苦皮藤對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞增殖和相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響

陳彥伶　何金英　胡成剛　唐娟　莫雅蜜　朱睿香

【摘 要】 目的：觀察苦皮藤不同提取部位對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（HFLS-RA）增殖的影響，及其對(duì)腫瘤壞死因子-α（TNF-α）誘導(dǎo)的HFLS-RA中細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法：制備苦皮藤水提物（A）及其醇提物（B），對(duì)醇提物根據(jù)極性大小進(jìn)行萃取，得到石油醚部位（C）、二氯甲烷部位（D）、乙酸乙酯部位（E）、正丁醇部位（F）、剩余層部位（G）。噻唑藍(lán)（MTT）法檢測(cè)苦皮藤各部位不同濃度（10、20、40、80、160μg/mL）干預(yù)細(xì)胞24h、48h、72h，對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用;TNF-α（20ng/mL）體外誘導(dǎo)HFLS-RA增殖，加入不同濃度的各個(gè)提取部位（10，40，160μg/mL）作用72h后，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測(cè)細(xì)胞上清中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）、前列腺素E2（PGE2）的含量。結(jié)果：MTT結(jié)果表明，苦皮藤的B、C、D（80，160μg/mL）能顯著抑制HFLS-RA細(xì)胞的增殖（P<0.01），呈時(shí)間和劑量依賴性;A、E、F、G四組對(duì)細(xì)胞的活力均無明顯影響。ELISA結(jié)果顯示，與空白組比較，TNF-α組細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2含量均顯著提高（P<0.01）;與TNF-α組比較，B、C、D（40，160μg/mL）能顯著抑制IL-1β的表達(dá)（P<0.05，P<0.01），具有劑量依賴性;C（40，160μg/mL）能顯著抑制IL-6的表達(dá)（P<0.05），D（160μg/mL）能顯著抑制IL-6的表達(dá)（P<0.05）;C、D（160μg/mL）能顯著降低MMP-3含量（P<0.05）;A、B、D（160μg/mL）可抑制PGE2的表達(dá)（P<0.05），C（40、160μg/mL）能顯著抑制PGE2的表達(dá)（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論：苦皮藤可抑制HFLS-RA增殖及其分泌IL-1、IL-6、MMP-3、PGE2的能力。

【關(guān)鍵詞】 苦皮藤;類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎;類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞;腫瘤細(xì)胞因子-α;細(xì)胞因子

【中圖分類號(hào)】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2020）4-0014-07

Effects of Celastrus Angulatus on Human Rheumatoid Arthritis Fibroblast Synovial Cells

Proliferation and Expression of Related Cytokines

CHEN Yanling HE Jinying HU Chenggang* TANG Juan MO Yami ZHU Ruixiang

Guiyang College of Traditional Chinese Medicine，Guiyang 550025，China

Abstract：Objective To observe the effects of different extracts from Celastrus angulatuson the proliferation of rheumatoid arthritis fibroblast-like synovial cells （HFLS-RA） and their effects on the expression of cytokines in HFLS-RA induced by tumor necrosis factor-α （TNF-α）.Methods The water extract （A） and alcohol extract （B） were prepared，and the alcohol extract was extracted according to polarity to obtain petroleum ether extract （C），dichloromethane extract （D），and ethyl acetate extract （E） ，Butanol extract （F），residual layer extract （G）.The MTT method was used to detect the inhibitory effects of various extraction sites （10、20、40、80and 160 μg/mL） on the cell proliferation for 24h、48hand 72h.HFLS-RA were induced in vitro by using TNF-α （20ng/mL），and treatment with different concentrations （10，40，160 μg/mL） for 72 hours，The enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the contents of interleukin-1β （IL-1β），interleukin-6 （IL-6），matrix metalloproteinases-3 （MMP-3），and Prostaglandin E2 （PGE2） in the cell supernatant.Result The MTT results showed that B，C，and D （80，160 μg/mL） significantly inhibited proliferation of HFLS-RA （P<0.01） in a time-dependent and dose-dependent manner.The four groups A，E，F(xiàn) and G had no significant effect on cell viability.ELISA results showed that compared with the blank group，the levels of IL-1β，IL-6，MMP-3，and PGE2 in the supernatant of the TNF-α group were significantly increased （P<0.01）; Compared with the TNF-α group，B，C ，D （40，160 μg/mL） can significantly inhibit the expression of IL-1β （P<0.05，P<0.01），which is dose-dependent; C （40，160 μg/mL） can significantly inhibit the expression of IL-6 （P<0.05），D （160 μg/mL） can significantly inhibit the expression of IL-6 （P<0.05）; C and D （160 μg/mL） significantly reduced the content of MMP-3 （P<0.05）; A，B，D （160μg/mL ） can inhibit PGE2 expression （P<0.05），C （40，160 μg/mL） can significantly inhibit the expression of PGE2 （P<0.05，P<0.01）. Conclusion C.angulatus can inhibit HFLS-RA proliferation and its ability to secrete IL-1，IL-6，MMP-3，and PGE2.

Key words：Celastrus Angulatus; Rheumatoid Arthritis; Human Fibroblast-like Synoviocyte Rheumatoid Arthritis; Tumornecrosisfactor-α; Cytokines

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一種以關(guān)節(jié)滑膜炎及自身抗體分泌為特點(diǎn)的慢性自身免疫性疾病[1]，其病因及發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜。研究認(rèn)為，炎癥、滑膜增生及骨破壞為RA主要的病理特征，治療時(shí)可從抑制炎癥反應(yīng)、抑制滑膜細(xì)胞增殖、抑制軟骨損傷和骨侵蝕幾方面入手[2-3]?；こ衫w維細(xì)胞（Fibroblast-Likessynoviocytes，F(xiàn)LS）在RA發(fā)病中起關(guān)鍵作用，在病理狀態(tài)下FLS表現(xiàn)為異常增殖及凋亡不足，能分泌高水平促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-17，還能分泌化學(xué)趨化因子、基質(zhì)蛋白降解酶等[4]。

苦皮藤Celastrus angulatus Maxim.為衛(wèi)矛科南蛇藤屬苦皮藤的干燥根，具有祛風(fēng)除濕、活血通經(jīng)、解毒殺蟲的功效，可治療風(fēng)濕痹痛、骨折傷痛、瘡瘍潰爛等病[5-6]。苦皮藤中化學(xué)成分豐富，含有倍半萜類、三萜類、二萜類、黃酮類、生物堿類、揮發(fā)油等成分[7]。苦皮藤具有殺蟲、殺菌、抗癌等活性，其中殺蟲活性研究較為深入，已有成熟的殺蟲制劑[8]。但關(guān)于苦皮藤抗風(fēng)濕作用的研究在國(guó)內(nèi)外尚無具體報(bào)道。根據(jù)文獻(xiàn)記載[9]，苦皮藤配伍藤蘿根、白金條泡酒服用可治療風(fēng)濕、勞傷、關(guān)節(jié)疼痛。由此，為驗(yàn)證苦皮藤的抗風(fēng)濕作用，尋找其有效成分及其作用機(jī)制，可對(duì)苦皮藤進(jìn)行深入研究。實(shí)驗(yàn)以TNF-α誘導(dǎo)的人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維滑膜細(xì)胞模型，研究苦皮藤不同提取部位的抗風(fēng)濕作用，為篩選苦皮藤抗風(fēng)濕有效部位及研究其作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株HFLS-RA類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞（貨號(hào)：JNO-02001），購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥物制備 稱取8mg藥物，充分溶于1mL DMSO中，制成8mg/mL的母液，用0.22μm的微孔濾膜過濾，4℃條件下保存。

1.3 試劑 胰酶（+EDTA，批號(hào)：J180035，Hyclone）;南美胎牛血清（批號(hào)：JC63468，CLARK）;DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)：WH01111903XP，Procell）;雙抗（批號(hào)：J180034，Hyclone）;MTT（批號(hào)：EZ2811A179，Biofroxx）;二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)：SHBJ7919，Sigma）;TNF-α（貨號(hào)：300-01A-10，Peprotech）;IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2檢測(cè)試劑盒均購自上海茁彩生物科技有限公司。

1.4 儀器 倒置生物顯微鏡（AE31，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）;酶標(biāo)儀（SpectraMAX Plus384，Molecular Devices）;壓力蒸汽滅菌器（SYQ-DSX-280B，上海宜川儀表廠）;CO2培養(yǎng)箱（MCO-15AC，三洋電機(jī)國(guó)際貿(mào)易有限公司）;臺(tái)式低速離心機(jī)（TDZ4-WS，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 MTT法檢測(cè)苦皮藤對(duì)HFLS-RA增殖活性的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HFLS-RA細(xì)胞，PBS洗滌，胰蛋白酶消化后收集，1000rpm離心5min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度3.5×104/mL，200μL/孔接種于96孔板中，每種藥物分別設(shè)置空白對(duì)照組、160、80、40、20、10μg/mL組，每組5重復(fù)，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，加入對(duì)應(yīng)藥物。待藥物分別作用24、48、72h后，吸棄上清，每孔加入200μL終濃度為0.5mg/mL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h;吸棄液體，每孔加入150μL DMSO，避光振蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)定其在490nm處的吸光度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞的生存率。

2.2 ELISA法檢測(cè)TNF-α誘導(dǎo)的HFLS-RA中相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HFLS-RA細(xì)胞，PBS洗滌，胰蛋白酶消化收集，1000rpm離心5min，吸除上清液，加入適量培養(yǎng)基使其成為單細(xì)胞懸液，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度7×104/mL，2mL/孔接種于24孔板中，24h細(xì)胞貼壁后棄去上清液，設(shè)置空白組、模型組、樣品組，每組3重復(fù)。空白組不加藥物及TNF-α，模型組用不完全培養(yǎng)基培養(yǎng)預(yù)處理1h后，加入1mL 20ng/mL的TNF-α，樣品組分別加入質(zhì)量濃度為10、40、160μg/mL的7種不同藥物1mL，預(yù)處理1h后，再加入1mL TNF-α，37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)，72h后收集上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2的含量。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布以（x[TX-*3]±s）表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用最小顯著差（LSD）法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 苦皮藤對(duì)HFLS-RA增殖的影響 采用MTT法測(cè)定OD值，通過公式計(jì)算細(xì)胞活力可以看出，TNF-α誘導(dǎo)組細(xì)胞活力最高，可以促進(jìn)HFLS-RA增殖。結(jié)果表明，隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組OD值降低，抑制率逐步升高，呈時(shí)間和劑量依賴性。藥物干預(yù)24h，與空白組比較，A、C組（10μg/mL），B、E組（10，20，40μg/mL）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。A、E、F、G組對(duì)細(xì)胞增殖無明顯抑制作用，且在較低濃度時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖有促進(jìn)作用;C、D組在高劑量下對(duì)細(xì)胞增殖有一定抑制作用（見圖2）。

藥物干預(yù)48h，與空白組比較，A、B、G組（10，20μg/mL），F(xiàn)組（10，20，40μg/mL）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。C、D組可明顯抑制HFLS-RA的增殖（見圖3）。

藥物干預(yù)72h，與空白組比較，A、E組（10μg/mL），F(xiàn)組（10，20，40μg/mL），G組（10，20μg/mL）差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;其余各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，P<0.01）。各組隨著給藥濃度增加，對(duì)細(xì)胞增殖均出現(xiàn)不同程度的抑制作用，并呈劑量依賴性，其中C、D組（160μg/mL）對(duì)HFLS-RA的增殖有明顯抑制作用（見圖4）。石油醚部位作用24h、48h、72h的IC50值分別為156.38、75.044、61.347μg/mL，二氯甲烷部位作用48h、72h的IC50值分別為94.571、63.513μg/mL，其余部位無法獲取IC50。在ELISA實(shí)驗(yàn)中采用高、中、低（160、40、10μg/mL）3個(gè)劑量來考察苦皮藤各個(gè)部位對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子的影響。

3.2 苦皮藤對(duì)HFLS-RA分泌細(xì)胞因子的影響

3.2.1 苦皮藤對(duì)IL-1β的影響 由表1可知，與空白組比較，TNF-α組細(xì)胞上清中IL-1β含量極顯著升高（P<0.01）。與TNF-α組比較，B、C、D組（40，160μg/mL）中IL-1β含量均明顯降低（P<0.05，P<0.01），且各組對(duì)IL-1β的作用呈一定的濃度依賴關(guān)系;E組（160μg/mL）中IL-1β含量極顯著降低（P<0.01）。

3.2.2 苦皮藤對(duì)IL-6的影響 由表2可知，與空白組比較，TNF-α組細(xì)胞上清中IL-6含量極顯著升高（P<0.01）。與TNF-α組比較，C組（40，160μg/mL）中IL-6含量均明顯降低（P<0.05），呈一定的濃度依賴關(guān)系;D組（160μg/mL）中IL-6含量顯著降低（P<0.05）。

3.2.3 苦皮藤對(duì)MMP-3的影響 由表3可知，與空白組比較，TNF-α組細(xì)胞上清中MMP-3含量極顯著升高（P<0.01）。與TNF-α組比較，C、D組（160μg/mL）中MMP-3含量均明顯降低（P<0.05）。

3.2.4 苦皮藤對(duì)PGE2的影響 由表4可知，與空白組比較，TNF-α組細(xì)胞上清中PGE2含量極顯著升高（P<0.01）。與TNF-α組比較，C組（40，160μg/mL）中PGE2含量顯著降低（P<0.05，P<0.01），呈一定的濃度依賴關(guān)系;A、B、D組（160μg/mL）中PGE2含量均明顯降低（P<0.05，P<0.01）。

4 討論

研究認(rèn)為，滑膜成纖維細(xì)胞（FLS）在炎癥反應(yīng)的發(fā)展和關(guān)節(jié)破壞過程中起著重要作用，能直接破壞軟骨和骨組織，是治療RA的重要靶點(diǎn)[10]。FLS可合成并分泌腫瘤細(xì)胞因子、白細(xì)胞介素、干擾素、趨化因子、集落刺激因子、生長(zhǎng)因子等多種因子，如IL-6、IL-8、PGE2、膠原酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等，這些炎癥介質(zhì)均參與滑膜炎癥反應(yīng)并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞[11]。本實(shí)驗(yàn)通過研究苦皮藤對(duì)HFLS-RA細(xì)胞增殖及分泌炎癥因子的抑制能力，初步分析苦皮藤抗風(fēng)濕有效部位及可能機(jī)制。

MTT法檢測(cè)苦皮藤對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響實(shí)驗(yàn)表明，隨著時(shí)間延長(zhǎng)及給藥濃度增加，苦皮藤的水提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及剩余層部位對(duì)細(xì)胞的增殖均無明顯抑制作用;石油醚部位與二氯甲烷部位對(duì)細(xì)胞的抑制率逐步升高，呈時(shí)間和劑量依賴性，當(dāng)給藥濃度為160μg/mL，干預(yù)72h時(shí)抑制率最高，抑制效果最佳，抑制率分別達(dá)到90.701%、91.318%。ELISA法檢測(cè)苦皮藤對(duì)細(xì)胞分泌炎癥因子含量的影響實(shí)驗(yàn)表明，TNF-α可誘導(dǎo)HFLS-RA分泌高水平的IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2，體現(xiàn)其促炎功能。石油醚部位及二氯甲烷部位（160μg/mL）能顯著抑制相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)（P<0.05，P<0.01），提示這兩個(gè)部位可能通過抑制HFLS-RA分泌細(xì)胞因子，從而減少炎癥因子的產(chǎn)生與釋放;其余部位均沒有明顯的抑制作用。綜上，苦皮藤中具有抑制HFLS-RA增殖及其分泌炎癥因子能力的有效成分集中在石油醚部位及二氯甲烷部位。

苦皮藤中富含萜類成分，主要集中在小極性部位[12]。研究表明，萜類成分具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等廣泛的生物活性[13-14]。其中倍半萜類化合物可通過抑制NF-κB，MAPKs和STAT等信號(hào)通路相關(guān)因子的活化，下調(diào)TNF-α、PGE2、NO、IL-1、IL-6、IL-8等炎性因子的蛋白表達(dá)，實(shí)現(xiàn)抗炎作用[15]。由此推測(cè)苦皮藤抗風(fēng)濕作用可能與萜類成分相關(guān)，尚待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，苦皮藤的水提物、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及剩余層部位對(duì)細(xì)胞增殖及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)均無明顯抑制作用;石油醚部位與二氯甲烷部位可抑制HFLS-RA的異常增殖，并能夠顯著降低IL-1β、IL-6、MMP-3、PGE2的表達(dá)水平，為下一步探究苦皮藤抗風(fēng)濕有效成分及其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

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