精品无人区一区二区三| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 波多野结衣av一区二区av| 少妇人妻久久综合中文| 久久久久久久国产电影| 美女主播在线视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 成人手机av| 一级a爱视频在线免费观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 一级毛片女人18水好多| 国产精品二区激情视频| 精品一区二区三区av网在线观看 | 少妇 在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 真人做人爱边吃奶动态| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲精品久久午夜乱码| 男女床上黄色一级片免费看| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲精品一二三| 青春草亚洲视频在线观看| 久热这里只有精品99| 成人三级做爰电影| 美女午夜性视频免费| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 一区在线观看完整版| 亚洲精品国产区一区二| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲精品国产av蜜桃| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 欧美黑人精品巨大| 国产免费视频播放在线视频| 永久免费av网站大全| 动漫黄色视频在线观看| 成人国产av品久久久| 久久亚洲国产成人精品v| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 亚洲五月婷婷丁香| 国产亚洲一区二区精品| 久久99一区二区三区| 五月天丁香电影| 亚洲黑人精品在线| 97人妻天天添夜夜摸| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 少妇 在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 婷婷色av中文字幕| 老司机午夜福利在线观看视频 | 18禁黄网站禁片午夜丰满| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 国产成人欧美在线观看 | 一级黄色大片毛片| 伊人亚洲综合成人网| 777米奇影视久久| 亚洲中文字幕日韩| 欧美精品一区二区免费开放| av福利片在线| 国产精品一区二区在线不卡| 国产亚洲精品一区二区www | 欧美日韩福利视频一区二区| 男女边摸边吃奶| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 午夜免费鲁丝| 美女视频免费永久观看网站| 免费高清在线观看日韩| 两人在一起打扑克的视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产精品影院久久| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲天堂av无毛| 91精品国产国语对白视频| 999精品在线视频| 永久免费av网站大全| 久久99热这里只频精品6学生| 纯流量卡能插随身wifi吗| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 99国产精品一区二区蜜桃av | √禁漫天堂资源中文www| 国产精品熟女久久久久浪| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 久久性视频一级片| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产亚洲一区二区精品| 色94色欧美一区二区| 亚洲欧洲日产国产| 久久久久久免费高清国产稀缺| 免费在线观看完整版高清| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 精品乱码久久久久久99久播| 国产熟女午夜一区二区三区| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲人成77777在线视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产有黄有色有爽视频| 国产99久久九九免费精品| 精品一区二区三卡| 大香蕉久久成人网| 中文字幕精品免费在线观看视频| 天天影视国产精品| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲国产精品一区三区| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 女人精品久久久久毛片| 日韩 亚洲 欧美在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 中文字幕高清在线视频| 深夜精品福利| 中文字幕色久视频| 国产一级毛片在线| 狠狠狠狠99中文字幕| 91老司机精品| 久久久久久人人人人人| 天堂中文最新版在线下载| av天堂久久9| 老熟女久久久| 桃红色精品国产亚洲av| 少妇粗大呻吟视频| 又大又爽又粗| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 一进一出抽搐动态| 美女国产高潮福利片在线看| 十八禁网站网址无遮挡| 大码成人一级视频| 亚洲五月色婷婷综合| 老司机影院毛片| 男女国产视频网站| 日韩欧美国产一区二区入口| 久久香蕉激情| 少妇 在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 精品久久久精品久久久| 国产不卡av网站在线观看| av网站在线播放免费| 老司机靠b影院| 男女边摸边吃奶| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久狼人影院| 两性夫妻黄色片| 一本大道久久a久久精品| 欧美日本中文国产一区发布| 中文字幕色久视频| 日韩视频在线欧美|