基于Wnt、Notch信號通路分析烙灸對脊髓損傷大鼠的神經(jīng)修復(fù)作用

岳倩文　夏鉑

【摘 要】 目的：基于Wnt、Notch信號通路分析烙灸對脊髓損傷后大鼠的神經(jīng)修復(fù)作用。方法：將60只大鼠按照隨機數(shù)表法分為假手術(shù)組、模型組、甲基強的松龍組、2h烙灸組、12h烙灸組，采用改良Allens模型打擊裝置，進行急性脊髓損傷造模。甲基強的松龍組于損傷后0.5h給藥，首次30mg/kg，之后5.4mg/kg給藥。2h烙灸組、12h烙灸組分別于損傷后2h、12h進行烙灸治療。分別在造模成功后第1d、第7d、第14d、第21d進行脊髓組織取材，利用Westernblot進行蛋白表達量的檢測。結(jié)果：在Wnt1、Wnt3a蛋白檢測中，2h烙灸組表達量明顯低于12h烙灸組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;2h烙灸組的Hes5、Presenilin1蛋白高于12h烙灸組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：烙灸在脊髓損傷后激活Wnt及Notch信號通路，而Wnt與Notch信號通路間相互作用，可能影響烙灸治療后相關(guān)因子的蛋白表達量。

【關(guān)鍵詞】 烙灸;脊髓損傷大鼠;Wnt信號通路;Notch信號通路

【中圖分類號】R246.6 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2020）4-0026-06

Effect on Lao Mmoxibustions with Spinal Cord Injury Rats Based on Wnt and Notch Signal Pathway

YUE Qianwen XIA Bo*

Ning Xia Medical University traditional Chinese Medicine faculty，Yinchuan 750004，China

Abstract：Objective To explore the effect of Lao moxibustion on the nerve repair in rats after spinal cord injury based on Wnt and Notch signaling pathway.Methods The sixty rats were randomly divided into sham operation group，model group，methylprednisolone group，2hours Lao moxibustion group and 12hours Lao moxibustion group.Allens method was used to make the rats model of acute spinal cord injury.The western medicine group was given medicine aftermanufacturing model 30 minutes，30 mg /kg for the first time，then 5.4mg/kg was given.The group of manufacturing model two hours to treat Lao moxibustion ，the group after manufacturing model twelve hours to treat Lao moxibustion.On the 1st，7th，14th and 21th day，the injured spinal cord tissue was taken then Using Westernblot to detect the related proteins. ResultsIn the detection of Wnt1 and Wnt3a protein，the expression of two-hour Lao moxibustion group was significantly lower than thetwelve-hour Lao moxibustion groupand the difference was statistically significant（P<0.05）.The difference of Hes5 and Presenilin1 protein in the two-hour Lao moxibustion group was higher than the twelve-hour Lao moxibustion group and the difference was of statistical significance（P<0.05）.Conclusion Lao moxibustion were activated the Wnt and Notch signaling pathways after the spinal cord injury，and the interaction between the Wnt and Notch signaling pathway may affect the protein expression of the related factors after the Lao moxibustion treatment.

Key words：Lao Moxibustion; Spinal Cord Injury Rats; Wnt Signaling Pathway;Notch Signaling Pathway

脊髓損傷（Spinal cord injury ，SCI）是一種損害患者的脊髓結(jié)構(gòu)及功能，引起運動、感覺以及自主神經(jīng)功能障礙或喪失的疾病。不論是采取手術(shù)治療，還是國際通用甲基強的松龍進行沖擊治療，都存在鈉潴留，水腫及尿路感染的風險[1]。烙灸利用溫熱刺激促進受損傷局部氣血運行，加速體液循環(huán)，針對急性病往往有意想不到的作用。烙灸是將烙鐵模具中加艾絨或者其他藥物作用于損傷部位，利用烙鐵作為持續(xù)溫熱刺激傳導(dǎo)于皮膚上，改良了督灸繼發(fā)感染率高的缺點，又給予穴位以持續(xù)溫熱的刺激，從而達到通經(jīng)活絡(luò)、消瘀散結(jié)之目的。臨床上在血管性癡呆、弱少精子癥、骨與關(guān)節(jié)等多種疾病中發(fā)揮著良好療效。本研究主要采用Allens打擊模型造成大鼠急性脊髓損傷，較好的模擬了因外力沖擊等外傷所造成的脊髓受損狀態(tài)。通過Wnt、Notch信號通路，通過對脊髓損傷大鼠的Western Blot檢測，分析烙灸療法對脊髓損傷后大鼠的神經(jīng)修復(fù)機制及是否可以促進神經(jīng)干細胞增殖分化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取清潔級SD大鼠60只（寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，6～8周齡，體質(zhì)量220～240g，雄性）。溫度（25±l）℃，濕度（50±10）%，光暗周期12h/12h，自由進食和飲水，常規(guī)環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng) 14d后進行實驗。

1.2 主要試劑及儀器 甲基強的松龍，SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，RIPA裂解液，縫合線、咬骨鉗、一次性注射器、手術(shù)剪、組織剪等。Tanon-4200全自動化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)、低溫高速離心機（TGL—16G—A 型，上海安亭科學(xué)儀器廠）、超低溫冰箱（MDF—38E2 型，日本三洋公司）、電子恒溫水浴鍋（DZKW-4 型，北京中興偉業(yè)儀器有限公司）、凝膠成像系統(tǒng)（美國 Bio-rad 公司）。

1.3 脊髓損傷模型制備 實驗隨機選取大鼠進行稱重，以100mg/L水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔注射麻醉后，置于弓形手術(shù)臺，備皮消毒，取后正中線以T10作為中點，依次切開皮膚、筋膜、肌肉，微型咬骨鉗咬合T10段椎板、棘突，暴露脊髓。采用改良的Allens打擊裝置，打擊錘重10g，下落高度為5cm，致傷量為50g·cm-1（此致傷量可造成大鼠中等程度脊髓損傷）。當大鼠出現(xiàn)擺尾反應(yīng)，雙側(cè)后下肢無法移動，硬脊膜內(nèi)充血或水腫，則造模成功。每日兩次進行擠壓膀胱排尿。本實驗嚴格按照動物倫理審查指南進行。

1.4 分組及治療 將60只大鼠按照隨機數(shù)表分為5組，每組12只。A組為假手術(shù)組，只做椎管切除，不做任何處理。B組為模型組，在造模成功過后不做治療。C組為甲基強的松龍組，Allens打擊30min后按照30mg/kg給藥，之后按照5.4mg/kg給藥，連續(xù)3d。D組為烙灸2h組，在脊髓損傷后2h進行烙灸。E組為烙灸12h組，在脊髓損傷后12h進行烙灸。除A組外，各組于Allens打擊后腹腔注射2萬μ/kg青霉素，每日1次，連續(xù)3d，防止創(chuàng)面感染。術(shù)后各組予以生理鹽水，連續(xù)3d。

烙灸操作：在烙灸鐵質(zhì)模具中放置艾絨于D組、E組大鼠脊椎T10-T11段兩側(cè)夾脊穴（脊柱區(qū)，第8胸椎至第十二胸椎棘突下兩側(cè)，后正中線旁開0.5寸處）進行治療（穴位定位參照《實驗動物針灸穴位圖譜》），每日1次，每次5min，視皮膚發(fā)紅及異常體液排出等狀況而定。

1.5 取材及相關(guān)指標檢測

1.5.1 組織取材 各組分別于造模成功后的第1d、7d、14d、21d進行脊髓組織提取，每組在每個時間點取3只，長度為損傷上下1cm，進行Westernblot檢測，觀察脊髓Wnt3a、Wnt1、Hes1、Hes5、β-catenin、Presenilin1的蛋白表達量變化。

1.5.2 Western blot檢測組織研磨、RIPA裂解液進行裂解、勻漿后離心，靜置提蛋白，10%分離膠電泳、轉(zhuǎn)至PAGE膜、5%脫脂奶粉室溫封閉1h，孵育一抗：Wnt3a蛋白（1∶[KG-*3/5]1000，Abcam公司）;Wnt1蛋白（1∶[KG-*3/5]1000，Abcam公司）;β-catenin蛋白（1∶[KG-*3/5]5000，Abcam公司）;Hes1蛋白（1∶[KG-*3/5]1000，Abcam公司）;Hes5蛋白（1∶[KG-*3/5]1000，Abcam公司）Presenilin1蛋白（1∶[KG-*3/5]5000，Abcam公司）;GAPDH蛋白（1∶[KG-*3/5]3000，三箭公司）。用漂洗液洗膜3次，孵育二抗 （兔二抗1∶[KG-*3/5]3000，Jackon公司;鼠二抗1∶[KG-*3/5]3000，Jackon公司） 放在化學(xué)發(fā)光成像儀中，曝光。

1.6 數(shù)據(jù)處理 利用Image J軟件進行灰度分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Grapd Prism 5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用（x[TX-*3]±s）表示，多組差異比較采用單因素方差分析，多個樣本均數(shù)間的多重分析采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Wnt信號通路（圖1～圖3） 在Wnt1、Wnt3a、β-catenin蛋白檢測中，C、D、E組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。從β-catenin檢測中可以看出，各組的蛋白表達量隨著時間的損傷時間的延長均呈現(xiàn)出下降趨勢;但各組蛋白表達量均高于假手術(shù)組，表明脊髓損傷后β-catenin表達增強，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路在脊髓損傷后被激活。

在術(shù)后7d的檢測中，C組表達量高于B組跟E組;在術(shù)后14d檢測中，D組表達量高于B組跟E組。由此可以推斷，2h烙灸治療有助于脊髓損傷大鼠激活β-catenin因子。

在Wnt1的蛋白表達量中，D組跟E組呈上升趨勢，B組和C組呈下降趨勢，D組、E組的蛋白表達量低于B組、C組。術(shù)后7d檢測中，C組表達高于B組，B組高于E組;在術(shù)后14d，D組表達量遠遠低于E組。

在Wnt3a檢測中，模型組蛋白表達量在上升，C、D、E組呈下降趨勢。

在術(shù)后7d檢測中，B組大于E組跟D組;在術(shù)后14d檢測中，B組大于E組跟D組。提示實驗中B組7d、14dWnt3a蛋白過表達。而在術(shù)后21d檢測中，C組表達量大于D組。D組在第14天較之E組Wnt3a表達量低，提示脊髓損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞向損傷區(qū)域遷移，修復(fù)受損神經(jīng)元。B組Wnt3a含量最低，提示W(wǎng)nt3a可抑制損傷后炎癥反應(yīng)，幫助損傷區(qū)域的神經(jīng)干細胞修復(fù)。

2.2 Notch信號通路（圖4～圖6） 在Hes1檢測中可以看出，各組的蛋白表達量隨著時間的損傷時間的延長均呈現(xiàn)出下降趨勢。

在術(shù)后7d檢測中，C組高于B組、E組，提示增加了星形膠質(zhì)細胞分化的可能性;在術(shù)后14d檢測中D組表達量高于B組、E組。E組低表達說明烙灸下調(diào)Notch信號通路來促進其向神經(jīng)干細胞分化。

在Hes5檢測中，C、D組蛋白表達量呈下降趨勢，而B組呈上升趨勢，E組術(shù)后7d與術(shù)后14d表達量相同。

術(shù)后7d檢測中，C組蛋白表達量高于B組跟E組，提示增加了星形膠質(zhì)細胞分化的可能性;術(shù)后14d檢測中，D組表達量高于B組、E組;在術(shù)后21d檢測中，D組高于C組。E組低表達說明烙灸下調(diào)Notch信號通路來促進其向神經(jīng)干細胞分化。

在Presenilin1檢測中，B組、D組呈上升趨勢，C組、E組呈下降趨勢。在術(shù)后7d檢測中，C組表達量高于B組、E組，提示Notch信號通路被激活。在術(shù)后14d檢測中，D組蛋白表達量高于B組、E組，提示激活Notch信號通路受到抑制，D組可能通過抑制Notch信號通路來參與脊髓損傷的神經(jīng)修復(fù)。在術(shù)后21d檢測中，D組表達量高于C組。

在Hes1、Hes5、Presenilin1蛋白檢測中，C、D、E組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。在Hes1、Hes5、Presenilin1蛋白檢測中，12h烙灸組明顯優(yōu)于2h烙灸組。

3 討論

3.1 烙灸療法 中醫(yī)學(xué)認為脊髓損傷是由于瘀血阻滯督脈，樞機統(tǒng)帥失職，三陽經(jīng)氣血逆亂而致，其病因為“瘀血”，病機為“督脈樞機不利”。沈金鰲在《雜病源流犀燭》謂“脊痛，督脈病也”。患者由于元陽不振，氣血不調(diào)，經(jīng)絡(luò)堵塞造成肢體活動不利，烙灸正有此功效，它利用艾絨及器具加熱所產(chǎn)生的溫熱刺激，結(jié)合腧穴組織的特點，烙燙皮膚從而激發(fā)人體體液活動稟潛能。在Wnt、Notch信號通路的相關(guān)因子檢測中12h烙灸組的蛋白表達量明顯優(yōu)于2h烙灸組，提示烙灸作為一種熱效應(yīng)，不適合在脊髓損傷后立即應(yīng)用，同時進一步明確烙灸的主要作用為活血化瘀、逐瘀生新、通經(jīng)活絡(luò)。

烙灸始載于《回回藥方·針灸門》，“要知灸的得濟處，是凡一體內(nèi)，多有惡潤凝聚以致本體，并其稟性作壞，若人先有之，然亦不能去凈，必以火灸之，則本體病根盡去”[2]。采用補陽還五湯配合烙灸治療腦卒中的臨床病例觀察中發(fā)現(xiàn)患者的神經(jīng)功能明顯優(yōu)于傳統(tǒng)內(nèi)科基礎(chǔ)治療組[3]。在乳腺增生的疾病治療上根據(jù)月經(jīng)周期以疏肝解郁為治法的中藥其治療效果遠遠低于中藥配合增生局部烙灸組[4]。烙灸正是利用患者病后急需通過大量熱效應(yīng)和強刺激的手段，增加周圍神經(jīng)的敏感度，加強其與大腦中樞神經(jīng)的聯(lián)系。

3.2 脊髓損傷的Wnt信號通路研究 信號通路被激活后可參與脊髓損傷后神經(jīng)及損傷區(qū)域的修復(fù)。Wnt信號通路是目前研究就最多、最透徹的信號通路。Wnt信號通路可以刺激神經(jīng)干細胞的增殖并促使其向神經(jīng)元分化，抑制神經(jīng)干細胞向膠質(zhì)細胞的分化，促進突觸的再生[5]。從術(shù)后7d的蛋白表達量可以看出，在脊髓損傷早期Wnt1被激活后呈現(xiàn)高表達[6]。細胞凋亡、軸突再生、膠質(zhì)瘢痕形成等病理現(xiàn)象是炎癥產(chǎn)生的基礎(chǔ)，DiLiddo[7]研究發(fā)現(xiàn)刺激Wnt3a可明顯改變炎癥因子激活Wnt信號通路抑制炎癥，在SCI的病理過程中起到關(guān)鍵作用。Wnt3a雖然可以促進軸突再生，但過表達會抑制神經(jīng)干細胞的增殖而使其過早向分化為神經(jīng)元[8-9]。本實驗中模型組從術(shù)后7～14d，Wnt3a表達量不斷上升達到頂峰，提示模型組Wnt3a存在過表達。當Wnt/β-catenin信號通路被激活，可促進神經(jīng)干細胞增殖分化為神經(jīng)元[10]，而本實驗除了假手術(shù)組的β-catenin表達量不變，其余各組在損傷后β-catenin蛋白表達升高，術(shù)后14天2h烙灸組的β-catenin表達量最高，表明2h烙灸對脊髓損傷大鼠受損的神經(jīng)干細胞中分化的過程中發(fā)揮主要作用。

3.3 脊髓損傷的Notch信號通路研究 Notch信號通路是神經(jīng)干細胞研究中的一條極為重要的信號通路[11]，通過信號強度影響細胞的分化、增殖和存活。下調(diào)Notch信號通路會促進其向神經(jīng)干細胞分化[12]，激活Notch信號通路有利于神經(jīng)干細胞干性的維持[13]。Hes蛋白通過調(diào)節(jié)控制神經(jīng)和神經(jīng)膠質(zhì)特異性基因的表達，來調(diào)節(jié)控制神經(jīng)干細胞[14]。Hes1只在神經(jīng)干細胞中表達，其缺失會使神經(jīng)元分化增加[15-16]，其高表達會促進神經(jīng)干細胞的增殖，分化為星形膠質(zhì)細胞抑制神經(jīng)干細胞分化為神經(jīng)元[17]。Notch信號表達增強可能是脊髓損傷后限制神經(jīng)功能再生的重要原因， 抑制Notch信號通路活性，可以促進脊髓損傷后功能重建[18]。在Hes1、Hes5及Presenilin1蛋白檢測中，12h烙灸組在術(shù)后7d、14d蛋白表達量明顯低于其余各組，證實12h烙灸治療抑制了Notch信號通路，可促進脊髓損傷功能再生。Nicolas等[19]可知Notch信號在一定條件下具有抑制Wnt信號傳導(dǎo)的作用，因此猜測在Wnt1及Wnt3a蛋白檢測中，脊髓損傷大鼠在經(jīng)過烙灸治療后其蛋白表達量遠低于模型組及甲基強的松龍組，恰恰是Notch通路對Wnt1及Wnt3a的抑制作用。因此Wnt、Notch信號通路相互影響[20]，在脊髓損傷發(fā)生后在進行烙灸后，Wnt、Notch信號通路間的作用及對通路相關(guān)因子的作用仍待進一步研究。

綜上，通過檢測脊髓損傷后Wnt、Notch信號通路相關(guān)因子的蛋白表達量的變化，發(fā)現(xiàn)烙灸可以通過調(diào)節(jié)Wnt、Notch信號通路，來實現(xiàn)脊髓損傷后對神經(jīng)功能的重建，達到修復(fù)受損神經(jīng)干細胞作用，且該療法相較于其他治療費用低，操作簡單，便于臨床推廣。

參考文獻

[1]HURLBERT R J.Methylprednisolone for the treatment of acute spinal cord injury：Point[J].Neurosurgery，2014，61（ Suppl 1）：32-35.

[2]宋峴.回回藥方考釋[M].北京：中華書局，2000：369.

[3]王順吉，冶尕西，劉秀芬，等.補陽還五湯加減配合回醫(yī)烙灸對腦卒中氣虛血瘀證患者神經(jīng)功能的影響[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2016，38（8）：853-855.

[4]李曉龍，冶尕西，馮亞宏.回醫(yī)烙灸法聯(lián)合中藥治療乳腺增生病療效觀察[J].寧夏醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014，36（2）：125-127.

[5]MACNICOL A M，HARDY L L，SPENCER H J.et al.Neural stem and progenitor cell fate transition requires regulation of Musashi1 function[J].BMC Dev.Biol，2015，15：15.

[6]梁新軍，吳燕峰，唐勇，等.大鼠脊髓損傷后Wnt信號分子的表達變化[J].中國脊柱脊髓雜志，2009，19（12）：931-934.

[7]DILIDDO R，BERTALOT T，SCHUSTER A，et al.Anti-inflammatory activity of Wnt signaling in enteric nervous system：in vitro preliminary evidences in rat primarycultures[J].JNeuroinflammation，2015，12 （23） ：1-19.

[8]MUNJI R N，CHOE Y，LI G，et al.Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors[J].JNeurosci，2011，31（5）：1676-87.

[9]韓羽楠，王振宇.Notch和Wnt信號通路對神經(jīng)干細胞增殖分化的影響[J].解剖科學(xué)進展，2014，20（4）：385-387，389.

[10]DANEMAN R，AGALLIU D，ZHOU L.Wnt/A-catenin signaling is required for CNS，but not non-CNS，angiogenesis[J].Proc Nat Acad Sci，2009，106：641.

[11]BAI G，SHENG N Y，XIE Z H，et al.Id Sustains Hes1 Expression to Inhibit Precocious Neurogenesis by Releasing Negative Autoregulation of Hes1[J].Developmental Cell，2007，13（2）：283-97.

[12]趙斌，漢華，白登彥，等.信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在神經(jīng)干細胞分化及其修復(fù)脊髓損傷過程中的作用[J].中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（51）：10159-10162.

[13]KAGEYAMA R，OHTSUKA T，SHIMOJO H，et al.Dynamic Notch signaling in neural progenitor cells and a revised view of lateral inhibition[J].Nat Neurosci，2008;11 （11）：1247-1251.

[14]白瑞櫻，盧娜.Hes1 mRNA在神經(jīng)干細胞向神經(jīng)細胞分化過程中表達變化的研究[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013，42（33）：4048-4050.

[15]賈云峰，高海亮，馬劉佳，等.甲基強的松龍對大鼠急性脊髓損傷模型Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)蛋白表達的影響[J].神經(jīng)解剖學(xué)雜志，2016，32（5）：623-628.

[16]WANG R，ZHAO C G，LI J J，et al.Notch1 promotes mouse spinal neural stem and progenitor cells proliferation via p-p38-pax6 induced cyclin D1 activation[J].Exp Cell Res，2018，373（1-2）：80-90.

[17]BASCH M L，BROWN R M 2nd，JEN H I，et al.Fine-tuning of Notch signaling sets the boundary of the organ of Corti and establishes sensory cell fates[J].Elife，2016（5）：19921.

[18]秦杰，趙立晶，董暉，等.Notch信號通路通過ATF5調(diào)控脊髓神經(jīng)干祖細胞分化[J].山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2019，50（6）：728-733.

[19]NICOLAS M，WOLFER A，RAJ K，et al.Notch1 functions as a tumor suppressor in mouseskin[J].Nat Genet，2003，33：416-421.

[20]COLLU M，HIDALGO-SASTRE A，ACAR A，et al.Dishevelled limits Notch signalling through inhibition of CSL[J].Development，2012，139 （23） ：4405.

（收稿日期：2019-12-09 編輯：劉 斌）

基金項目：寧夏自然科學(xué)基金（2019AAC03095）。

作者簡介：岳倩文（1994-），女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為針推骨傷。E-mail：479663512@qq.com

通信作者：夏鉑（1979-），男，漢族，博士，副教授、碩士研究生導(dǎo)師，研究方向為針推骨傷E-mail：xbll2007@aliyun.com