熒光定量PCR技術(shù)在臨床微生物檢測中的應(yīng)用價值

蔣雪紛

（新疆伊犁州友誼醫(yī)院檢驗科，新疆 伊犁 835000）

熒光定量PCR技術(shù)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基因，使熒光信號通過累積，實現(xiàn)對整個PCR過程的實時監(jiān)測，達到增強靈敏度，提高監(jiān)測效率，精準定量檢測的效果[1-2]。為探究熒光定量PCR，技術(shù)在臨床微生物檢測中的應(yīng)用效果，本次研究回顧性分析我院門診收治的90例患者的臨床標本，對其熒光定量PCR技術(shù)微生物檢測結(jié)果進行分析，詳見下文描述。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2017年1月-2019年1月間我院門診收治的90例患者的臨床標本，患者中有男45例，女35例，年齡20-75歲，平均（44.28±5.36）歲；病情：泌尿系統(tǒng)感染患者10例，細菌性食物中毒患者6例，上呼吸道感染患者37例，流行性感冒患者27例，腎盂腎炎患者7例，慢性阻塞性肺病患者3例；90份臨床標本中糞便標本51份，尿液標本39份。

1.2 方法 患者標本均采用熒光定量PCR技術(shù)檢測，將樣本增菌液（1.5 mL）滴入滅菌Epp管中，震蕩均勻，置入高速離心機內(nèi)進行2 min離心操作，再徹底分離上層清液，加入μL DNA提取液于余下沉淀中，充分搖勻，沸水浴10 min，再置入高速離心機離心操作5 min，去除4 μg上層清液，完成PCR反應(yīng)，結(jié)束后對標本進行擴增檢測，操作與檢測均嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結(jié)果

2.1 糞便標本與尿液標本中微生物檢測結(jié)果 糞便標本共51份，其中有15株沙門氏菌被檢出，陽性率33.33%，有2株腸出血性大腸桿菌0157：H7被檢出，陽性率3.92%，10株副溶血性弧菌被檢出，陽性率19.61%；尿液標本共39份，其中有4份金黃色葡萄球菌被檢出，陽性率10.26%，見表1。

表1 糞便標本與尿液標本中微生物檢測結(jié)果

2.2 糞便標本與尿液標本中微生物特異性檢測結(jié)果 各取2株沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌0157：H7、副溶血性弧菌及黃色葡萄球菌進行試劑盒特異性檢測，結(jié)果未出現(xiàn)假陽性或假陰性情況，特異性100%；同時對所取菌株進行10倍系列系數(shù)PCR技術(shù)靈敏度檢測，結(jié)果表明102拷貝/mL核酸樣本能夠進行最低核酸檢測限度。

3 討論

熒光定量PCR（fluorescent quantitative PCR）技術(shù)，是指利用熒光基團加入PCR反應(yīng)體系中，通過熒光信號的累積對整個PCR的進程進行實時監(jiān)測，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的檢測方法[3]。該技術(shù)最早出現(xiàn)于上個世紀90年代的美國，其研究人員通過實時監(jiān)控整個PCR過程，對起始模板濃度進行了專一、快速、靈敏以及可重復(fù)性的精確定量檢測，從而開始PCR技術(shù)的高速發(fā)展時期，隨著PCR技術(shù)在臨床中的應(yīng)用越來越廣泛[4]，其獨特的優(yōu)勢得到了廣大研究人員的認可與青睞，其中，PCR技術(shù)在臨床檢測與鑒定中的應(yīng)用主要包括以下幾塊：

3.1 PCR技術(shù)在病毒檢測中的應(yīng)用 目前，PCR技術(shù)在多種病毒的臨床檢測中得到了應(yīng)用，例如有研究人員通過四重TaqMan熒光定量PCR技術(shù)對185份不同基因混合到一起的B型肝炎樣本進行檢測，結(jié)果顯示該方法能夠?qū)λ谢蛐瓦M行檢測，從而對PCR技術(shù)的高精準度進行的驗證[5]；此外，還有研究人員收集了臨床172份手足口病患者的324份標本，針對人腸道病毒、柯薩奇病毒A組16型病毒以及腸道病毒EV71型核酸特異性的反轉(zhuǎn)錄檢測，同時再對上述標本進行熒光定量PCR以及ELISA法檢測，結(jié)果顯示，與反轉(zhuǎn)錄檢測相比，只有反轉(zhuǎn)錄檢測方法檢測結(jié)果與其相近，同時反轉(zhuǎn)錄檢測與反轉(zhuǎn)錄檢測靈敏度均高于ELISA檢測，由此可以印證熒光定量PCR檢測具有高效快捷、特異性強、靈敏度高的優(yōu)勢。

3.2 PCR技術(shù)在細菌檢測中的應(yīng)用 近年來，隨著傳統(tǒng)檢測方法對細菌檢測與鑒別的缺陷逐漸顯露，PCR技術(shù)用于臨床細菌檢測的優(yōu)勢也在逐漸顯現(xiàn)。有研究人員利用PCR技術(shù)創(chuàng)新了一種分枝桿菌的結(jié)合檢測方法，并利用該方法對細菌進行了檢測測試，與傳統(tǒng)涂片染色法及培養(yǎng)法相比，其靈敏度與與特異性分別達到了97.2%與100%，明顯超過了傳統(tǒng)方法。此外還有研究人員利用雙重PCR技術(shù)對鼠傷韓沙門菌與腸炎門菌進行檢測，結(jié)果顯示，雙重PCR技術(shù)檢測靈敏度與特異性均為100%，而檢測時間較傳統(tǒng)檢測方法的4-5 d大大縮短，約為8h即可完成檢測，大大提高了臨床檢測的效率，有助于患者的早期治療，該方法可期待其在未來臨床檢測中的推廣應(yīng)用；還有研究人員采用分組法將230例無癥狀者咽拭子標本進行TaqManMGB探針熒光定量PCR法、常規(guī)PCR法與常規(guī)分離培養(yǎng)法進行檢測，檢測細菌為腦膜炎奈瑟球菌，結(jié)果顯示，上述三種方法的陽性檢出率分別為10.43%、6.52%以及3.48%，也驗證了TaqManMGB探針熒光定量PCR法對于細菌的檢出率均高于常規(guī)PCR法與常規(guī)分離培養(yǎng)法。

3.3 PCR技術(shù)在真菌檢測中的應(yīng)用 臨床中關(guān)于熒光定量PCR檢測方法在真菌檢測中的應(yīng)用均有報道。其中有研究人員通過對曲霉菌的18SRNA序列設(shè)計引物及探針對臨床疑似標本進行檢測，結(jié)果顯示特異性高達100%；有研究人員通過熒光定量PCR方法對異基因造血干細胞移植后侵襲性曲霉菌感染（IA）進行了早期診斷中的評價，結(jié)果顯示該檢測方法敏感性與特異性高達94.4%與100%。

結(jié)合本次研究結(jié)果：各取2株沙門氏菌、腸出血性大腸桿菌0157：H7、副溶血性弧菌及黃色葡萄球菌進行試劑盒特異性檢測，結(jié)果未出現(xiàn)假陽性或假陰性情況，特異性100%；同時對所取菌株進行10倍系列系數(shù)PCR技術(shù)靈敏度檢測，結(jié)果表明102拷貝/mL核酸樣本能夠進行最低核酸檢測限度。

綜上，在微生物的臨床檢測中，熒光定量PCR技術(shù)靈敏度強，特異性好，檢測效率高，還具有精準缺量的特點，值得推廣應(yīng)用。