卵巢切除小鼠冠狀動(dòng)脈封堵誘導(dǎo)心肌梗塞模型的建立與評(píng)估*

王 菲 胡 威 張 鵬 王曉武 師長(zhǎng)宏 劉宏斌

(1. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院心血管內(nèi)科，蘭州 730050)(2. 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管外科，西安 710032)(3. 空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，西安 710032)(4. 中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四○醫(yī)院普通外科，蘭州 730050)

心肌梗塞(myocardial infarction，MI)是一種常見(jiàn)的心血管疾病。流行病學(xué)調(diào)查顯示，絕經(jīng)后女性MI的發(fā)病率顯著上升，且與同齡男性相比，絕經(jīng)后女性在缺血性心臟病中的纖維化更為嚴(yán)重[1]。絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素的大量減少導(dǎo)致心臟保護(hù)功能的降低，心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的增加，但在這種情況下單純雌激素治療無(wú)效，提示可能與雌激素變化有關(guān)，但具體機(jī)制不明確[2]。因此，建立相應(yīng)的動(dòng)物模型對(duì)于絕經(jīng)期婦女的心臟保護(hù)研究具有重要意義[3]。

MI引起的炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡在疾病進(jìn)程的發(fā)展和預(yù)后中起重要作用。已證實(shí)炎癥和細(xì)胞凋亡對(duì)于MI后心室重構(gòu)至關(guān)重要[4]。因此，在本研究中，我們將雌性C57BL/6 J小鼠卵巢切除后，封堵小鼠的左冠狀動(dòng)脈前降支，制備絕經(jīng)后女性MI的動(dòng)物模型。通過(guò)觀察其心臟功能、心肌梗塞面積和心肌纖維化程度，檢測(cè)凋亡率、TNF-α和IL-10水平的變化，用于評(píng)估切除卵巢的雌性小鼠發(fā)生MI的特征。

1 材料和方法

1.1 試劑和動(dòng)物

TUNEL測(cè)定試劑盒和DAPI均購(gòu)自Roche公司，BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Merck Millipore公司，TGF-β購(gòu)自Abcam公司，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白介素10(IL-10)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自武漢Elabscience公司。7～8周齡雌性C57BL/6 J小鼠購(gòu)自第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(陜)2019-001。將小鼠隨機(jī)分為3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組20只，分別為對(duì)照組、卵巢切除(OVX)組和卵巢切除聯(lián)合心肌梗塞(OVX+MI)組。

1.2 卵巢切除術(shù)和心肌梗死

用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，進(jìn)行雙側(cè)卵巢切除術(shù)獲得OVX模型小鼠[3]。在雙側(cè)卵巢切除后2 周，使用6-0絲線縫合法將小鼠的左冠狀動(dòng)脈主降支封堵，在小鼠中誘發(fā)MI[5]，獲得OVX+MI小鼠。具體方法是用6-0絲線在距左冠狀動(dòng)脈主降支2～3 mm處繞活結(jié)，然后將心臟迅速放回胸腔，手動(dòng)排空空氣并關(guān)閉皮膚?；罱Y(jié)縫合線的內(nèi)部頭端應(yīng)盡可能短，縫合線的另一端約0.8 cm長(zhǎng)，并留在胸腔外側(cè)。缺血30 min后，平滑輕柔地拉動(dòng)活結(jié)縫合線的長(zhǎng)端來(lái)釋放活結(jié)，直到感覺(jué)到釋放的感覺(jué)，這時(shí)心肌開(kāi)始重新灌注。對(duì)照組動(dòng)物在不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈的情況下進(jìn)行了相同的手術(shù)。

1.3 超聲心動(dòng)圖測(cè)量和血液動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)

在MI手術(shù)前3 d(基線)和術(shù)后4 周，使用Vevo 770超聲成像系統(tǒng)對(duì)心臟功能進(jìn)行無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)。超聲心動(dòng)圖評(píng)估是在吸入異氟烷(1%～2%)麻醉下進(jìn)行，同時(shí)監(jiān)測(cè)心率(≥500次/min)和體溫(37 ℃±1 ℃)。使用高分辨率體內(nèi)成像系統(tǒng)進(jìn)行二維超聲心動(dòng)圖測(cè)量，記錄舒張期和收縮期的心內(nèi)膜體積，計(jì)算左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左心室短軸縮短率(LVFS)[6]。

在心肌梗塞后第4周通過(guò)微型化的壓力容積導(dǎo)管術(shù)進(jìn)行了血流動(dòng)力學(xué)分析。將帶尖頭的導(dǎo)管插入小鼠右頸動(dòng)脈，并在麻醉小鼠中逆行至左心室。觀察波形-體積環(huán)的形態(tài)，記錄左心室內(nèi)壓最大上升速率(dp/dtmax)[7]。所有分析均使用Lab Chart 7軟件進(jìn)行。

1.4 形態(tài)分析

小鼠心肌梗塞后，取出心臟，使用30 mmol/L KCl將其停在舒張期，然后用10%福爾馬林緩沖液灌注固定，使用Masson的三色染色切片測(cè)量梗死面積[8](即梗塞疤痕占左心室周長(zhǎng)的百分比)。使用心肌中部計(jì)算梗塞厚度，取沿梗塞壁的3個(gè)等距測(cè)量結(jié)果的平均值。分別用Masson 三色染色和HE染色橫截面(4 μm厚)，使用BIOQUANT圖像分析軟件測(cè)量纖維化程度，并計(jì)算出左心室壁區(qū)域瘢痕組織大小的比例[3]。

1.5 免疫細(xì)胞化學(xué)和TUNEL測(cè)定

使用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行福爾馬林固定和石蠟包埋的心臟切片的免疫組織化學(xué)染色(IHC)。將固定的成纖維細(xì)胞與一抗TGF-β1(1∶200)在4 ℃下孵育過(guò)夜，然后與封閉溶液中與Cy3偶聯(lián)的山羊抗兔IgG(1∶100稀釋液)孵育。將TUNEL檢測(cè)溶液添加到切片中，并將切片在37 ℃下孵育2 h，用DAPI進(jìn)行核染色。在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察切片，并從隨機(jī)選擇的10個(gè)視野中計(jì)數(shù)細(xì)胞以確定細(xì)胞凋亡指數(shù)，通過(guò)TUNEL法分析心肌細(xì)胞凋亡率。

1.6 促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-10的測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9]的方法，使用夾心ELISA試劑盒評(píng)估不同實(shí)驗(yàn)組小鼠血清中TNF-α和IL-10的水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。通過(guò)ANOVA和Bonferroni校正對(duì)差異進(jìn)行t檢驗(yàn)。所有統(tǒng)計(jì)測(cè)試均使用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 卵巢切除術(shù)對(duì)MI雌性小鼠心臟功能的影響

將小鼠切除卵巢后2 周進(jìn)行MI手術(shù)，此后4 周進(jìn)行M型超聲檢查和血流動(dòng)力學(xué)測(cè)試，結(jié)果見(jiàn)圖1。OVX組的LVEF值顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，而OVX + MI組的LVEF值比OVX組更低(P<0.05；圖1B)。不同組間的LVFS值也有相似的趨勢(shì)(圖1C)。血流動(dòng)力學(xué)分析顯示OVX組或OVX+MI組降低了dP/dt最大值(P<0.01；圖1D)。上述結(jié)果表明OVX可以降低小鼠的心臟功能，而OVX+MI可以進(jìn)一步加重心臟功能受損。

圖1 卵巢切除術(shù)對(duì)MI雌性小鼠心臟功能的影響注：與對(duì)照組相比，*P <0.05和**P <0.01；與OVX組相比,#P <0.05和##P<0.01Fig.1 Effect of ovariectomy on heart function of female mice with MI treatmentNote:Compared with the control group, *P<0.05 and **P <0.01; Compared with OVX group, #P <0.05 and ##P<0.01

2.2 卵巢切除術(shù)對(duì)MI雌性小鼠心臟形態(tài)和纖維化的影響

與對(duì)照組相比，OVX組的心臟組織和心室壁較薄，心肌纖維化程度較高；Masson的三色染色顯示OVX+MI可顯著減少心臟組織和心室壁的厚度，增加心肌纖維化程度(與OVX組相比，P<0.01)。

心肌組織梗塞邊界區(qū)的形態(tài)結(jié)構(gòu)通過(guò)HE染色進(jìn)行了分析，OVX組心肌組織顯著松散，少數(shù)細(xì)胞排列紊亂，而OVX + MI組的心肌梗塞邊界區(qū)的組織明顯松弛，且細(xì)胞排列紊亂加劇(圖2A)，梗塞區(qū)的心室壁較薄，纖維化程度較高(圖2B、C)。與OVX組相比，OVX + MI組可引起心肌組織疏松和紊亂，水腫更明顯。

圖2 卵巢切除的雌性小鼠心肌梗塞的心臟纖維化和形態(tài)變化注：與對(duì)照組相比，**P <0.01；與OVX組相比，##P<0.01Fig.2 Cardiac fibrosis and morphological changes of ovariectomized female mice with myocardial infarctionNote: Compared with the control group, **P<0.01; Compared with OVX group, ##P<0.01

2.3 免疫熒光和TUNEL的結(jié)果

免疫熒光(IFC)染色結(jié)果如圖3所示，通過(guò)TUNEL染色原位檢測(cè)凋亡性心肌細(xì)胞的代表性照片，紅色熒光顯示TGF-β1表達(dá)，綠色熒光顯示TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞核，藍(lán)色熒光顯示總的心肌細(xì)胞核。由圖4可知，OVX組可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡率增加和TGF-β1表達(dá)，與對(duì)照組相比有顯著差別(P<0.05 和P<0.01)；OVX+MI組可進(jìn)一步增加心肌組織梗塞邊界區(qū)的凋亡率和TGF-β1表達(dá)，與OVX組相比，P<0.05有顯著差別。

圖3 卵巢切除的雌性心肌梗死小鼠心肌細(xì)胞TUNEL染色和TGF-β1表達(dá)(Bar=100 μm)Fig.3 TUNEL staining and TGF-β1 expression in cardiomyocytes of ovariectomized female mice with myocardial infarction(Bar=100 μm)

圖4 卵巢切除的雌性心肌梗塞小鼠心肌細(xì)胞凋亡比例和TGF-β1熒光強(qiáng)度注：對(duì)照組相比，*P <0.05和**P<0.01；與OVX組相比，#P <0.05Fig.4 Apoptosis ratio and TGF-β1 fluorescence intensity of ovariectomized female mice with myocardial infarctionNote: A. Compared with the control group, *P<0.05 and **P<0.01; Compared with OVX group, #P <0.05

2.4 血清TNF-α和IL-10水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，OVX+MI組小鼠血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α和IL-10水平顯著增加(圖5)。

圖5 卵巢切除的雌性心肌梗塞小鼠血清中炎癥相關(guān)因子水平的變化注： 與OVX組相比，**P <0.01Fig.5 The inflammatory cytokines levels in serum of ovariectomized female mice with myocardial infarctionNote:Compared with OVX group,**P<0.01

3 討論

絕經(jīng)后婦女發(fā)生MI的主要特征包括心臟功能受損、心肌纖維化和炎癥的發(fā)生，單純使用雌鼠去卵巢誘導(dǎo)的相關(guān)變化非常有限[3]。心肌纖維化是導(dǎo)致MI后心臟功能障礙的主要組織學(xué)標(biāo)志物。MI后的心室重構(gòu)包括心肌細(xì)胞凋亡、炎癥、肥大以及心肌基質(zhì)膠原纖維的合成和降解[10]。Roy等[11]利用芯片技術(shù)分析了心肌梗塞后第2天和第7天，發(fā)現(xiàn)大鼠心臟組織的功能基因改變主要與炎癥，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)有關(guān)。Kajstura等[12]發(fā)現(xiàn)，心肌細(xì)胞凋亡在MI的發(fā)生中起重要作用。凋亡是心肌梗塞大小的決定因素，并且在梗塞邊界區(qū)域的心肌細(xì)胞凋亡與梗塞大小有關(guān)。心肌細(xì)胞的凋亡會(huì)增加梗塞面積，引起心肌的進(jìn)行性缺失，擴(kuò)大梗塞面積，使心室壁變薄，使心室擴(kuò)張，并導(dǎo)致心臟逐漸重塑，發(fā)展為心力衰竭。本研究使用超聲心動(dòng)圖和壓力容積導(dǎo)管測(cè)量顯示，切除卵巢的雌性小鼠的心臟功能顯著降低，IFC顯示這些小鼠的心肌纖維化和心肌細(xì)胞凋亡顯著增加，這些結(jié)果表明，雌激素缺乏會(huì)加重MI小鼠的心臟損傷。

心肌梗塞治療后，壞死細(xì)胞誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子觸發(fā)炎癥反應(yīng)，引起心肌纖維化，心室重構(gòu)，心臟功能障礙，最終導(dǎo)致心力衰竭。炎癥可以通過(guò)信號(hào)途徑(如通過(guò)TNF-α發(fā)生的信號(hào)途徑)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡的反饋會(huì)影響炎癥的嚴(yán)重程度，這兩個(gè)因素共同影響梗塞面積和心功能恢復(fù)[13]。因此，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡應(yīng)該是心梗后心室重構(gòu)和心臟功能障礙的重要原因。本研究中，卵巢切除的小鼠可以觀察到明顯的凋亡和炎癥，而卵巢切除的MI小鼠則顯示出相對(duì)較高的凋亡率和炎癥反應(yīng)，炎癥相關(guān)細(xì)胞因子如TNF-α和IL-10的呈現(xiàn)出高水平表達(dá)，上述特征與絕經(jīng)期婦女發(fā)生MI后炎癥相關(guān)因子的變化相一致。

綜上所述，本研究將雌性小鼠卵巢切除后進(jìn)行左冠狀動(dòng)脈前降支封堵誘導(dǎo)MI的發(fā)生，成功制備了模擬絕經(jīng)后女性發(fā)生MI的動(dòng)物模型。超聲心動(dòng)圖和血流動(dòng)力學(xué)檢查表明卵巢切除聯(lián)合心肌梗塞可加重心臟功能受損，形態(tài)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)該模型小鼠心室壁變薄，心室擴(kuò)張和心臟重塑，TNF-α和IL-10表達(dá)升高，與絕經(jīng)期婦女發(fā)生MI后癥狀相一致，從而為絕經(jīng)期婦女的心臟保護(hù)研究提供了良好的動(dòng)物模型。