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    柴胡疏肝湯對(duì)癲癇大鼠miRNA132、NF-kB表達(dá)的影響

    2020-04-09 08:26:34何乾超林潔潔高玉廣張志偉黃德慶張?jiān)?/span>劉永輝陳煒
    關(guān)鍵詞:癲癇

    何乾超 林潔潔 高玉廣 張志偉 黃德慶 張?jiān)⒂垒x 陳煒

    【摘 要】 目的:探討柴胡疏肝湯對(duì)癲癇大鼠微RNA132(miRNA132)、核因子kB(NF-kB)表達(dá)的影響。方法:將實(shí)驗(yàn)大鼠分為癲癇組、假手術(shù)組、空白組,癲癇組采用腹腔注射氯化鋰溶液聯(lián)合鹽酸匹羅卡品誘發(fā)癲癇模型,建立癲癇模型后,篩選出造模成功大鼠,隨機(jī)分為模型組、中藥組、西藥組,中藥組用柴胡疏肝湯灌胃,西藥組給予卡馬西平片,模型組及其他各組給予同等量的生理鹽水灌胃,最后比較各組的大鼠的癇性發(fā)作情況,并用PCR檢測(cè)各組大鼠海馬及顳葉皮層中miRNA132、NF-kB的mRNA的表達(dá)。結(jié)果:①空白組和假手術(shù)組無(wú)癇性發(fā)作,模型組1~4周的癇性發(fā)作級(jí)別數(shù)值無(wú)變化,西藥組和中藥組的癇性發(fā)作從1~4周逐次減少。第1周,模型組與中藥組的癇性發(fā)作級(jí)別數(shù)值無(wú)變化(P>0.05),西藥組的癇性發(fā)作級(jí)別數(shù)值低于模型組 (P<0.05)。第2~4周,中藥組的癇性發(fā)作級(jí)別數(shù)值均低于模型組(P<0.05),西藥組的癇性發(fā)作級(jí)別數(shù)值均低于中藥組(P<0.05)。②空白組和假手術(shù)組的miRNA132表達(dá)無(wú)差別(P>0.05),模型組的miRNA132表達(dá)低于假手術(shù)組(P<0.05),中藥組的miRNA132表達(dá)高于模型組(P<0.05),西藥組的miRNA132表達(dá)高于中藥組(P<0.05)。③空白組和假手術(shù)組的NF-kB的mRNA表達(dá)無(wú)差別(P>0.05),模型組的NF-kB的mRNA高于假手術(shù)組(P<0.05),中藥組的NF-kB的mRNA低于模型組(P<0.05),西藥組的NF-kB的mRNA低于中藥組(P<0.05)。結(jié)論:柴胡疏肝湯可以提高miRNA132,減少NF-kB表達(dá),減少癲癇大鼠的癇性發(fā)作。

    【關(guān)鍵詞】 柴胡疏肝湯;癲癇;miRNA132;NF-kB

    【中圖分類(lèi)號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517(2020)4-0021-05

    癲癇是腦部組織神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致中神經(jīng)系統(tǒng)功能短暫失常的疾病,臨床癥狀以反復(fù)發(fā)生抽搐及短暫意識(shí)變化為主,是一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。目前全世界約有五千萬(wàn)癲癇患者,其中90%的患者在發(fā)展中國(guó)家。中國(guó)癲癇患病率為4‰~7‰,其中活動(dòng)性癲癇患病率為4.6‰[1]。許多癲癇患者主要是采取藥物治療控制,但還有高達(dá)30%患者反復(fù)發(fā)作、病情難控制,嚴(yán)重干擾著患者的生活及工作[2]。癲癇神經(jīng)元高興奮性與癲癇形成過(guò)程中的炎性反應(yīng)和炎癥介質(zhì)密切相關(guān),尤其是核因子kB(NF-kB)途徑,NF-kB進(jìn)入細(xì)胞核,然后再與相應(yīng)靶序列接合,控制靶基因的轉(zhuǎn)錄活性,NF-kB參加炎癥反應(yīng)、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等過(guò)程,與癲癇密切相關(guān)[3]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA能使癲癇患者神經(jīng)元突觸周?chē)鞍踪|(zhì)異常表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)癲癇發(fā)作[4]。miRNA132表達(dá)與癲癇的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),miRNA132上調(diào)可提高神經(jīng)元興奮性,且調(diào)節(jié)過(guò)表達(dá)的miRNA132可減輕癲癇的癇性發(fā)作,但是目前尚缺乏中醫(yī)藥對(duì)關(guān)鍵因子調(diào)控miRNA132的研究[5]。

    《黃帝內(nèi)經(jīng)》中對(duì)“癲癇”的記載,認(rèn)為癲癇發(fā)作與肝失疏泄,氣機(jī)逆亂關(guān)系密切,其發(fā)病原因也不離風(fēng)、火、痰、食,基本的發(fā)病病機(jī)為痰涎雍滯、迷閉孔竅,痰在癲癇的發(fā)病中起非常重要的作用。因此,治療上常以化痰解郁,疏肝理氣為治法。柴胡疏肝湯出自《景岳全書(shū)》,是疏肝理氣的經(jīng)典方。柴胡疏肝湯組成由柴胡、香附、白芍、川芎、枳殼、陳皮、甘草組成,功效是疏肝行氣,活血止痛。方中柴胡功善疏肝解郁,使肝木條達(dá),現(xiàn)代藥理研究證實(shí)柴胡具有疏肝解郁、鎮(zhèn)痛、消炎、鎮(zhèn)靜等抑制中樞的作用;香附理氣疏肝而止痛,川芎活血行氣以止痛,二藥相合,助柴胡以解肝經(jīng)之郁滯,并增行氣活血止痛之效,共為臣藥;陳皮、枳殼理氣行滯,芍藥斂陰柔肝,甘草養(yǎng)血柔肝,緩急止痛,調(diào)和諸藥,為使藥;諸藥相合,共奏疏肝行氣、活血止痛之功。李華霞[6]等對(duì)柴胡疏肝湯治療癲癇進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝湯加味具有明顯的抗癲癇作用。我們認(rèn)為癇病的病機(jī)與肝的疏泄功能異常關(guān)系密切,其風(fēng)、痰、癖產(chǎn)生均為肝氣失于疏泄、條達(dá)的病理變化,提出了“從肝論治”,運(yùn)用加味柴胡疏肝湯(柴胡 12g、陳皮 12g、川芎 9g、炒枳殼 9g、芍藥 9g、香附 9g、炙甘草 6g、浙貝母 12g)治療癲癇。前期的臨床研究發(fā)現(xiàn),使用柴胡疏肝湯治療能夠明顯減少患者癇性發(fā)作的頻次,改善了患者腦電圖變化,增強(qiáng)治療的效果[7-9]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),加味柴胡疏肝湯能夠升高miRNA-204的表達(dá),減少神經(jīng)元細(xì)胞過(guò)度自噬,保護(hù)神經(jīng)功能從而達(dá)到治療癲癇的作用[10]。柴胡疏肝湯還可以通過(guò)調(diào)節(jié)外周色氨代謝產(chǎn)物及癲癇小鼠色氨酸代謝通路治療癲癇[11]。柴胡疏肝湯干預(yù)不同靶點(diǎn)及信號(hào)通路能減少癲癇的發(fā)作次數(shù),隨著miRNA作為癲癇的生物標(biāo)志物開(kāi)始被重視,對(duì)miRNA的作用靶點(diǎn)及涉及的信號(hào)通路進(jìn)一步深入探討研究,將研究出更多作用在這些靶點(diǎn)的藥物從而根本上減少及抑制癲癇發(fā)作,減輕癲癇發(fā)作對(duì)人體生理病理引起的損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合前期基礎(chǔ),運(yùn)用柴胡疏肝湯對(duì)癲癇大鼠模型進(jìn)行干預(yù)治療,觀察柴胡疏肝湯對(duì)癲癇大鼠miRNA132的影響,從而探討柴胡疏肝湯治療癲癇與調(diào)控miRNA132表達(dá)的關(guān)系。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠120只,年齡3~4個(gè)月,體重170~210g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司供應(yīng),動(dòng)物許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002,動(dòng)物合格證號(hào):2015000536122。所有大鼠在室溫(23~25 ℃),濕度為45%~55%,光照12 h/d,自由進(jìn)水進(jìn)食,經(jīng)過(guò)7d時(shí)間的適應(yīng)后進(jìn)行試驗(yàn)。

    1.2 藥物、試劑 柴胡疏肝湯由柴胡12g、陳皮12g、川芎9g、炒枳殼9g、芍藥9g、香附9g、炙甘草6g、浙貝母12g按比例調(diào)配,中藥由廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供,中藥制劑室煎煮濃煎至1g/mL,放于4℃冷藏備用??R西平片(上海福達(dá)制藥有限公司),氯化鋰(批號(hào):310468,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司),匹羅卡品 (天津金耀氨基酸有限公司),硫酸阿托品注射液(北京雙鶴藥業(yè)股份有限公司),地西泮注射液(天津藥業(yè)焦作有限公司),RNAwait非凍型組織RNA保存液(批號(hào):SR0020,Solarbio), Trlzol Reagent (批號(hào):184608,Ambion),SYBR Green qPCR Mix (批號(hào):140321,Monad),MonScript RTIII all-in-one Mix(批號(hào):RN05004S,Monad)。

    1.3 儀器 AR2140電子分析天平(OHAUS),5417R高速冷離心機(jī)(Thermo Multiskan公司),ABI7600定量PCR儀器(美國(guó)LIFE公司)。

    1.4 模型制備 造模方法參考Cell Reports雜志報(bào)道的以腹腔注射氯化鋰溶液聯(lián)合鹽酸匹羅卡品這種化學(xué)點(diǎn)燃方法[12]為主,先對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠向腹腔注射氯化鋰溶液127mg/kg,20 h后再注射匹羅卡品50mg/kg(處理前30min先給予硫酸阿托品注射液1mg/kg以對(duì)抗匹羅卡品所致的外周性的膽堿能反應(yīng)),匹羅卡品注射后參照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[13]觀察大鼠行為學(xué)變化,0級(jí):沒(méi)有抽搐發(fā)作;1級(jí):存在有面部痙攣;2級(jí):存在有面部痙攣和規(guī)律性的點(diǎn)頭;3級(jí):存在有面部痙攣和規(guī)律性的點(diǎn)頭、一側(cè)前肢陣攣;4級(jí):存在有面部痙攣、規(guī)律性的點(diǎn)頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立;5級(jí):存在有面部痙攣、規(guī)律性的點(diǎn)頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立、跌倒。達(dá)到4~5級(jí)并進(jìn)入癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)的大鼠為癲癇誘導(dǎo)成功;沒(méi)有發(fā)作或沒(méi)有達(dá)到 4級(jí)的大鼠不納入本研究。如果癲癇狀態(tài)持續(xù)達(dá)1 h,則采取注射地西泮10mg/kg 終止發(fā)作。癲癇持續(xù)狀態(tài)后的大鼠度過(guò)急性期24 h后,進(jìn)入潛伏期(10 d),在潛伏期,每天采用5%的葡萄糖氯化鈉注射液5mL注射,2次/d,潛伏期后進(jìn)入慢性期。癲癇持續(xù)狀態(tài)后,用監(jiān)控視頻系統(tǒng)連續(xù)記錄。每個(gè)鼠籠放置八只大鼠,用苦味酸進(jìn)行記號(hào),檢測(cè)時(shí)間24 h,觀察時(shí)期為慢性期的四周。

    1.5 動(dòng)物分組及給藥 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為①癲癇組(n=72),②假手術(shù)組(n=24),③空白組(n=24),癲癇組采用上述方法進(jìn)行造模,空白組無(wú)需任何處理,假手術(shù)組僅用腹腔注射生理鹽水造模。造模成功后,將72只模型大鼠隨機(jī)分為 3 組,分別是模型組、中藥組、西藥組。中藥組給予柴胡疏肝湯水煎劑灌胃給藥,西藥組給予卡馬西平片,其余各組給予同等量的生理鹽水灌胃,以2mL/100g 體重灌胃給藥,每日 1 次,灌胃的時(shí)間為4 周。

    1.6 取材及組織處理??? 用10%水合氯醛(劑量10mg/kg),腹腔注射麻醉各組大鼠,然后以仰臥位,將其四肢固定于解剖硬板上,打開(kāi)胸部,暴露心臟后,將灌注有生理鹽水針頭插入左心室,把右心耳剪掉,與此同時(shí),快速灌注生理鹽水,隨即,進(jìn)行斷頭取腦,繼續(xù)用生理鹽水沖去殘余血液,在大腦中下三分之一交界處,剝離出雙側(cè)海馬組織,與此同時(shí),剝開(kāi)顳葉皮層,放置于RNA保護(hù)液中,再放入-80℃冰箱中保存。

    1.7 觀測(cè)指標(biāo)與方法

    1.7.1 癇性發(fā)作行為記錄 24 h監(jiān)測(cè)大鼠癇性發(fā)作行為改變,參照Racine分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)(0級(jí):沒(méi)有抽搐發(fā)作;1級(jí):存在有面部痙攣;2級(jí):存在有面部痙攣和規(guī)律性的點(diǎn)頭;3級(jí):存在有面部痙攣和規(guī)律性的點(diǎn)頭、一側(cè)前肢陣攣;4級(jí):存在有面部痙攣、規(guī)律性的點(diǎn)頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立;5級(jí):存在有面部痙攣、規(guī)律性的點(diǎn)頭、雙前肢發(fā)生陣攣、后肢站立、跌倒)觀察大鼠行為學(xué)變化進(jìn)行評(píng)分。

    1.7.2 miRNA-132 、NF-kB的 mRNA 的PCR 檢測(cè) 提取總 RNA,擴(kuò)增 mRNA,再逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA,應(yīng)用 PCR 方法對(duì)NF-kB、miRNA-132的 mNRA 水平進(jìn)行檢測(cè)。記錄每個(gè)反應(yīng)管中標(biāo)本的Ct值,實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用2-△△CT法進(jìn)行分析?!鰿T=目的基因CT值-內(nèi)參基因CT值。

    1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料滿(mǎn)足正態(tài)分布的前提下,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x[TX-*3]±s)表示,兩組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn),三組樣本均數(shù)比較采用方差分析,P<0.05表示差異具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 各組癇性發(fā)作情況 由表1可知,空白組和假手術(shù)組無(wú)癇性發(fā)作,模型組1~4周的癇性發(fā)作級(jí)別數(shù)值無(wú)變化,西藥組和中藥組的癇性發(fā)作從1~4周逐次減少。第1周,模型組與中藥組的癇性發(fā)作級(jí)別數(shù)值無(wú)變化(P>0.05),西藥組的癇性發(fā)作級(jí)別數(shù)值低于模型組 (P<0.05)。第2~4周,中藥組的癇性發(fā)作級(jí)別數(shù)值均低于模型組(P<0.05),西藥組的癇性發(fā)作級(jí)別數(shù)值均低于中藥組(P<0.05)。

    2.2 miRNA132、NF-kB的mRNA表達(dá) 由表2可知,空白組和假手術(shù)組的miRNA132表達(dá)無(wú)差別(P>0.05),模型組的miRNA132表達(dá)低于假手術(shù)組(P<0.05),中藥組的miRNA132表達(dá)高于模型組(P<0.05),西藥組的miRNA132表達(dá)高于中藥組(P<0.05)。空白組和假手術(shù)組的NF-kB表達(dá)無(wú)差別(P>0.05),模型組的NF-kB表達(dá)高于假手術(shù)組(P<0.05),中藥組的NF-kB表達(dá)低于模型組(P<0.05),西藥組的NF-kB表達(dá)低于中藥組(P<0.05)。

    3 討論

    癲癇最早在《黃帝內(nèi)經(jīng)》中記載,稱(chēng)“羊角風(fēng)”、“羊癇風(fēng)”等,中醫(yī)歸屬于“癇病”的范疇。癇病的病因病機(jī)與肝失疏泄密切聯(lián)系,其風(fēng)、火、痰的產(chǎn)生均為肝氣失于疏泄、條達(dá)的病理變化,“從肝論治”癇病尤為重要。柴胡疏肝湯是疏肝理氣的常用方,在“從肝論治”的理論下運(yùn)用柴胡疏肝湯治療癲癇,取得了明顯的療效,但是對(duì)于柴胡疏肝湯治療癲癇的分子機(jī)制上不清楚,故值得我們進(jìn)一步探究,為臨床上治療癲癇提供理論依據(jù)。

    癲癇是神經(jīng)內(nèi)科常見(jiàn)的疾病之一,其發(fā)病機(jī)制目前尚未清楚,大多數(shù)癲癇患者經(jīng)過(guò)規(guī)范藥物治療后,病情可以得到較好的控制,但仍有少部分患者反復(fù)發(fā)作、難以控制。因此,尋找新的治療方式或藥物來(lái)更好地改善癲癇患者癥狀,提高治療有效率尤為迫切。miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)較豐富,參與調(diào)控基因表達(dá),與癲癇發(fā)生的大腦的神經(jīng)病理改變有著密切,并且miRNA可以作用于多個(gè)靶點(diǎn)來(lái)調(diào)控多條蛋白通路的基因表達(dá)。研究表明,生物體內(nèi)的細(xì)胞中有超過(guò)60%的蛋白表達(dá)是通過(guò)miRNA調(diào)控的[14]。以miRNA132作為癲癇基因表達(dá)調(diào)控的靶點(diǎn)時(shí),在癲癇發(fā)作后,miRNA132可以減少癲癇發(fā)作誘導(dǎo)的神經(jīng)元壞死[15]。神經(jīng)元電活性調(diào)節(jié)后的miRNA132,在神經(jīng)元發(fā)育及神經(jīng)突觸重塑方面中發(fā)揮著重要作用,且癲癇發(fā)作的關(guān)鍵原因是神經(jīng)元電活性興奮異常增高[16]。NF-kB是細(xì)胞中較為重要的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,可調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng),并且在細(xì)胞的生長(zhǎng)過(guò)程和凋亡反應(yīng)起著重要的作用,是免疫反應(yīng)的主要調(diào)節(jié)因子[17]。研究證實(shí)NF-kB在神經(jīng)元變性中起著重要的作用,是通過(guò)直接作用于神經(jīng)元本身的基因表達(dá)和間接調(diào)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞的基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[18]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)miRNA132和NF-kB表達(dá)進(jìn)行干預(yù)后,探討柴胡疏肝湯是否通過(guò)調(diào)控miRNA132、NF-kB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)神經(jīng)元電興奮性產(chǎn)生影響,發(fā)現(xiàn)柴胡疏肝湯可以減少癲癇患者癲癇發(fā)作頻率和持續(xù)時(shí)間,減輕腦組織的損傷及還可以改善癲癇模型的異常[6-11,19-23]。

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