TWEAK/Fn14在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達及功能分析

張翠榮

河北省邯鄲市中心醫(yī)院婦科，河北邯鄲 056001

子宮內(nèi)膜異位癥其病理生理改變以生長功能子宮內(nèi)膜組織移位為主，臨床表現(xiàn)上以痛經(jīng)、腹盆腔慢性疼痛和性交痛為主，部分患者因此出現(xiàn)繼發(fā)性不孕。腫瘤壞死因子樣凋亡微弱誘導劑（TWEAK）屬于腫瘤壞死因子配體超家族一員，其在1997年被發(fā)現(xiàn)隨后被廣泛研究[1]，基因研究稱其定位于人染色體16q13[2]，是由249個氨基酸組成的一種Ⅱ型跨膜蛋白，雖然其為高度保守結(jié)構(gòu)但具有廣泛生物學活性。TWEAK及其受體Fn14生物學作用包括促進細胞凋亡與增殖、新生血管的形成、增加細胞侵襲能力、激活金屬基質(zhì)蛋白酶活性、同時還能誘導炎癥性細胞因子表達增強[3]。其最主要的生物活性作用領域為腫瘤細胞的增值與凋亡[4]。目前針對TWEAK/Fn14在胃癌、結(jié)腸癌、胰腺癌以及宮頸癌、卵巢癌等惡性腫瘤中的研究較多[5]，均證實其在以上腫瘤發(fā)生發(fā)展中的有重要價值，尤其是調(diào)控腫瘤細胞凋亡及抑制炎癥細胞方面，但目前極少有研究針對良性腫瘤進行研究，本研究主要探討TWEAK/Fn14在子宮內(nèi)膜異位癥中的表達及其功能，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月～2019年4月本院收治的子宮內(nèi)膜異位癥患者40例為觀察組，另外選取同期確診子宮內(nèi)膜癌者40例為對照組。納入標準：（1）所有患者均經(jīng)臨床表現(xiàn)結(jié)合生化輔助檢查診斷；（2）病理組織活檢確診；（3）入組前向患者及其家屬進行知情告知；（4）獲取單位倫理許可。排除標準：（1）妊娠和（或）哺乳期婦女；（2）明確惡性腫瘤；（3）免疫功能異常；（4）內(nèi)分泌功能異常；（5）嚴重心肺肝腎功能異常；（6）凝血功能異常；（7）入組前1個月使用性激素或糖皮質(zhì)激素治療者；（8）簽字拒絕入組者。

觀察組年齡18～40歲，平均（28.3±3.1）歲，病程1～11年，平均（5.1±0.3）年，已婚者33例，未婚者7例，生育情況：已有生育者15例，無生育者25例；對照組年齡19～40歲，平均（28.4±3.0）歲，病程1～11年，平均（5.0±0.3）年，已婚者32例，未婚者8例，生育情況：已有生育者16例，無生育者24例，兩組患者年齡、病程、婚姻情況及生育情況比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 使用材料、儀器及設備

兔抗人TWEAK/Fn14多克隆抗體（北京博爾西科技有限公司，生產(chǎn)批號：20160718）、2300型恒溫培養(yǎng)基（北京福意電器有限公司，生產(chǎn)批號201609012）、小牛血清（北京博爾西科技有限公司，生產(chǎn)批號：201604B111）、17-BQ型低溫冰箱（北京福意電器有限公司）、1100型高速離心機（北京福意電器有限公司）、A5型水溫箱（北京福意電器有限公司）、圖片凝膠成像系統(tǒng)（北京福意電器有限公司）、D6型酶標儀（北京福意電器有限公司）、211-FD型分光光度計（北京福意電器有限公司）以及相應試劑。

1.3 方法

術(shù)前標本均于手術(shù)術(shù)中明視下留取標本送檢，術(shù)后標本獲得均通過宮腔鏡刮宮留取，其中TWEAK mRNA水平表達及E評分通過聚合酶鏈式反應（PCR，福州佳宸生物科技有限公司，批號20160312B11）技術(shù)進行，此后對獲得標本中總RNA提取100mg并將其注入1mL冷凝Trizol液，電動勻漿器8000r/min震蕩30s后將勻漿液移至1.5mL Eppendorf管內(nèi)，隨后加入氯仿200μL，電動勻漿器8000r/min震蕩30s，并于4℃條件下行12000r/min離心15min，丟棄上層液并加入二倍體積異丙醇后搖均，置于-20℃冰箱內(nèi)30min后置入4℃10000r/min離心15min，棄上清液后使用75%乙醇沉淀，最后于40℃條件下8000r/min離心300s，反復以上步驟后，置入65℃烘箱內(nèi)烘干，并行DEPC處理后水解RNA，使用光度儀280nm及260nm定量分析。取40μg以上蛋白通過12%變性聚丙烯酞胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜。并將其置入5%脫脂奶粉溫箱內(nèi)封閉及孵育120min，隨后使用PEST連續(xù)洗滌3次，并加入HRP標記二抗，置于37℃室溫內(nèi)靜置120min，再次使用PEST連續(xù)洗滌3次，行CEL顯色；高倍鏡下陽性染色強度（Ⅰ）評分通過免疫組化（上海國源生物技術(shù)有限公司，批號20160518）技術(shù)進行，免疫組化技術(shù)分別進行標本切片，PBS洗滌，酶染、水洗、加入抗體等過程，所有試驗嚴格按照試驗操作說明書進行。

1.4 觀察指標

比較手術(shù)前后TWEAK mRNA平均水平相對表達，分析兩組手術(shù)前后低倍鏡下E評分和高倍鏡下Ⅰ評分情況。

1.5 評價標準

TWEAK及Fn14表達水平判定[6]：通過免疫組化評分法進行，評價陽性染色細胞范圍（E），通過免疫組化技術(shù)評定高倍鏡下陽性染色強度（I）評分。各標本均行3張連續(xù)切片，每張切片隨機選取其中5個視野，并對各視野計數(shù)100個細胞，隨后取各次細胞計算平均值。其中細胞漿或細胞核膜表現(xiàn)為棕黃色者評定為陽性[7]，隨后統(tǒng)計陽性率。低倍鏡下E評分[8]：陽性染色細胞數(shù)比例≤20%，評定為1分，20%～50%評定為2分，51%～90%評定為3分，＞90%評定為4分；高倍鏡下Ⅰ評分[9]：無、弱陽性為淺黃色、中等陽性為中黃色、強陽性為深黃色或深棕色，分別評分為1～4分。所有結(jié)果均由兩名具有5年以上工作經(jīng)驗的病理科醫(yī)師進行觀察與判斷。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 兩組患者手術(shù)前后TWEAK mRNA平均水平相對表達比較

手術(shù)前兩組TWEAK mRNA平均水平相對表達比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），兩組術(shù)后TWEAK mRNA平均水平相對表達均高于術(shù)前（P＜0.05），術(shù)后觀察組TWEAK mRNA平均水平相對表達情況顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組患者手術(shù)前后TWEAK mRNA平均水平相對表達比較（± s，相對值）

表1 兩組患者手術(shù)前后TWEAK mRNA平均水平相對表達比較（± s，相對值）

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2.2 兩組E評分比較

兩組術(shù)前低倍鏡下E評分比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），兩組術(shù)后低倍鏡下E評分均低于術(shù)前（P＜0.05），術(shù)后觀察組低倍鏡下E評分顯著低于對照組（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組E評分比較（± s，分）

表2 兩組E評分比較（± s，分）

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2.3 兩組I評分比較

兩組術(shù)前高倍鏡下I評分比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），兩組術(shù)后高倍鏡下I評分均低于術(shù)前（P＜0.05），術(shù)后觀察組高倍鏡下I評分顯著低于對照組（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組Ⅰ評分比較（± s，分）

表3 兩組Ⅰ評分比較（± s，分）

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3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥簡稱內(nèi)異癥，疼痛及其導致的不孕癥是最主要臨床癥狀，疼痛表現(xiàn)上以痛經(jīng)、下腹部疼痛及性交痛為主，其嚴重影響患者生活質(zhì)量[10]，價值因其導致的不孕癥，進一步加重對患者生活質(zhì)量的影響[11]。其臨床類型分為腹膜型、卵巢型、深部浸潤型和其他類型四種[12]，其中盆腔發(fā)病者以卵巢型與腹膜型較為多見，重癥患者則以腹膜型、卵巢型合并深部浸潤型三種聯(lián)合發(fā)病。對于本病的發(fā)病機制尚未完全闡明[13]。但作為具有腫瘤相關浸潤性生長的疾病，其與腫瘤相關發(fā)病機制有一定關系[14]。TWEAK及其受體均為腫瘤壞死因子超家族中的一員，屬于可溶性細胞因子，具有調(diào)節(jié)細胞生長與增殖、分化與凋亡以及影響機體炎癥反應等作用，其在腫瘤患者中的價值已經(jīng)研究十分透徹[15]。

本研究觀察組為子宮內(nèi)膜異位癥患者，而對照組則均為經(jīng)病理組織活檢確診的子宮肌瘤患者，針對兩組手術(shù)前后TWEAK mRNA平均水平相對表達比較發(fā)現(xiàn)，手術(shù)前兩組TWEAK mRNA平均水平相對表達比較差異無統(tǒng)計學意義，術(shù)后觀察組TWEAK mRNA平均水平相對表達情況顯著高于對照組。提示手術(shù)干預能有效的升高子宮內(nèi)膜異位癥患者TWEAK mRNA水平，進而減輕其腫瘤浸潤傾向。同時針對兩組手術(shù)前后低倍鏡下E評分及高倍鏡下Ⅰ評分比較發(fā)現(xiàn)，手術(shù)術(shù)后觀察組低倍鏡下E評分顯著低于對照組，且高倍鏡下Ⅰ評分顯著低于對照組。提示手術(shù)干預能有效的提高子宮內(nèi)膜異位癥患者TWEAK/Fn14表達陽性率，對高倍鏡及低倍鏡檢查結(jié)果均具有積極干預價值。正常細胞具有一定的自噬能力，能自我清除代謝產(chǎn)物及損傷細胞器，維持細胞的基本能量需求且確保細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)均有重要意義。對于腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展，還具有一定的抑制效應[16]。TWEAK/Fn14均屬于腫瘤壞死因子受體家族成員，能激活蛋白激酶，并與TWEAK相互結(jié)合，進而激活下游信號轉(zhuǎn)錄因子，從而抑制腫瘤細胞生長與增殖，激活細胞自噬效應[17]，進而提高機體抗腫瘤能力。同時還可降低機體炎癥反應，緩解患者疼痛等臨床癥狀[18]。

綜上所述：TWEAK/Fn14 在子宮內(nèi)膜異位癥術(shù)前患者中表達水平較低，術(shù)后其表達水平顯著升高，提示其在抑制病情發(fā)展，緩解子宮內(nèi)膜異位癥患者病情，減少其浸潤性方面有重要意義。