FTY720通過miR-494/MST1抑制結(jié)腸癌細(xì)胞并增加吉西他濱敏感性的分子機(jī)制

薛 珊, 邢 穎, 宋華偉

薛珊, 邢穎, 陸軍第七十二集團(tuán)軍醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省湖州市 313000

宋華偉, 陸軍第七十二集團(tuán)軍醫(yī)院特診科 浙江省湖州市 313000

核心提要： 化療是結(jié)腸癌的主要治療方式, 免疫抑制劑對(duì)癌癥患者起一定的作用.本研究中使用免疫抑制劑FTY720與吉西他濱聯(lián)合處理結(jié)腸癌細(xì)胞, 對(duì)結(jié)腸癌的治療可能起到一定的積極作用.

0 引言

我國結(jié)腸癌患病率和死亡率均在上升, 2015年新發(fā)37.6萬例, 死亡19.1萬例, 在我國惡性腫瘤中發(fā)病率和死亡率均居第5位[1].化療是大多結(jié)直腸癌患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方法, 化療中加入生物制劑可延長(zhǎng)患者總生存期的中位數(shù)[2].

FTY720又稱芬戈莫德, 是在器官移植和多發(fā)性硬化癥中廣泛使用的免疫調(diào)節(jié)劑.研究表明, FTY720對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞具有明顯的抑制作用[3].吉西他濱是一種抗腫瘤藥物, 被應(yīng)用于包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種癌癥治療, 吉西他濱可通過激活哺乳動(dòng)物Ste20樣激酶1(mammalian Ste20-like kinase 1, MST1)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡[4].但FTY720對(duì)吉西他濱作用的結(jié)腸癌細(xì)胞的敏感性有怎樣的影響目前還不清楚.本研究發(fā)現(xiàn), miR-494與MST1存在結(jié)合位點(diǎn).miR-494在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào),并可促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等行為[5,6].本研究假設(shè), FTY720可通過miR-494調(diào)控MST1增加結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)吉西他濱的敏感性.

本課題以人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW1116為研究對(duì)象, 檢測(cè)FTY720和吉西他濱聯(lián)合使用對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞存活和凋亡的影響, 以及miR-494和MST1在此機(jī)制中的作用.

1 材料和方法

1.1 材料 人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW1116購自美國模式菌種收集中心(american type culture collection, ATCC);FTY720、吉西他濱和胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司; DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自美國Gibco公司; 雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)購自美國Promega公司;Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑Trizol、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程(大連)有限公司公司; CCK8試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司; 雙染色流式法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自美國BD公司; miR-494 mimics(miR-494)、miR-494抑制物(anti-miR-494)、MST1抑制劑(si-MST1)和陰性對(duì)照(miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)、MST1雙熒光素酶報(bào)告載體購自上海吉瑪制藥有限公司; MST1抗體、p21抗體、Caspase-3抗體和GAPDH抗體購自美國Santacruz公司; Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司; 流式細(xì)胞儀購自美國BD公司; BCA蛋白檢測(cè)試劑盒購自美國Thermo.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、藥物處理： SW1116細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、1% 青-鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中, 置于37 ℃5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 濕度保持95%.將細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期, 消化傳代.將細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁后, 在培養(yǎng)液中加入終濃度為0.0001 μg/mL、0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL的吉西他濱和/或2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L、10 μmol/L、12.5 μmol/L的FTY720, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h, 收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染： 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW1116細(xì)胞用培養(yǎng)液稀釋至1×l06-2×l06個(gè)/mL, 以200 μL細(xì)胞/孔的密度接種于6孔板中, 融合度為80%-90%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染.先用無血清培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體、miR-NC、miR-494、anti-miRNC、anti-miR-494、si-NC、si-MST1等載體, 將脂質(zhì)體和各組載體分別以體積混合, 室溫孵育20 min, 加入到培養(yǎng)好的細(xì)胞中, 混勻, 培養(yǎng)6 h, 換完全培養(yǎng)基, 轉(zhuǎn)染48 h, 收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或藥物處理.分組： miR-NC組、miR-494組、anti-miR-NC組、anti-miR-494組、si-NC組、si-MST1組.

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)： 收集各組SW1116細(xì)胞, Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再以cDNA為模板按照Real-time PCR的說明書進(jìn)行反應(yīng)合成miR-494和MST1 mRNA.引物如下： miR-494上游： 5'-TGAAACATACACGGGAAACCTC-3', 下游采用通用引物5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3';MST1上游： 5'-GGGTCCCAGTAGCCAAGAT-3', 下游：5'-GAGGCACCACATACCATTCA-3'; 內(nèi)參U6上游引物：5'-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3', 下游采用通用引物.運(yùn)用2-ΔΔCt方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

1.2.4 CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率和半數(shù)抑制濃度： 收集FTY720和/或吉西他濱處理24 h后的SW1116細(xì)胞,0.25%胰蛋白酶消化, 培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞以2×103個(gè)/孔(100 μL細(xì)胞)接種于96微孔板中, 加入10 μL CCK8溶液,培養(yǎng)2 h, 酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度(Absorbance value, A)值.細(xì)胞存活率 = 實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%.抑制率% = (對(duì)照組A值-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值×100%.以藥物濃度和抑制率分別為橫軸和縱軸, 繪制濃度效應(yīng)曲線, 計(jì)算半數(shù)抑制濃度(50% inhibiting concentration,IC50).

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率： 將SW1116細(xì)胞以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中, 培養(yǎng)24 h (細(xì)胞貼壁), 然后用FTY720和/或吉西他濱處理24 h, 消化收集細(xì)胞, 按照凋亡試劑盒說明書進(jìn)行操作, 加入5 μL膜聯(lián)蛋白標(biāo)記的V-FITC和5 μL碘化丙啶, 混勻后室溫避光20 min, 流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率.

1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)： SW1116細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h, 收集細(xì)胞, Trypsin消化, 計(jì)數(shù), 以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于24孔板中, 培養(yǎng)24 h , 觀察若細(xì)胞融合度達(dá)到80%-90%, 進(jìn)行轉(zhuǎn)染, 分別構(gòu)建MST1的野生型(WT-MST1)和突變型(MUT-MST1)雙熒光素酶報(bào)告載體, 將報(bào)告載體分別與miR-NC或miR-494共轉(zhuǎn)染SW1116細(xì)胞, 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h, 裂解細(xì)胞, 根據(jù)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性.以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照, 計(jì)算相對(duì)螢火蟲熒光素酶活性.

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)： 將轉(zhuǎn)染48 h后的各組SW1116細(xì)胞用RIPA裂解液裂解, 超聲破碎細(xì)胞, 收集蛋白.將蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE, 轉(zhuǎn)膜, 封閉1 h, 加入一抗(MST1：1：1000, p21： 1：2000, Caspase-3： 1：2000), 4 ℃孵育過夜.洗膜2次, 然后加入的二抗(1：1000), 室溫孵育1 h.以GAPDH為內(nèi)參照, 分析蛋白水平.

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果均以mean±SD表示, 數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析, 采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差進(jìn)行分析.以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 FTY720和吉西他濱對(duì)人結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞存活率的影響 與0 μg/mL濃度的吉西他濱(100.11%±10.02%)相比, 0.0001 μg/mL、0.001 μg/mL、0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL的吉西他濱處理的結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞的存活率(95.14%±9.26%、86.84%±8.73%、0.16%±7.14%、54.18%±5.27%、37.68%±3.59%)逐漸降低, 具有劑量依賴性, 計(jì)算得IC50 = 0.1024 μg/mL, 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05); 與0 μmol/L的FTY720 (100.01%±10.01%)相比, 2.5 μmol/L、5 μmol/L、7.5 μmol/L、10 μmol/L、12.5 μmol/L的FTY720處理的結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞的存活率(87.67%±8.37%、71.34%±7.25%、64.30%±6.51%、48.28%±4.56%、39.97%±4.03%)逐漸降低, 具有劑量依賴趨勢(shì), 差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 計(jì)算得IC50 = 8.625 μg/mL (表1、表2).根據(jù)結(jié)果, 后期實(shí)驗(yàn)選用存活率約為50%的吉西他濱濃度0.1 μg/mL, FTY720濃度10 μmol/L.

2.2 FTY720和吉西他濱對(duì)SW1116細(xì)胞存活率凋亡及miR-494、MST1表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比, 吉西他濱組和FTY720組的SW1116細(xì)胞中miR-494的含量均降低(P＜0.05), MST1、p21和Caspase-3蛋白表達(dá)量均升高, 細(xì)胞存活率均降低(P＜0.05), 細(xì)胞凋亡率均上升(P＜0.05); 吉西他濱+FTY720組結(jié)果與吉西他濱組和FTY720組結(jié)果趨勢(shì)一致, 且效果更顯著(圖1、表3).說明兩者聯(lián)合使用可抑制SW1116細(xì)胞存活并促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 且比單獨(dú)使用效果更好.

2.3 過表達(dá)miR-494能逆轉(zhuǎn)FTY720、吉西他濱對(duì)細(xì)胞SW1116細(xì)胞存活率凋亡的影響 與吉西他濱+FTY720+miR-NC組相比, 吉西他濱+FTY720+miR-494組SW1116細(xì)胞的miR-494含量升高(P＜0.05), p21和Caspase-3表達(dá)顯著降低(P＜0.05), 細(xì)胞存活率升高(P＜0.05), 凋亡率下降(P＜0.05)(圖2、表4、表5).說明過表達(dá)miR-494可逆轉(zhuǎn)FTY720、吉西他濱對(duì)SW1116細(xì)胞存活率和凋亡的作用.

2.4 miR-494靶向調(diào)控MST1 Targetscan預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,MST1的3'-UTR序列中含有與miR-494互補(bǔ)的位點(diǎn)(圖3A).雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果如表6所示, 與miR-NC組相比, miR-494組野生型WT-MST1的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性顯著下降(P＜0.05); 而突變型MUT-MST1的螢火蟲熒光素酶相對(duì)活性無明顯變化.Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達(dá)miR-494組的MST1mRNA和蛋白表達(dá)量顯著下降(P＜0.05); miR-494抑制組的MST1 mRNA和蛋白表達(dá)量均顯著上升(P＜0.05)(圖3B、表7).

2.5 抑制MST1可逆轉(zhuǎn)FTY720和吉西他濱作用的細(xì)胞SW1116的細(xì)胞存活率及凋亡的影響 與吉西他濱+FTY720組和吉西他濱+FTY720+si-NC組相比, 吉西他濱+FTY720+si-MST1組的SW1116細(xì)胞中MST1 mRNA含量降低(P＜0.05), p21和Caspase-3表達(dá)顯著降低(P＜0.05), 細(xì)胞存活率升高(P＜0.05), 凋亡率下降(P＜0.05)(圖4、表8).說明抑制MST1可逆轉(zhuǎn)FTY720和吉西他濱對(duì)SW1116細(xì)胞存活率和凋亡的影響.

3 討論

FTY720是臨床批準(zhǔn)的多發(fā)性硬化癥免疫調(diào)節(jié)劑, 通過鞘氨醇-1-磷酸1受體的功能拮抗作用將T細(xì)胞隔離于淋巴結(jié), 有研究表明[7]其在腫瘤的化療中也可發(fā)揮作用.FTY720可增強(qiáng)卡鉑和它莫西芬在卵巢癌患者來源的異種移植模型中的抗腫瘤活性[8]; FTY720可抑制基底樣乳腺癌生長(zhǎng)[9]并增強(qiáng)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞對(duì)替莫唑胺的敏感性[10].有研究表明[11], FTY720對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞也有毒性作用.吉西他濱用于治療結(jié)腸癌、肺癌、卵巢癌、肝膽系統(tǒng)腫瘤等腫瘤, 且效果良好[12,13].FTY720在吉西他濱對(duì)結(jié)腸癌的治療中是否有輔助作用, 目前尚不完全清楚.

本研究通過用不同濃度的FTY720和吉西他濱分別或聯(lián)合處理結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞發(fā)現(xiàn), FTY720和吉西他濱均可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116的存活并促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 細(xì)胞存活率約為50%時(shí)吉西他濱濃度為0.1 μg/mL,FTY720濃度為10 μmol/L, 且兩者聯(lián)合使用對(duì)SW1116細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng).說明FTY720對(duì)吉西他濱抗結(jié)腸癌治療具有促進(jìn)作用, 但具體機(jī)制尚不清楚.

有研究表明[4], 吉西他濱可通過激活MST1并與親環(huán)素D形成線粒體復(fù)合物促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的死亡.而本研究通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn), miR-494與MST1的3'UTR區(qū)存在互補(bǔ)序列, 推測(cè)MST1可能是miR-494的靶基因.因此, 本研究假設(shè), FTY720可能通過miR-494靶向MST1促進(jìn)吉西他濱對(duì)SW1116細(xì)胞的抑制作用.

MST1是一種促凋亡激酶, 是凋亡信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞功能障礙的關(guān)鍵介質(zhì), 其過表達(dá)可引起細(xì)胞的持續(xù)凋亡, 其缺失可導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫缺陷, MST1在腦及心肌缺血再灌注損傷、糖尿病、器官大小控制及腫瘤抑制中起著重要作用[14-17].Hippo通路在癌癥中發(fā)揮其獨(dú)特的致瘤能力, 而MST1是Hippo通路的核心成分(MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ)之一, 因此MST1通過Hippo通路參與對(duì)腫瘤的調(diào)控過程, 其過表達(dá)可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和存活[18].MST1在胰腺導(dǎo)管癌(PDAC)和非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞中均表達(dá)下調(diào), 其過表達(dá)可降低細(xì)胞活力并促進(jìn)細(xì)胞死亡, MST1過表達(dá)與線粒體呼吸功能受損和細(xì)胞能量代謝受抑制密切相關(guān)[19,20].MST1在結(jié)直腸癌中也表達(dá)下調(diào), 其過表達(dá)可誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖和遷移[21].本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn), FTY720和吉西他濱均可促進(jìn)MST1 mRNA和蛋白的表達(dá), 抑制細(xì)胞存活并促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 抑制MST1可逆轉(zhuǎn)FTY720和吉西他濱對(duì)SW1116細(xì)胞存活和凋亡的作用, 說明FTY720通過促進(jìn)MST1抑制結(jié)腸癌.

表1 吉西他濱對(duì)結(jié)腸癌SW1116細(xì)胞存活率的影響(mean±SD, n = 9)

表2 FTY720對(duì)SW1116細(xì)胞存活率的影響(mean±SD, n = 9)

表3 FTY720能增強(qiáng)吉西他濱對(duì)細(xì)胞SW1116細(xì)胞存活率凋亡及miR-494、MST1表達(dá)的影響(mean±SD, n = 9)

表4 過表達(dá)miR-494(mean±SD, n = 3)

表5 過表達(dá)miR-494能逆轉(zhuǎn)FTY720、吉西他濱對(duì)細(xì)胞SW1116細(xì)胞存活率凋亡的影響(mean±SD, n = 9)

表6 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)(mean±SD, n = 9)

圖1 FTY720、吉西他濱對(duì)SW1116細(xì)胞增殖凋亡及MST1、p21、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響.A: FTY720、吉西他濱對(duì)細(xì)胞SW1116細(xì)胞凋亡的影響; B: FTY720、吉西他濱對(duì)細(xì)胞SW1116細(xì)胞增殖的影響; C: MST1、p21、Caspase-3蛋白的表達(dá); D: miR-494的表達(dá).PI: 碘化丙啶.

表7 miR-494調(diào)控MST1的表達(dá)(mean±SD, n = 9)

表8 抑制MST1可逆轉(zhuǎn)FTY720和吉西他濱作用的SW1116的細(xì)胞存活率及凋亡的影響(mean±SD, n = 9)

圖2 過表達(dá)miR-494能逆轉(zhuǎn)FTY720、吉西他濱對(duì)細(xì)胞SW1116凋亡及MST1、p21、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響.A: 過表達(dá)miR-494能逆轉(zhuǎn)FTY720、吉西他濱對(duì)細(xì)胞SW1116細(xì)胞凋亡的影響; B: MST1、p21、Caspase-3蛋白的表達(dá).PI: 碘化丙啶.

圖3 miR-494靶向、調(diào)控MST1.A: MST1的3'UTR含有miR-494的互補(bǔ)序列; B: MST1蛋白的表達(dá).

圖4 抑制MST1可逆轉(zhuǎn)FTY720和吉西他濱作用的細(xì)胞SW1116凋亡及MST1、p21、Caspase-3蛋白表達(dá)的影響.A: 抑制MST1可逆轉(zhuǎn)逆轉(zhuǎn)FTY720、吉西他濱對(duì)細(xì)胞SW1116細(xì)胞凋亡的影響; B: MST1、p21、Caspase-3蛋白的表達(dá).PI: 碘化丙啶.

miR-494在結(jié)腸癌5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil, 5-Fu)耐藥細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào), 通過調(diào)節(jié)DPYD表達(dá)增強(qiáng)結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性[22].本研究證實(shí)了, FTY720和吉西他濱均可抑制SW1116細(xì)胞中miR-494的表達(dá), 過表達(dá)miR-494可逆轉(zhuǎn)FTY720、吉西他濱對(duì)SW1116細(xì)胞存活率和凋亡的作用.通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn), miR-494靶向負(fù)調(diào)控MST1的表達(dá), 間接證實(shí)兩者的調(diào)控關(guān)系.

綜上所述, 本研究闡述了, 在結(jié)直腸癌SW1116細(xì)胞中, FTY720和吉西他濱通過下調(diào)miR-494靶向促進(jìn)MST1的表達(dá), 進(jìn)而抑制SW1116細(xì)胞存活, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 從而達(dá)到治療結(jié)直腸癌的目的.FTY720具有增強(qiáng)結(jié)直腸癌對(duì)吉西他濱敏感性的作用.

文章亮點(diǎn)

實(shí)驗(yàn)背景

結(jié)腸癌患者確診時(shí)多為中晚期, 化療是其主要治療方式.FTY720是一種作用機(jī)制獨(dú)特的免疫抑制劑,可用于器官移植、自體免疫疾病、腫瘤和炎癥等疾病的治療.研究表明, FTY720聯(lián)合化療藥物在癌癥中起到積極作用, 本研究采用FTY720聯(lián)合吉西他濱處理結(jié)腸癌細(xì)胞, 并探討兩者對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用和機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)動(dòng)機(jī)

本研究中使用到的是吉西他濱, 它是目前治療結(jié)腸癌的有效藥物之一; FTY720對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞也具有一定的毒性作用, 兩者聯(lián)合使用可能對(duì)患者的健康有一定的積極意義.

實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

提高吉西他濱對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用, 探討其對(duì)結(jié)腸癌的抑制機(jī)制.

實(shí)驗(yàn)方法

本篇論文為了達(dá)到目標(biāo)采用了細(xì)胞轉(zhuǎn)染、實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、CCK8法、流式細(xì)胞術(shù)、Western blot和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)的方法, 同時(shí)進(jìn)行數(shù)據(jù)比較時(shí)選擇獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間比較, 單因素方差進(jìn)行多組間比較.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

選取抑制率約為50%的0.1 μg/mL吉西他濱和10 μmol/L的FTY720進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 吉西他濱和FTY720均可抑制細(xì)胞存活并促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 且聯(lián)合使用比單獨(dú)使用效果更好; 過表達(dá)miR-494可逆轉(zhuǎn)FTY720、吉西他濱對(duì)SW1116細(xì)胞存活率和凋亡的作用; miR-494靶向調(diào)控MST1; 抑制MST1可逆轉(zhuǎn)FTY720和吉西他濱對(duì)SW1116細(xì)胞存活率和凋亡的影響.

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果, 得出吉西他濱和FTY720可能通過調(diào)控miR-494/MST1途徑抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖, 促進(jìn)細(xì)胞凋亡, 達(dá)到抑制結(jié)腸癌的目的.

展望前景

吉西他濱和FTY720的聯(lián)合使用在結(jié)腸癌的臨床治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值.