烏海地區(qū)銅綠假單胞菌耐藥基因研究分析

孫金蓮，孫桂苓，王院，孫建雯

（烏海市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，內(nèi)蒙古 烏海 016000）

PDRPA是引起呼吸道感染也是臨床上分離率較高、其致病性強(qiáng)耐藥率高，是引起臨床感染的常見的主要病原菌之一，該菌感染造成多重耐藥性是院感科監(jiān)測(cè)的重點(diǎn)[1]。其多重耐藥性與其產(chǎn)生生物膜、膜孔蛋白形成及多種耐藥基因產(chǎn)生有密切關(guān)系[2]，由于β2內(nèi)酰胺類抗生素的廣泛使用和碳青酶烯酶的產(chǎn)生及細(xì)胞膜通透性降低造成抗菌藥物失活。該菌感染主要發(fā)生在ICU、呼吸內(nèi)科和神經(jīng)外科分離率明顯增高，近幾年對(duì)多種抗菌藥物的耐藥性呈明顯上升趨勢(shì)，經(jīng)抗菌藥物合理使用和正確干預(yù)耐藥性均有所下降。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 采取2018年1月-2019年12月引起我院門診及住院患者感染送檢的各種標(biāo)本培養(yǎng)共分離出該菌62株，標(biāo)本主要為痰液、傷口分泌物、尿、無(wú)菌體液、支氣管灌洗液，血液嚴(yán)格采集非同一患者不同部位分離到的菌株。

1.2 菌株分離與鑒定 PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（北京六一WD-9413B）；PCR擴(kuò)增試劑盒、核酸染料Mastermix（貨號(hào)pc1120）、細(xì)菌基因DNA提取試劑盒（貨號(hào)D1600）、TAE緩沖液（貨號(hào)T1060）均購(gòu)自北京華大基因生物技術(shù)有限公司。

1.3 細(xì)菌總DNA提取片段 組成分別為：2000 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp本品已含有1×loadingBuffer的DNA溶液，提取的DNA可取8 μL直接電泳。

1.4 PCR擴(kuò)增基因引物設(shè)計(jì) 參照文獻(xiàn)，由北京華大基因生物技術(shù)有限公司合成目的基因片段。β-內(nèi)酰胺酶：TEM-P1：CTGAATGAAGCCATACCAAA；P2：TGTAGATAACTACGATACGGGAG。VEB-P1：GCGGTAATTTAACCAGA；P2: GCCTATGAGCCAGTGTT。CRAB-P1：AAAGCAGATCTTGTGACCTATTC；P2：TCAGCGCGACTGTGATGTATAAAC。OXA-10P1：AATGGTGTTTTCGTGCTTT；P2：TTCTTACTTCGCCAACTTCT。金屬β-內(nèi)酰胺酶： IMP-P1：CGGCCTCAGGAGAGGCTTT；P2:AACCAGTTTTGCCTTACTAT。VIM-P1：TCCGACAGTCAGCGAAT；P2 :GCAGCACCAGGATAGAAGA。DHA P1：AACTTTCACAGGTGTGCTGGGT；405P2：CCGTACGCATACTGGCTTTGC。氨基糖苷類修飾酶：aac（6＇）-Ib P1：ATGACTGAGCATGACCTTGC；P2：TTAGGCATCACTGCGTGTTC。aac（6＇）-II P1：TTCATGTCCGCGAGCACCCC；P2：GACTCTTCCGCCATCGCTCT。ant（2＇）-I P1：GAGCGAAATCTGCCGCTCTGG；P2：CTGTTACAACGGACTGGCCGC。qacE△1-sul1P1：TA GCGA GGGCTTTACTAA GC；P2：CTGAATGAAGCCATACCAAA。膜孔蛋白：OprD2 P1：TGTAGATAACTACGATACGGGAG；P2：GCGGTAATTTAACCAGA。SHV P1：GGTTATGCGTTATATTCGCC786；P2：TCCCGCAGATAAATCACCA。PER P1：AGTCAGCGGCTTAGATA 978；P2：CGTATGAAAAGGACAATC。為避免非特異性擴(kuò)增，反應(yīng)體系需在冰上配置；反應(yīng)開始前預(yù)熱PCR儀至95oC，將反應(yīng)體系充分混勻離心后置于PCR儀上開啟反應(yīng)體系：98oC預(yù)變性5 min、變性15 s，55oC退火30 s 75oC延伸1 min，反應(yīng)1個(gè)循環(huán)，75oC補(bǔ)充延伸5-10 min。

2 結(jié)果

2.1 共分離該菌62株（剔除同一患者重復(fù)菌株） 關(guān)于B2內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果顯示分別為：TEM 68.8%、OprD2 21.9%、VIM 15.3%、IMP 9.4%、SHV 9.4%和DHA 6.3%，未檢出OXA、PER及CRAB基因。

2.2 氨基糖苷類修飾酶基因檢測(cè)結(jié)果 62株該菌檢出氨基糖苷類修飾酶（AMEs）基因檢出率為56.9%。各基因檢出率從高到低分別為aac（6＇）-Ib為23.3%、aac（6＇）-II為19.4%、ant（2＇）-I為14.2%。

2.3 消毒劑與磺胺類和氟喹諾酮類耐藥基因檢測(cè)結(jié)果 62株該菌檢出qacE$2sul1耐藥基因檢出率為28.1%，氟喹諾酮類耐藥基因qnr陰性。

3 討論

該菌屬非發(fā)酵菌屬在自然界分布廣泛，醫(yī)院對(duì)該菌的分離率較高，全院致病菌排名前五位。該菌是引起醫(yī)院感染的重要病原菌，在治療中不斷產(chǎn)生多藥耐藥性與臨床大量使用高級(jí)抗生素有關(guān)[3]。其主要耐藥機(jī)制是膜孔蛋白結(jié)構(gòu)和功能改變、質(zhì)粒及染色體的變異、易產(chǎn)生抗生素降解酶、修飾酶、生物膜的形成等[4]，該菌感染造成臨床治療困難。PCR結(jié)果顯示氨基糖苷類修飾酶、TEM型β2內(nèi)酰胺酶、qacE△1-sul1、VIM型金屬β2內(nèi)酰胺酶等基因擴(kuò)增陽(yáng)性，oprD2基因擴(kuò)增檢測(cè)呈缺失型造成相應(yīng)類別抗生素耐藥[5]。尤其對(duì)碳?xì)涿赶ｎ?、?內(nèi)酰胺類、頭孢菌素類、氨基糖苷類等抗生素均高度耐藥，對(duì)喹諾酮類耐藥率較低。質(zhì)粒中含有大量金屬β2內(nèi)酰胺酶基因造成廣泛傳播,質(zhì)?？梢酝瑫r(shí)攜帶多種滅活藥物的修飾酶形成多重耐藥機(jī)制。同時(shí)臨床的不規(guī)范抗生素使用加快了耐藥的出現(xiàn)降低了治療效果，對(duì)ICU重度感染的患者采取降階梯聯(lián)合治療可以提高抗感染效果。隨著抗生素的廣泛使用耐藥性上升已成為臨床抗感染的嚴(yán)峻課題。因此加強(qiáng)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)為臨床提供科學(xué)依據(jù)，控制多重耐藥菌的產(chǎn)生有著十分重要意義。醫(yī)院應(yīng)嚴(yán)格控制高級(jí)別抗生素的用藥指征，應(yīng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)送檢標(biāo)本依據(jù)藥敏結(jié)果正確選擇抗菌藥物減少耐藥菌株的產(chǎn)生。同時(shí)院感科應(yīng)不斷加強(qiáng)多重耐藥菌的控制，切斷感染源和傳播途徑采取有效措施防止院感爆發(fā)流行。