蟲類藥治療胃癌用藥規(guī)律及分子機制研究＊

黃鉦凱，梁明坤，陸飛國，陳廣文，梁 健，4＊＊

（1. 湖南中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結合學院 長沙 410208；2. 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院 南寧 530001；3. 廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 南寧 530023；4. 廣西大學醫(yī)學院 南寧 530004）

胃癌（Gastric cancer，GC），是全球第5大癌癥，5年生存率僅為29%[1,2]。在我國，胃癌是僅次于肺癌，發(fā)病率居第2 位的惡性腫瘤[3,4]。胃癌化療和放療效果欠佳[5]，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)已是晚期，預后較差[6]。中醫(yī)藥治療癌癥潛力巨大，前景廣闊，中醫(yī)藥在協(xié)同增效，降低西藥毒性，提高患者生存質量等多方面發(fā)揮重要的作用[7,8]。其中蟲類中藥，長于攻堅破積、活血祛瘀、解毒散結，在抗癌治療中療效顯著[9]。為此，本研究全面檢索相關數(shù)據(jù)庫，收集含有蟲類藥治療胃癌的中藥處方，探討其組方用藥特征，分析運用蟲類藥治療胃癌的配伍規(guī)律及其分子機制，以期為臨床治療用藥提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 處方來源

處方來源于公開發(fā)表的含蟲類藥中藥處方治療胃癌的期刊文獻。以“中醫(yī)”“中醫(yī)藥治療”“中西醫(yī)結合治療”“胃癌”為檢索詞檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫（CNKI），萬方數(shù)據(jù)庫（Wanfang），維普數(shù)據(jù)庫（VIP），檢索期限為建庫-2019 年12 月，根據(jù)納入標準和排除標準篩選出治療胃癌的含蟲類藥的中藥處方。

1.2 納入與排除標準

1.2.1 納入標準

①有關中醫(yī)藥或中西醫(yī)結合治療胃癌的臨床研究文獻，包括臨床對照試驗、病例分析、專家經(jīng)驗等；②文獻中的中藥處方含有蟲類藥，用藥方式為中藥口服，且有明確的方藥組成；③處方涉及基本方及隨證加減藥物時，只納入基本方。

表1 處方中蟲類藥物使用頻次前10位藥物

1.2.2 排除標準

①綜述文獻及個案報道；②使用中藥注射制劑或中成藥而無具體方藥組成的文獻；③動物實驗研究文獻；④以針灸或中藥外治為主要治療方法的文獻；⑤內容相同的重復發(fā)表的文獻，只納入1篇；⑥少數(shù)民族醫(yī)藥類文獻，如壯醫(yī)、蒙醫(yī)等。

1.3 中藥名稱規(guī)范方法

根據(jù)2015 年版《中華人民共和國藥典》[10]對中藥名稱進行統(tǒng)一規(guī)范處理，如“土元”規(guī)范為“地鱉蟲”，“天龍”規(guī)范為“壁虎”等。

1.4 數(shù)據(jù)錄入與核對

將篩選出含蟲類藥治療胃癌的中藥處方由專人錄入到中醫(yī)傳承輔助平臺，錄入工作結束后，再由雙人負責數(shù)據(jù)復核，確保數(shù)據(jù)的準確無誤。

1.5 數(shù)據(jù)挖掘與分析

利用中醫(yī)傳承輔助平臺（V2.5）進行藥物頻次統(tǒng)計、組方規(guī)律統(tǒng)計等數(shù)據(jù)挖掘分析，探析處方的遣方用藥規(guī)律。

1.6 最高頻藥物治療胃癌的分子機制分析

利用中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫及TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）檢索收集組方規(guī)律分析得到的最高頻藥物的活性成分及對應作用靶點；檢索Genecards 數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）和OMIM 數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/search/advanced/geneMap）獲得胃癌相關靶點，然后將兩者取交集，得到最高頻藥物作用于胃癌的靶點。利用STRING 數(shù)據(jù)庫（http://string-db.org）對最高頻藥物作用于胃癌靶點進行蛋白互作網(wǎng)絡分析，并利用Cytoscape3.7.1 軟件的插件Cytohubba 篩選出關鍵靶點。最后利用在線工具DAVID（https://david.ncifcrf.Gov）進行GO 功能富集分析和KEGG 信號通路富集分析。

2 研究結果

2.1 文獻檢索結果

經(jīng)檢索并根據(jù)納入與排除標準，最終篩選出符合要求文獻103篇，涉及含蟲類藥治療胃癌處方109首。

2.2 用藥頻次、藥味數(shù)分析

本研究納入治療胃癌的含蟲類藥處方109 首，涉及中藥232味，其中蟲類藥26味，使用頻次前5位分別是蜈蚣、壁虎、地鱉蟲、露蜂房、全蝎。非蟲類藥206味，使用頻次前5位分別是白術、茯苓、黃芪、白花蛇舌草、半夏（表1-2）。同時本研究對篩選出的109 首處方，進行了每首處方中蟲類用藥味數(shù)統(tǒng)計，結果顯示含1 味蟲類藥的處方49 首，占44.9%；含2 味蟲類藥的處方30 首，占27.5%；含3 味蟲類藥的處方21 首，占19.2%；含4味蟲類藥的處方6首，占5.5%；含5味蟲類藥的處方2首，占1.8%；含7味蟲類藥的處方1首，占0.9%。

2.3 中藥四氣五味頻數(shù)分析

對232味中藥的四氣五味進行統(tǒng)計，四氣以溫、平為主，共占69.14%。其中溫性藥物最多，占43.65%（464 次），熱性藥最少占1.32%（14 次）（圖1）。五味以甘、苦、辛為主，共占89.21%。其中，甘味藥最多占35.77%（577 次）；最少的是澀味藥，只占1.18%（19次）（圖2）。

2.4 中藥歸經(jīng)頻數(shù)分析

對232 味中藥的歸經(jīng)頻次進行統(tǒng)計，結果顯示處方藥物歸經(jīng)廣泛，涉及多臟腑，但在各臟腑的分布上具有差異性。以歸脾、肝、胃經(jīng)為多，總計占57.65%，其中歸脾經(jīng)者最多，605次，占23.03%（圖3）。

2.5 基于關聯(lián)規(guī)則的組方規(guī)律分析

基于本研究的目的，依據(jù)經(jīng)驗以及分析出的藥物的預讀取，在方劑“組方規(guī)律”分析中，將“支持度個數(shù)”參數(shù)設為11，置信度參數(shù)設為0.6，點擊“用藥模式”出現(xiàn)常用藥對74 對，取排序前30 藥對（表3）。點擊“規(guī)則分析”導出關聯(lián)規(guī)則的49 藥對，取排序前20藥對（表4）。從關聯(lián)規(guī)則分析結果的網(wǎng)絡圖中可看出，茯苓、黃芪、白術、半夏均處于網(wǎng)絡圖的中心位置（圖4）。

表2 處方中非蟲類藥物使用頻次前30位藥物

圖1 中藥的四氣雷達分布圖

圖2 中藥的五味雷達分布圖

圖3 中藥的歸經(jīng)雷達分布圖

2.6 最高頻藥物蜈蚣治療胃癌的分子機制分析

2.6.1 蜈蚣活性成分及作用靶點篩選

通過檢索收集中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫、維普數(shù)據(jù)庫中蜈蚣已有文獻報道的活性成分，得到包括蜈蚣素甲、蜈蚣素乙、花生四稀酸、二十碳二烯酸、對羥基苯甲酸等在內的37 個活性成分，再利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫，查找上述活性成分對應作用靶點，得到對應作用靶點278個。

2.6.2 蜈蚣治療胃癌的潛在作用靶點的獲取

通過GeneCards 和OMIM 數(shù)據(jù)庫共查找到18388個胃癌相關靶點，將其與278個蜈蚣作用靶點取交集，獲得99個蜈蚣治療胃癌的潛在作用靶點。

2.6.3 靶點蛋白互作網(wǎng)絡構建與關鍵靶點篩選

利用STRING 數(shù)據(jù)庫構建蜈蚣治療胃癌的潛在作用靶點的蛋白互作網(wǎng)絡（圖5A），圖中節(jié)點大小表示度中心性值（Degree）的大小。在此基礎上，利用Cytoscape3.7.1 軟 件 的 插 件cytohubba，通 過Degree、EPC、BottleNeck 等11 種網(wǎng)絡結構和節(jié)點間加權重聯(lián)系的分析算法，根據(jù)綜合得分篩選出10 個關鍵靶點：PPARγ、PPARα、INS、GTA、PTGS2、NOS3、LPL、GPT、SERPINE1、BDNF（圖5B），圖中顏色越深，表示靶點越重要。提示這些靶點在該網(wǎng)絡中發(fā)揮了關鍵作用，可能是蜈蚣治療胃癌的關鍵靶點。

表4 含蟲類藥處方中藥物的規(guī)則分析

圖4 含蟲類藥物處方中關聯(lián)規(guī)則藥物網(wǎng)絡圖

2.6.4 GO功能與KEGG通路分析

圖5 蜈蚣治療胃癌的作用靶點蛋白互作網(wǎng)絡（A）及關鍵靶點網(wǎng)絡（B）

圖6 蜈蚣治療胃癌作用靶點的GO分析和KEGG分析結果

將99 個蜈蚣治療胃癌的潛在作用靶點導入DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 分析和KEGG 分析。GO 富集分析包括生物過程、細胞組分和分子功能3方面內容。生物過程共富集到53 條，主要涉及超氧自由基清除（Removal of superoxide radicals）、環(huán) 氧 化 酶 通 路（Cyclooxygenase pathway）、細菌防御反應（Defense response to bacterium）等（圖6A）；細胞組分共富集到12 條，主要涉及細胞外間隙（Extracellular space）、線粒體（Mitochondrion）、細胞外區(qū)域（Extracellular region）等（圖6B）；分子功能共富集到18 條，主要涉及類固醇激素受體活性（Steroid hormone receptor activity）、同質蛋白結合（Identical protein binding）、序列特異的DNA結 合（Sequence-specific DNA binding）等（圖6C）。KEGG 分析共富集到27 條信號通，主要涉及PPAR 信號通路（PPAR signaling pathway）、HIF-1 信號通路（HIF-1 signaling pathway）、癌 癥 轉 錄 失 調（Transcriptional misregulation in cancer）等（圖6D）。

3 分析與討論

本研究所涉及的109 首含蟲類藥處方中，共使用中藥232味，蟲類藥有26味，使用頻次前5位分別是蜈蚣、壁虎、地鱉蟲、露蜂房、全蝎?，F(xiàn)代藥理研究表明蜈蚣組織提取物可通過抑制EGFR 的表達，抑制細胞增殖，發(fā)揮抗胃癌效應。壁虎可影響胃癌細胞P53、Bax、MMP-9 及E-cad 蛋白表達水平，抑制胃癌細胞增殖，并促進細胞凋亡，具有良好的抗癌作用[11,12]。露蜂房的甲醇提取物可使胃癌細胞阻滯于G1 期和G2 期，誘導細胞凋亡[13]。地鱉蟲的提取物能抑制胃癌細胞的生長活性[14,15]。全蝎的提取物蝎毒多肽可通過影響MMP-2 及MMP-9 的表達，實現(xiàn)對胃癌細胞侵襲轉移的抑制作用，發(fā)揮抗癌效應[16]。

臨床上，國醫(yī)大師周仲瑛喜用露蜂房、全蝎、蜈蚣等治療胃癌等癌瘤疾病，取得良好效果[17]。郭氏采用五蟲散膠囊（由全蝎、蜈蚣、地鱉蟲等組成）配合西藥治療晚期胃癌等消化道腫瘤，有較滿意的療效[18]。另外，許多已經(jīng)證實具有良好抗腫瘤效果的名方和制劑所含蟲類中藥大多在本研究篩選出的高頻蟲類藥物中。諸如治療頸部癭瘤的六軍丸（由蜈蚣、全蝎、僵蠶等組成）；治療胃癌金龍膠囊的主要成分就是壁虎的提取物；著名抗癌制劑大黃蟅蟲丸、小金丹、蟾酥丸中均含有本研究篩選出的高頻蟲類中藥的一二味。這些充分說明蜈蚣、壁虎、地鱉蟲、露蜂房、全蝎等高頻蟲類中藥治療胃癌等癌癥的有效性。

本研究顯示在含蟲類中藥處方中，與蟲類藥物配伍的非蟲類高頻藥物中，從功效分類上來看，主要包括補虛類藥、解毒類藥、化瘀類藥、化痰類藥、化濕類藥、消食類藥等。另外從藥物組合來看，蟲類中藥多與益氣健脾、利水滲濕、解毒化痰之品配伍使用（表3）。此外在關聯(lián)規(guī)則藥物網(wǎng)絡中，黃芪，茯苓、半夏、白術等藥處于網(wǎng)絡的核心，也體現(xiàn)了該組方配伍特點。這些充分體現(xiàn)了含蟲類中藥處方，緊扣胃癌“虛、氣、痰、瘀、毒”總體病因病機的組方配伍特點。胃癌乃本虛毒聚之癥，脾胃虛弱為本，癌毒結聚為標，氣、血、痰、濕、食是癌毒形成的關鍵。蟲類藥物為“血肉有情之品”，“以食血之蟲，飛者走絡中氣分，走者走絡中血分，可謂無微不入，無堅不破”[19]，其性善走行，以其動物之本性，能行又具有攻性，可通經(jīng)絡、破血逐瘀，其藥效強，藥力猛，有軟堅散結抗癌的獨特療效，重在治標，長于局部；非蟲類藥物，針對關鍵病因病機，全面兼顧，重在整體。如此組方，協(xié)同增效，互補互助，兼顧全面，標本兼治，攻補并進，祛邪扶正，邪去正復，癌積得消。

值得注意的是，在含蟲類中藥處方中，非蟲類藥物使用頻次前5 位藥物分別是白術、茯苓、黃芪、白花蛇舌草、半夏，其中益氣健脾之品共3 味，占60%。此外，在非蟲類藥物用藥頻次排名前30 的藥物中，雞內金、麥芽、山楂等消食和胃之品使用頻次也較高。出現(xiàn)這些用藥特點，一方面，由于脾胃虛弱貫穿胃癌始終，益氣健脾和胃乃治療胃癌之總則；另一方面，由于蟲類善于攻伐走竄，藥性峻猛深入，雖攻毒散結效果顯著，但或有毒性、或損傷氣血、或中傷胃氣。故運用蟲類藥的同時需注重配伍調養(yǎng)氣血、顧護脾胃之品。

同時，我們對109首含蟲類藥治療胃癌的處方，進行了每首處方蟲類用藥味數(shù)統(tǒng)計，結果顯示含1-3 味蟲類藥的處方共100 首，占91.2%。由此可知含蟲類藥物處方中蟲類藥物常用藥味數(shù)為1-3 味，體現(xiàn)了蟲類藥，藥性峻猛，效力專注，不宜多用，在精不在多的特點。以上這些提示我們在臨床應用蟲類藥物時，此類攻伐峻藥應辯證論治、謹慎選用，不可妄用濫用。同時運用時應注重配伍調養(yǎng)氣血、顧護脾胃之品，以防傷正。

從藥物性味分析，運用蟲類藥治療胃癌處方藥物的藥性以溫、平為主。五味以甘、苦、辛為主，甘能補、能和、能緩，苦能燥、能堅，辛能散、能行。辛溫藥多有發(fā)散、行氣行血、活血化瘀的作用，甘溫藥具有補益、和中緩急的作用。胃癌總體上屬于本虛標實之疾，“虛、氣、痰、瘀、毒”乃胃癌基本病因病機，該病多因七情勞欲，復感外邪，臟腑失調，痰濁內生，氣血凝結，“痰夾淤血，遂成巢囊”，痰瘀互結，膠結難解，阻滯臟腑經(jīng)脈則成癥積，日久化毒，遂成惡性腫瘤。故以溫化痰濕、通陽祛濁、辛溫化痰祛瘀、理氣消積。胃癌后期久病入絡，屬痰瘀阻絡，故用辛溫之藥發(fā)散透邪、行氣活血、引藥入絡，活血化瘀；又因正氣不足，脾胃虛弱是貫穿胃癌主線，且患病日久，氣血更傷，須用甘溫、甘平之品以補益氣血、扶助正氣。如此性味相伍，配合蟲類藥，契合胃癌“虛、氣、痰、瘀、毒”的基本病因病機，共奏化痰祛瘀、活血通絡、攻毒散結、扶正固本之效。

從藥物歸經(jīng)分析，運用蟲類藥治療胃癌處方藥物歸經(jīng)以歸脾、肝、胃經(jīng)為主。胃癌病位以胃為主，多涉及肝脾。肝藏血主筋，調暢氣機，蟲類藥善息風活血，行氣散結，多以歸肝經(jīng)為主；且胃癌的發(fā)病與脾胃肝三臟功能失常密切相關，肝脾失和，肝胃不調是胃癌諸多病因的轉歸之處，肝傷則氣郁，脾傷則氣結，氣不行則血流不暢，久而停滯為淤，淤痰互結，化毒為瘤。因此，治療也注重調理肝脾胃三臟功能，多用歸肝脾胃三經(jīng)的藥物。

此外，我們采用網(wǎng)絡藥理學方法，對挖掘出的最高頻藥物蜈蚣治療胃癌的分子機制進行了分析，得到蜈蚣治胃癌的潛在作用靶點99 個。通過構建靶點互作網(wǎng)絡對這些作用靶點進行篩選與分析，得到包括PPARγ、PPARα、INS、GTA、PTGS2 等在內10 個關鍵靶點。另外，對蜈蚣治療胃癌的99 個作用靶點進行KEGG 分析顯示其主要涉及PPAR 信號通路、PHIF-1信號通路、癌癥轉錄失調等信號通路。PPARγ、PPARα 屬于過氧化物酶增殖物激活受體（Peroxisomeproliferater-activatedreceptor，PPAR），兩者都是PPAR 信號通路的重要組成部分，該通路具有調節(jié)葡萄糖與脂質代謝、免疫調節(jié)、細胞生長與分化等多樣生物效應，在胃癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。PPARγ 等被激活后可通過調控下游目的基因（如PTEN、c-myc、COX-2 和MMP9 等），發(fā)揮其抑制細胞生長，誘導細胞凋亡，參與細胞周期調控，以及誘導腫瘤細胞分化和抑制腫瘤血管形成等多樣生物學效應[20-21]。既往研究表明不少中藥（如黃芪、莪術、郁金提取物欖香烯等）能影響PPARγ 表達，從而抑制胃癌細胞的增殖，發(fā)揮抗癌效應[22,23]。缺氧誘導因子1（HIF-1）由HIF-1α 和HIF-1β 兩個亞基組成，是一種在缺氧環(huán)境下參與細胞適應性調節(jié)的關鍵轉錄因子，由其構成的HIF-1 信號通路在胃癌等腫瘤性疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。HIF-1不僅可誘導胃癌等實體腫瘤的血管生成、促進癌細胞的生長和增殖，而且參與腫瘤細胞的分化的調節(jié)，細胞周期的調控，廣泛參與癌癥相關的多個生物學過程[24,25]。多項表明下調胃癌中HIF-α和HIF-1β的表達，影響HIF-1相關信號通路，可抑制VEGF 的活性，抑制胃癌血管的生成，進而抑制胃癌細胞的侵襲與擴散[26-28]。綜上可推測蜈蚣可能通過作用于PPARγ、PPARα 等靶點，通過干預PPAR 信號通路、HIF-1 信號通路、癌癥轉錄失調等信號通路多途徑發(fā)揮抗胃癌效應。

綜上所述，本研究在一定程度上從宏觀角度探索出了含蟲類藥中藥處方治療胃癌的組方配伍用藥規(guī)律，可為臨床用藥提供一定的參考和借鑒；從微觀層面探索分析了含蟲類藥處方高頻藥物蜈蚣治療胃癌的分子機制，可為進一步研究其作用機制提供有益線索與啟示。