500例地中海貧血基因檢測(cè)分析

羅桂香，李戀湘，周穎娟，李磊

（珠海市婦幼保健院，廣東 珠海 519001）

地中海貧血屬于一種常見的單基因疾病，而引發(fā)這一疾病的主要原因是珠蛋白基因突變，或者各種合成α、β珠蛋白生成障礙所引發(fā)的遺傳性溶血性疾病，我院孕婦的地中海貧血發(fā)生率較高，被認(rèn)為是造成胎兒早產(chǎn)、宮內(nèi)死亡等不良妊娠結(jié)局的重要危險(xiǎn)因素，并且可能引發(fā)內(nèi)分泌失調(diào)、血栓栓塞等嚴(yán)重并發(fā)癥。所以在當(dāng)前臨床工作中，需要重視對(duì)孕婦的地中海貧血基因檢測(cè)。在本次研究中，本文將選擇500例孕婦為研究對(duì)象，對(duì)其地中海貧血基因檢測(cè)的相關(guān)內(nèi)容進(jìn)行分析，相關(guān)內(nèi)容如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以我院孕檢的500例孕婦為研究對(duì)象，本組孕婦的入選時(shí)間為2019年1月-2019年6月，平均年齡（28.6±3.9）歲。

1.2 研究方法 采用GAP-PCR多聚酶鏈擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)亞能生物技術(shù)（深圳）有限公司的說明書完成DNA采集、數(shù)據(jù)提取、電泳等實(shí)驗(yàn)操作。之后將所獲取的樣本采用NGS測(cè)序法做進(jìn)一步分析，主要路徑包括：（1）通過MAGEN試劑盒（上海伯易生物科技有限公司），采用磁珠法提取孕婦的DNA，并做常規(guī)核酸純化之后，對(duì)孕婦的DNA做定量檢測(cè)。（2）PCR擴(kuò)增，加入引物之后實(shí)施PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的產(chǎn)物放置在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果判斷PCR擴(kuò)增效果是否滿意。（3）構(gòu)建文庫，將相關(guān)擴(kuò)增物（已鑒定）混合之后，建立地中海貧血文庫，并在其中選擇理想的Illumina測(cè)序分型方法完成文庫構(gòu)建。（4）DNA末端修飾。通過加“A”對(duì)本組孕婦DNA資料進(jìn)行處理，并通過Covaris打斷法隨機(jī)打斷之后完成柱式離心純化，并將片段化的DNA末端修復(fù)，修復(fù)后添加A反應(yīng)，連接文庫。（5）文庫定量檢測(cè)與測(cè)序。在本次工作中，為確保文庫定量檢測(cè)與測(cè)序的質(zhì)量，采用Agilent 2100對(duì)文庫質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量，并結(jié)合Q-PCR方法定量檢驗(yàn)文庫產(chǎn)量，根據(jù)最終數(shù)據(jù)判斷文庫制備結(jié)果是否滿足本次研究預(yù)期，對(duì)于檢測(cè)結(jié)果顯示合格者則可以形成DNA簇群，用于產(chǎn)生原始數(shù)據(jù)。（6）數(shù)據(jù)分析。在獲得原始數(shù)據(jù)之后可以直接將數(shù)據(jù)上傳，在數(shù)據(jù)下機(jī)后即可進(jìn)行信息分析流程，先對(duì)下機(jī)的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估測(cè)量之后，除去其中低質(zhì)量以及被污染的數(shù)據(jù)，之后按照primer與index分類情況做后續(xù)數(shù)據(jù)處理。最后，通過BWA軟件將reads數(shù)據(jù)對(duì)比到標(biāo)準(zhǔn)的基因序列中，通過基因序列對(duì)比方法，獲得堿基多態(tài)性分布結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件對(duì)本次研究的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，計(jì)數(shù)資料以例和百分率表示，行χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在本文所選擇的500例樣本中，共篩查出49例地中海貧血孕婦，其中包括α地中海貧血基因突變28例，β地中海貧血基因突變19例，α合并β地中海基因突變2例，相關(guān)資料如表1、表2所示。

表1 500例孕婦地中海貧血的基因突變檢出結(jié)果（n=49）

表2 地中海貧血基因突變分布情況（n=49）

3 討論

地中海貧血是編碼珠蛋白基因變化而引發(fā)的一種或者多種珠蛋白肽鏈合成障礙，發(fā)病后會(huì)造成人體血紅蛋白成分的異常變化，最終造成溶血性貧血，在臨床上可以根據(jù)其不同類型劃分為α地中海貧血、β地中海貧血和異常血紅蛋白病等。其中α地中海貧血基因突變主要是因?yàn)棣林榈鞍谆虻娜笔Щ蛲蛔兌斐闪甩恋鞍纂逆満铣墒芤种?，其中編碼α-珠蛋白基因主要存在于16號(hào)染色體短臂。而β地中海貧血基因突變主要是因?yàn)棣?珠蛋白肽鏈合成受限制有被完全顯示而引發(fā)的貧血。從本次研究結(jié)果來看，在本文所選的500例孕婦中，共發(fā)現(xiàn)地中海貧血孕婦49例，其中α地中海貧血基因突變發(fā)病率最高、β地中海貧血基因突變次之，α合并β地中?；蛲蛔冏畹?，未發(fā)現(xiàn)γ地中海貧血基因突變等少見地中海貧血病例。

現(xiàn)代研究認(rèn)為，我國地中海貧血具有顯著的地區(qū)差異性，其中兩廣及海南等地區(qū)的地中海貧血的發(fā)病率高于全國，在我國南方地區(qū)的自然人群中，地中海貧血的基因攜帶率較高，其中孕育中間型或重型地中海貧血的發(fā)生率較高[1]。所以在臨床上，為了能夠降低地中海貧血新生兒的出生率，在婚前、孕前以及產(chǎn)前進(jìn)行篩查。在本文所選的500例孕婦中，地中海貧血的發(fā)生率為9.8%，略高于文獻(xiàn)[2]，考慮其原因可能為兩者之間的研究方法不同，其中文獻(xiàn)所采用的研究方法是對(duì)患者的平均紅細(xì)胞體積進(jìn)行初篩，根據(jù)初篩結(jié)果對(duì)本組孕婦的地中海貧血情況進(jìn)行判斷，因此只能發(fā)現(xiàn)集中相對(duì)常見的地中海貧血類型；同時(shí)在診斷期間，通過MCV方法對(duì)輕型地中海貧血的基因類型進(jìn)行分析，敏感度較低，在臨床上容易出現(xiàn)誤診漏振等問題，這是目前臨床上在篩查地中海貧血時(shí)難以避免的問題。而在本研究中，本文所采用的方法不經(jīng)過平均紅細(xì)胞體積初篩，而是直接進(jìn)行301型地中海貧血基因檢測(cè)，與傳統(tǒng)方法相比，這種方法對(duì)地中海貧血具有更高的檢出率，不僅能夠?qū)ΤＲ姷牡刂泻Ｘ氀闆r進(jìn)行篩查，也能發(fā)現(xiàn)部分罕見的地中海貧血基因突變情況[3]。

而在確診孕婦存在地中海貧血癥狀之后，需要第一時(shí)間對(duì)孕婦進(jìn)行治療，常見的治療方法包括規(guī)范化輸血、移植造血干細(xì)胞等，而該病癥最核心的方法就是預(yù)防，其中輸血治療的關(guān)鍵就是要將紅血蛋白維持在100 g/L以上，這樣才能為孕婦提供正常的紅細(xì)胞，進(jìn)入改善發(fā)病后所造成的髓外造血以及低氧血癥等，最終避免蓋面心臟以及骨骼畸形等情況的發(fā)生，最終達(dá)到延長患兒壽命的目的。相比之下，輕型地中海貧血對(duì)胎兒的生長發(fā)育的影響很小，普遍不需要采取輸血等治療干預(yù)；而中間型或者重型孕婦應(yīng)該及時(shí)輸血治療[4]。移植造血干細(xì)胞是目前臨床上治療重型地中海貧血唯一的有效方法，該方法有助于延長壽命，并提高生活質(zhì)量，所以對(duì)于有條件的患者應(yīng)該實(shí)施造血干細(xì)胞移植治療，目前多數(shù)研究也證明，將移植造血干細(xì)胞應(yīng)用在重型地中海貧血患兒臨床治療中，發(fā)現(xiàn)該治療方法可以延長患兒的生存時(shí)間，存活率滿意[5]。

綜上所述，我院孕婦的地中海貧血發(fā)病率較高，通過301型地中海貧血基因檢測(cè)保證了檢出率，在臨床上在積極預(yù)防的同時(shí)，對(duì)于確診地中海貧血的孕婦應(yīng)該及時(shí)通過規(guī)范化輸血或者移植造血干細(xì)胞的方法來改善預(yù)后。