光電結(jié)合檢測(cè)大鼠原代神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度方法的建立*

劉麗娜 許 晴 魏 華 李 華 薛奮勤 薛 冰

(首都醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

神經(jīng)元內(nèi)鈣離子的作用貫穿了其生命周期的整個(gè)生命過(guò)程，如轉(zhuǎn)錄、分化、信號(hào)的傳導(dǎo)及遞質(zhì)的釋放和凋亡等等。體內(nèi)鈣離子發(fā)生變化會(huì)導(dǎo)致很多疾病，而很多應(yīng)激也會(huì)首先導(dǎo)致鈣相關(guān)蛋白發(fā)生改變[1]。顯微成像技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用在科學(xué)研究中，神經(jīng)熒光染料結(jié)合成像技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用到檢測(cè)各種活細(xì)胞胞內(nèi)的鈣離子的變化[2-3]。在神經(jīng)元中，鈣離子通過(guò)電壓和配體門控通道產(chǎn)生的胞內(nèi)鈣離子變化最明顯。另外，細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存的鈣釋放也會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子升高。神經(jīng)元處于靜息狀態(tài)時(shí)，胞內(nèi)鈣離子濃度為100～200 nmol/L，在神經(jīng)元受到刺激后，膜去極化，鈣離子通道打開，鈣離子內(nèi)流，胞內(nèi)鈣離子迅速升高到原來(lái)的10～100倍。我們通過(guò)搭建轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)結(jié)合電刺激，并對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞中的鈣離子進(jìn)行成像。采用孵育染料使其進(jìn)入細(xì)胞。先觀察細(xì)胞內(nèi)自發(fā)的鈣離子變化，然后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行電刺激并記錄到了胞內(nèi)鈣離子刺激前后的變化。電刺激是神經(jīng)元功能研究中常見的刺激方式，可以通過(guò)改變刺激強(qiáng)度和刺激頻率來(lái)模擬生理和病理狀況。所以，結(jié)合成像系統(tǒng)來(lái)記錄神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子濃度意義重大并為進(jìn)一步研究神經(jīng)元的功能和神經(jīng)環(huán)路奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Neurobasal培養(yǎng)基、B27、青鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公司； D-Hanks液購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；L-glutamic acid、L-glutamine、β-mercaptoethanol、Sodium pyruvate、多聚賴氨酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；fluo-4 AM購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific。

1.2 原代神經(jīng)元的制備

新生24 h以內(nèi)的SD大鼠, 低溫麻醉，75%酒精浸泡消毒5 min后斷頭，移入放有無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中(濾紙用于吸去多余血水)。無(wú)菌條件下，將全腦取出，放入盛有冰浴預(yù)冷的D-Hanks(不含鈣、鎂離子和酚紅)的培養(yǎng)皿中。小心取出大腦皮層，體視顯微鏡下剝離腦膜。將皮層組織剪成0.5～1 mm3的組織塊，用尖頭拋光的Pasteur滴管輕輕吹打，40 μm細(xì)胞篩過(guò)濾除去組織碎片，細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5～10 min，加神經(jīng)元培養(yǎng)液重懸細(xì)胞, 以(1.5～2.5)×105個(gè)/mL接種于處理過(guò)的培養(yǎng)皿(接種前一天，用12.5 μg/mL Ploy-D-lysine處理細(xì)胞培養(yǎng)皿，室溫過(guò)夜后吸出液體，用無(wú)菌三蒸水洗三遍后，置超凈臺(tái)中晾干備用)中，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每隔3 d換一次神經(jīng)元培養(yǎng)液，7～10 d后可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 刺激電極的制作

準(zhǔn)備2根1 m左右的導(dǎo)線(長(zhǎng)度取決于刺激器到顯微鏡鏡頭的距離)，5 cm鎢絲1根，絕緣膠布，絕緣塑料底。根據(jù)培養(yǎng)皿的直徑和深度，把鎢絲彎成2個(gè)幾字形，用絕緣膠布把鎢絲固定在絕緣塑料底上。把鎢絲的兩端和導(dǎo)線的兩端連接在一起，導(dǎo)線另外兩端連接到刺激器的隔離器的正負(fù)極上。

1.4 轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡系統(tǒng)的配置

該系統(tǒng)由高速雙轉(zhuǎn)盤共聚焦掃描單元、激光器、超高靈敏度EMCCD、全自動(dòng)倒置熒光顯微鏡、X-Y閉環(huán)控制電動(dòng)載物臺(tái)、壓電陶瓷Z軸、精確同步控制器、圖像工作站和相關(guān)軟件組成?？焖俟簿劢钩上袷峭ㄟ^(guò)將共聚焦雙轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)安裝到倒置顯微鏡的熒光端口上獲得的。轉(zhuǎn)盤是由兩個(gè)同軸排列的圓盤組成，每個(gè)圓盤有大約20 000個(gè)針孔，在上方圓盤的針孔上裝有微透鏡，與下方圓盤的針孔一一對(duì)應(yīng)，使得入射光直接聚焦到下圓盤的針孔。固體激光器提供激發(fā)光，二向色鏡通過(guò)旋轉(zhuǎn)盤中的針孔陣列(直徑50 μm)投射激發(fā)光，該旋轉(zhuǎn)盤以1 kHz的速度旋轉(zhuǎn)通過(guò)物鏡(60×/1.35)到樣品上。圖像傳感器為電子倍增電荷耦合裝置(electron-multiplying charged-coupled device，EMCCD)相機(jī)，像素為512×512，鈣離子熒光指示劑fluo-4激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm。曝光時(shí)間為200 ms，頻率為1 Hz時(shí)獲取圖像。

1.5 鈣離子濃度的檢測(cè)

Fluo-4 AM用Cytobuffer稀釋1000倍，終濃度為1 μmol/L，用37 ℃ Hanks液潤(rùn)洗神經(jīng)元2次，加入稀釋后的fluo-4AM，37 ℃孵育30 min，室溫下再孵育30 min。然后，將細(xì)胞培養(yǎng)皿放在XY-Piezo Z Stages 顯微鏡用電動(dòng)載物臺(tái)上，采用EMCCD相機(jī)，通過(guò)復(fù)消色差物鏡(1.35NA)60×油浸鏡頭成像。488 nm激光，在大于510 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)發(fā)射熒光。

1.6 鈣離子分析

使用圖像分析軟件ImageJ分析細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。在ImageJ中打開圖像文件(.tiff文件)，單擊選擇工具，選擇感興趣區(qū)域(ROI)。先選擇背景，再選擇細(xì)胞。打開“analyze>tools> ROI manager”，單擊“add”?？梢栽趩蝹€(gè)圖像上選擇多個(gè)ROI以進(jìn)行測(cè)量。重復(fù)前面的步驟，直到所有ROI已添加到ROI Manager。單擊“more>multi measure”，選擇“measure all slices”，然后單擊“ok”以獲取fluo-4的平均熒光強(qiáng)度表，然后保存文件。

2 結(jié)果

2.1 原代神經(jīng)元胞內(nèi)自發(fā)鈣離子變化

顯微鏡下的神經(jīng)元形態(tài)清晰，結(jié)果見圖1。下圖是神經(jīng)元圖像按空間重建后，選取神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子隨著空間的變化。不同的神經(jīng)元自發(fā)鈣離子變化的出現(xiàn)不同，在8～10 min內(nèi)，約10%的神經(jīng)元出現(xiàn)自發(fā)性鈣離子升高。自發(fā)性鈣離子升高可能跟一種電壓型鉀離子通道相關(guān)[4]。

圖1 原代神經(jīng)元胞內(nèi)自發(fā)鈣離子變化注：A.神經(jīng)元(白色箭頭處)熒光圖像；B.神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子的變化Fig.1 Spontaneous intracellular calciumchanges in primary neuronsNote：A. Fluorescent image of neurons (white arrows)；B. Intracellular calcium changes in neurons

2.2 原代神經(jīng)元電刺激后細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)鈣離子變化

原代神經(jīng)元受到電刺激后胞內(nèi)鈣離子變化見圖2，電刺激誘發(fā)神經(jīng)元，胞內(nèi)鈣震蕩。一般情況下，神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子會(huì)隨著電刺激開始迅速上升，但也有個(gè)別神經(jīng)元如神經(jīng)元2(圖2B、C)，神經(jīng)元胞內(nèi)鈣離子出現(xiàn)在電刺激的后期。從圖2C還可以看出不同的神經(jīng)元鈣離子升高的頻率和振幅也均有不同，可能跟神經(jīng)元的類型不同有關(guān)[5]。刺激結(jié)束后，胞內(nèi)鈣離子還是有周期性升高，但升高的幅度減小。

圖2 原代神經(jīng)元受到電刺激后胞內(nèi)鈣離子變化注：A.實(shí)驗(yàn)用電刺激電極(白色箭頭所指為幾字形的刺激電極)和分析所選的兩個(gè)神經(jīng)元；B.給予電刺激前后，神經(jīng)元1和2在不同的時(shí)間點(diǎn)所得熒光圖像；C.神經(jīng)元受到電刺激后胞內(nèi)鈣離子隨著時(shí)間的變化圖Fig.2 Changes in intracellular calcium after theneurons were electrically stimulatedNote:A.The stimulus electrodes (white arrows refer to the stimulus electrodes) and the two selected neurons for analysis；B. Fluorescent images obtain for neurons 1 and 2 at different points in time, before and after triggering；C. Intracellular calcium of neurons changes after stimulated with time

3 討論

普通共聚焦顯微鏡因分辨率低和光毒性，不適合快速的活細(xì)胞成像[6-7]，而轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡有1 000個(gè)小孔同時(shí)掃描樣本，速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單點(diǎn)掃描的普通共聚焦顯微鏡，超高速、高分辨率成像使其成為研究細(xì)胞動(dòng)態(tài)過(guò)程的極佳工具。在神經(jīng)元的研究中，轉(zhuǎn)盤共聚焦已用于監(jiān)測(cè)受體的運(yùn)動(dòng)和作用以及細(xì)胞的遷移[8-9]。

研究神經(jīng)元內(nèi)的鈣離子變化需要良好的空間分辨率和高幀速率(10～100幀/s)和高信噪比的成像系統(tǒng)。盡可能降低染料濃度進(jìn)而減小或消除染料的副作用[10]，激光的激發(fā)強(qiáng)度也應(yīng)保持最小，以確保神經(jīng)元保持健康并顯示出與生理相關(guān)的行為[11-12]。

系統(tǒng)配備的圖像傳感器為EMCCD，像元尺寸為16 μm×16 μm, 有效感光面積大，背照式感光使其量子效率達(dá)到90%以上，因此適合弱光信號(hào)的采集。制冷溫度為-80 ℃，因此暗電流幾乎可以忽略不計(jì)，噪聲低，信噪比高，可以減少曝光時(shí)間或激光強(qiáng)度，使得光漂白性低，適合長(zhǎng)時(shí)間采集。全幅512×512采集速度為56幀/s，采集速度可以達(dá)到ms級(jí)。綜上所述，EMCCD適合長(zhǎng)時(shí)間快速的弱光信號(hào)的采集。在本次實(shí)驗(yàn)中記錄到的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)清晰可見，給予電刺激后電刺激后會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞胞體鈣離子的可逆增加。

靈敏度除了受到相機(jī)的影響，還受到顯微鏡光學(xué)、機(jī)械或電子噪聲的限制。本研究使用奧林巴斯研究性倒置活細(xì)胞顯微鏡，其高性能二向色鏡、復(fù)眼透鏡系統(tǒng)能夠提供均勻亮度的熒光圖像，以及匹配的復(fù)消色差物鏡等光學(xué)器件，并配備有Z軸補(bǔ)償系統(tǒng)，連續(xù)自動(dòng)對(duì)焦模式使觀察平面保持不變，還能避免由于溫度改變或添加試劑導(dǎo)致焦點(diǎn)漂移，使其能夠在長(zhǎng)時(shí)間的成像過(guò)程中保持連續(xù)的聚焦，非常適合測(cè)量對(duì)焦點(diǎn)要求高的活細(xì)胞成像。

現(xiàn)在的研究中，使神經(jīng)元興奮的除了特異的激動(dòng)劑之外主要方式有高鉀溶液和電刺激等[13]，它們的最終作用都是使神經(jīng)元去極化，從而使鈣離子通道打開，鈣離子內(nèi)流，胞內(nèi)鈣離子增加。我們使用電刺激器master-8產(chǎn)生脈沖刺激，它的優(yōu)點(diǎn)是8個(gè)通道可以各自獨(dú)立運(yùn)行，也可以靈活、同步的產(chǎn)生復(fù)雜的脈沖模式，可通過(guò)改變脈沖的頻率、強(qiáng)度等來(lái)模擬生理和病理的狀況，是體外研究神經(jīng)元興奮性理想的刺激方式。另外，在神經(jīng)元的突觸可塑性研究中，電刺激也是必不可少的刺激方式。

本次研究表明，高靈敏度的EMCCD圖像檢測(cè)器，高度穩(wěn)定、高效的激光傳輸系統(tǒng)，及精確同步控制器和易于使用的系統(tǒng)控制軟件，這些組成使得系統(tǒng)無(wú)論是靈敏度還是速度都非常高，可成功用于觀察神經(jīng)元內(nèi)電刺激引起的鈣離子變化。許多其他可興奮性活細(xì)胞，如心肌細(xì)胞和腺體細(xì)胞也可使用此刺激方式。此外，還可以通過(guò)添加有針對(duì)性的激光光漂白、活化等工具，分離或破壞細(xì)胞過(guò)程以提取有關(guān)這些過(guò)程的定量信息。