土壤和廢水中細菌的分離以及一株變形桿菌的生理生化鑒定

瑪麗帕 吐達洪 周曉璇

【摘 要】目的：加強與鞏固實驗室的標準菌株。方法：以拖把水以及校園內(nèi)土壤為材料，采用營養(yǎng)培養(yǎng)基以及血平板培養(yǎng)基對材料進行菌株分離，并依據(jù)《伯杰氏細菌鑒定手冊》對分離的五株細菌進行進一步生理生化鑒定。結(jié)果：經(jīng)過分離和生理生化鑒定獲得了14株菌株.并且對5株革蘭陰性桿菌進一步生理生化鑒定，最終將菌株TR8初步確定為變形桿菌屬。結(jié)論：結(jié)果表明完全可以定期分離菌株對微生物實驗室菌株進行更新。

【關(guān)鍵詞】細菌;分離;生理生化鑒定

【中圖分類號】R282.2【文獻標識碼】A【文章編號】1005-0019（2020）06--01

快速、準確的微生物鑒定工作，對正確處理和控制公共衛(wèi)生事件具有重要意義.因此，微生物檢驗室必須保藏一批形態(tài)、生物化學、血清學特性穩(wěn)定的標準對照菌株.如果保藏方法及管理不善，菌種優(yōu)良特性便會退化、喪失甚至導(dǎo)致死亡，就會影響菌種鑒定[1].而作為學習微生物鑒定的基礎(chǔ)檢驗專業(yè)教學過程中，標準菌種是最基本的材料之一，定期檢查菌種，保存期檢定菌種的新陳代謝處于最低水平，易發(fā)生變異和死亡?？刂苽鞔螖?shù)越多，變異的機率越大，因此要盡量控制傳代次數(shù)限度或經(jīng)鑒定檢查不合格的，應(yīng)銷毀滅活，并做記錄。本校檢驗專業(yè)微生物教研室長期以來自行保存菌株活化備用，有些重要的菌種出現(xiàn)老化，死亡的現(xiàn)象，本實驗為了做好菌種的保存以及教學過程的質(zhì)量保證，尤其是腸桿菌科鑒定實驗中變形桿菌的常規(guī)檢驗方面缺少標株，因此從校園土壤以及拖把水中分離不同的細菌進行純化以及生理生化鑒定，為中職檢驗班學生提供微生物學檢驗實驗材料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 取樣：采自伊寧衛(wèi)校校園花園中的深層土壤。培養(yǎng)基：營養(yǎng)培養(yǎng)基，血平板培養(yǎng)基，配方參照文獻[2]進行。生理生化反應(yīng)試劑：1%鹽酸對氨基二甲基苯胺水溶液、2%硝酸水溶液、5%孔雀綠水溶液、0.5%沙黃水溶液、盧戈氏碘液、結(jié)晶紫液、甲基紅試劑、格里斯氏試劑、二苯胺試劑、鉀標準溶液

1.2 方法

1.2.1 取樣：從新疆伊寧衛(wèi)校花園中的深層土壤以及拖把水中根據(jù)標準取樣方法進行取樣。

1.2.2 土壤中細菌的分離純化：將采集的土壤和拖把水樣品用生理鹽水將培養(yǎng)物進行梯度稀釋分別以原始濃度（稀釋為）10-1、10-3、10-5在三組固體培養(yǎng)基上接種，并用玻璃棒均勻涂布營養(yǎng)培養(yǎng)基以及血平板培養(yǎng)基上。將接種后的培養(yǎng)基放入恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)溫度36～38℃，培養(yǎng)1～2天。從平板上挑取形態(tài)顏色不同的單菌落，繼續(xù)在新的平板上劃線純化2～3次，獲得純培養(yǎng)物，給菌株編號。

1.2.3 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察[3]

1.2.3.1 簡單染色：取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、干燥、固定。進行染色，滴加草酸銨結(jié)晶紫染色約1 min，水洗。最后鏡檢，干燥后用油鏡觀察。

1.2.3.2 革蘭氏染色：取菌種培養(yǎng)物涂片、干燥、固定、結(jié)晶紫初染、碘媒染、乙醇脫色、稀釋復(fù)紅復(fù)染。

1.2.3.3 芽孢染色法：將培養(yǎng)24小時左右的菌株作涂片、干燥、固定。滴加孔雀綠染液于已固定的涂片上，用飽和的孔雀綠水溶液染10分鐘。用番紅水溶液復(fù)染1分鐘，水洗至水為無色。待干燥后，置油鏡觀察。

1.2.3.4 細菌運動性觀察：壓滴法即直接用載玻片滴一滴生理鹽水后挑取活菌涂片，蓋玻片小心蓋住，鏡下觀察結(jié)果，有鞭毛的細菌有動力。

1.2.4 細菌生理生化鑒定方法：利用氧化酶的測定（Kovacs氏法）、 觸酶的測定 、基紅實驗（M.R實驗）、酰甲基甲醇試驗（VP試驗）、淀粉水解試驗來進行生理生化實驗。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離結(jié)果：利用細菌分離方法分離出形態(tài)及顏色有差異的14株菌株。根據(jù)細菌平板上特性以及染色結(jié)果顯示，分離出7株革蘭陽性桿菌，5株革蘭陰性桿菌，1株革蘭陰性球菌及1株革蘭陽性球菌。

2.3 細菌生理生化鑒定結(jié)果：對14株分離菌進行氧化酶實驗、觸酶實驗、M.R實驗、V.P實驗、淀粉水解實驗，其結(jié)果與伯杰手冊中的相似菌株一致。

2.4 G-桿菌鑒定試驗結(jié)果 根據(jù)生理生化反應(yīng)結(jié)果，G-桿菌五株細菌 TR4、TR6、TB3、TB6、TR8菌株進一步在KIA培養(yǎng)基以及MIU培養(yǎng)基中接種，其具體實驗結(jié)果見表3.

3 分析與討論

在所分離的14株細菌中，菌株 TR4、TR6、TB3、TB6、TR8、TB8為G-桿菌，因當下實驗室變形桿菌屬嚴重污染，而且生理生化反應(yīng)有所變異，所以特此將分離出的G-桿菌進一步在克氏雙糖鐵（KIA）培養(yǎng)基以及動力-靛基質(zhì)-尿素（MIU）培養(yǎng)基中接種，結(jié)果顯示菌株TR4、TR6、TB3、TB6所有生理生化反應(yīng)結(jié)果與《伯杰細菌鑒定手冊》中埃希菌屬分類標準一致，初步鑒定為埃希菌屬。菌株TR8所有生理生化反應(yīng)結(jié)果與《伯杰細菌鑒定手冊》中變形桿菌屬分類標準一致，初步鑒定為變形桿菌屬。變形桿菌TB8以及埃希菌屬TR4、TR6、TB3、TB6的分離對于實驗室進行微生物檢驗課程中的《腸道桿菌的分離鑒定》一章實驗課程提供了最好的實驗材料，菌株TR1、TR2、TR3、TR4、TR6、TR7、TR8、TR9、TR11、TB1、TB3、TB4、TB6、TB7為《常見革蘭陽性兼性厭氧桿菌的檢驗》一章實驗課程提供有效的菌株，尤其是變形桿菌已在實驗室接近死亡，因此該菌的分離為實驗室短缺的菌株填補空白。

菌株TB1為G- 球菌，疑似奈瑟菌屬，但形態(tài)學及生理生化實驗結(jié)果與奈瑟菌屬有明顯差異，需要進一步做生理生化鑒定以及細菌基因序列鑒定。菌株TB7在固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基中均能產(chǎn)生金黃色色素，色素在細菌生長3-5天顏色明顯加深，這株菌的色素分離鑒定有待研究。

參考文獻

劉曉嬌.拮抗放線菌對煙草黑脛病的控病研究[D].西南大學，2011

王霞，薛林貴等.菘藍內(nèi)生細菌的分離、篩選及鑒定[J].生物技術(shù)通報，2018，34（3）：163-169

王平宇、張樹華.硅酸鹽細菌的分離及生理生化特性的鑒定[J].南昌航空工業(yè)學院學報，2001，79-82

布坎南RE，吉本斯NE 著;中國科學院微生物研究所《伯杰細菌鑒定手冊》翻譯組譯.伯杰細菌鑒定手冊.第8版.北京：科學出版社，1984