中醫(yī)藥干預干細胞治療腦梗死的文獻計量學分析＊

鄢海良，方 興，張興棠，王 瑞

（1. 廣西中醫(yī)藥大學研究生院 南寧 530001；2. 廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院 南寧 530001）

腦梗死又稱缺血性卒中（cerebral infarction，CI），是多種因素作用下致腦部血液供應障礙，致局部腦組織缺血、缺氧性壞死，進而出現(xiàn)相應神經(jīng)功能缺損的臨床綜合征。腦梗死后會遺留半身不遂、語言障礙或口眼歪斜等后遺癥，其臨床表現(xiàn)多樣化:①肢體感覺、運動障礙，②認知、知覺功能障礙，③交流、言語障礙，④心理情感障礙，這些不僅嚴重影響患者的生存質(zhì)量，還給患者的家庭帶來嚴重的負擔；據(jù)2015 年我國卒中流行報告顯示，我國新發(fā)腦血管病患者約年均270 萬，約每12 s 就有1 人發(fā)生腦卒中；死于腦血管病的患者約130 萬，約每21 s 就有1 人死于腦卒中[1]，目前溶栓療法和介入手術(shù)可以使得堵塞血管再通，血流重建，但是溶栓嚴格時間窗的限制及介入風險的影響，大多數(shù)患者中風未能及時及有效的干預，使得腦缺血中心神經(jīng)元、神經(jīng)細胞壞死難以避免。因此腦組織缺血后神經(jīng)組織再修復及功能的重建是當今研究熱點，當前對神經(jīng)功能修復、細胞環(huán)路重建的研究主要有內(nèi)源性和外源性途徑，內(nèi)源性途徑就是誘導神經(jīng)干細胞增殖、分化；外源性途徑就是直接植入或者置換受損組織細胞或者基因工程細胞[2]；干細胞是一種具有自我更新、自我復制、多分化潛能的細胞，其中內(nèi)源性干細胞在神經(jīng)組織修復過程中通過自身分化實現(xiàn)同一、同質(zhì)細胞的復制使其具有母代細胞所有的特質(zhì)，如內(nèi)源性神經(jīng)干細胞（neural stem cells，NSCs）是神經(jīng)系統(tǒng)的始祖細胞，可分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞，為神經(jīng)再生和修復提供理論依據(jù)，但是內(nèi)源性NSCs 數(shù)量極少，遠不能滿足神經(jīng)功能修復的需要，如何促進神經(jīng)干細胞增殖、遷移、分化即是研究重點；外源性干細胞在一定的誘導條件下，自我向跨胚層發(fā)育，分化成需要修復的細胞并具有其特質(zhì)[3]；外源性干細胞研究目前大多集中在骨髓間充質(zhì)干細胞、脂肪干細胞、造血干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞等成體干細胞的移植上，但是梗死區(qū)域微環(huán)境的惡劣，使得移植后的干細胞在短時間內(nèi)凋亡且難以向神經(jīng)分化從而大大削弱了干細胞移植治療效果，因此，如何提高移植后干細胞的存活率，發(fā)揮最大治療效果成為目前的研究重點[4]。目前腦卒中的治療僅局限于對癥治療，尚未有確切藥物能使得損傷的神經(jīng)組織再修復的功能，近年來對干細胞生物學特性的深入研究，干細胞療法逐漸成為缺血性卒中治療策略研究的新方向。

圖1 中國知網(wǎng)(CNKI)數(shù)據(jù)庫檢索式

圖2 PubMed數(shù)據(jù)庫檢索式

1 資料與方法

1.1 研究資料及檢索方法

通過檢索中國知網(wǎng)（CNKI）及PubMed數(shù)據(jù)庫中關(guān)于中醫(yī)藥干預干細胞治療腦梗死的文獻，并通過閱讀標題和摘要后手動去掉和本研究內(nèi)容不相關(guān)的文獻，具體檢索式如圖1、圖2；檢索時間均從建庫至2019 年10月20日。

1.2 資料分析方法

1.2.1 高頻詞共現(xiàn)矩陣

運用書目共現(xiàn)分析軟件（bibliographic item cooccurrence matrix builder，BICOMB）2.0 版提取1.1 中最終檢索到符合標準的文獻的年代、期刊國家、語種、高頻詞等文獻常規(guī)參量，并統(tǒng)計文獻中高頻詞等出現(xiàn)的頻次，生成高頻詞之間的共現(xiàn)矩陣。

1.2.2 高頻詞聚類及共現(xiàn)分析圖

采用IBM.SPSS 21.0 軟件對高頻詞進行聚類分析并繪制聚類圖；再用CytoScape3.6.1軟件將高頻詞共現(xiàn)矩陣繪制成共現(xiàn)分析圖。

2 結(jié)果

2.1 文獻檢索結(jié)果

按照1.1 的檢索方法，中國知網(wǎng)（CNKI）數(shù)據(jù)庫的檢索結(jié)果如下：#1 為308138 篇，#2 為120694 篇，#3 為2304822 篇，#4 為418979 篇，#5 為319 篇。PubMed 數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果如下：#1為389246篇，#2為410236篇，#3為105493篇，#4為31068篇，#5為65篇。

2.2 文獻的年代、發(fā)表期刊的國家、語種分布

根據(jù)1.2.1方法，中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫檢索出來的文獻發(fā)表時間從2001 年-2019 年，檢索出來的文獻全部發(fā)表在國內(nèi)的期刊上，除了2017 年發(fā)表的文獻有下降外，其他時間發(fā)表的文獻都依次逐年增加，提示對于該病治療領(lǐng)域的關(guān)注熱點可能發(fā)生改變，文獻語種均為中文；PubMed 數(shù)據(jù)庫檢索出來的文獻發(fā)表時間從2005 年-2019 年，發(fā)表的期刊在中國、美國、印度、英國、瑞士、愛爾蘭、荷蘭、希臘、德國、日本、新加坡、阿拉伯、意大利分布，語種為英文，具體如圖3、圖4，20年文獻量較少，與檢索時間短、部分文獻未收錄網(wǎng)上發(fā)布有關(guān)。

圖3 中國知網(wǎng)（CNKI）與PubMed數(shù)據(jù)庫檢索文獻的發(fā)表年代

圖4 中國知網(wǎng)（CNKI）和PubMed數(shù)據(jù)庫檢索文獻發(fā)表的國家

表1 中國知網(wǎng)高頻詞頻分布

2.3 高頻詞的統(tǒng)計結(jié)果

根據(jù)1.2.1 方法統(tǒng)計出中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫319 篇文獻，提取的高頻詞共661個，其中頻次最高的高頻詞為神經(jīng)干細胞，出現(xiàn)的頻次為124，頻次≥5 的有60 個關(guān)鍵詞（表1）；PubMed 數(shù)據(jù)庫有65 篇文獻，提取的高頻詞共有378個，其中出現(xiàn)頻次最高的高頻詞為Animals，頻次為62，其中頻次≥5的有52個主題詞（表2）。

2.4 高頻詞的共現(xiàn)及聚類

根據(jù)1.2 方法對高頻詞進行分析，中國知網(wǎng)共有443 對共現(xiàn)關(guān)系，其中有165 對共現(xiàn)關(guān)系與電針、補陽還五湯、針刺、中醫(yī)藥、任脈、腦脈通、丹參注射液、地黃飲子、頭針、天麻多糖、清熱化瘀方、中藥、人參皂苷、丹龍醒腦方等中醫(yī)藥高頻詞相關(guān)；PubMed 數(shù)據(jù)庫共有929 對共現(xiàn)關(guān)系，其中有159 對共現(xiàn)關(guān)系與Electroacupuncture、Drugs，Chinese Herbal/pharmacology、Drugs，Chinese Herbal/therapeutic use、Drugs, Chinese Herbal/administration & dosage、Acupuncture Points、Electroacupuncture/methods、Acupuncture Therapy 等中醫(yī)藥高頻詞相關(guān)，最后生成高頻詞共現(xiàn)圖（圖5、圖6）。

通過運用IBM.SPSS 21 統(tǒng)計分析軟件對中國知網(wǎng)頻次≥5 的60 個高頻詞和PubMed 頻次≥5 的52 個高頻詞進行聚類分析，生成聚類樹狀圖（圖7、圖8）。

3 討論

關(guān)鍵詞/主題詞強調(diào)概念的某些方面，涉及醫(yī)學研究的特定范疇，分析文獻的關(guān)鍵詞/主題詞可獲得其研究熱點和趨勢等信息，其出現(xiàn)頻率、聯(lián)系緊密度、時間揭示疾病研究熱點及變化情況。通過PubMed 數(shù)據(jù)庫和CNKI 數(shù)據(jù)庫檢索到國內(nèi)外關(guān)于中醫(yī)藥干預干細胞治療腦梗死的相關(guān)文獻，運用文獻計量學方法對檢索結(jié)果進行分析，解讀建庫以來國內(nèi)外該領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢。

表2 PubMed高頻詞頻分布

圖5 中國知網(wǎng)高頻詞共現(xiàn)圖

圖6 PubMed高頻詞共現(xiàn)圖

圖7 中國知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫高頻詞聚類樹狀圖

3.1 中醫(yī)藥干預干細胞治療腦梗死的文獻特征分析

通過對文獻分析來看，中國就研究年限及發(fā)文數(shù)量均早且多于其他國家，從2001 年開始已有發(fā)文，自2005 年中國相關(guān)文獻迅速增長且多發(fā)表在中文核心期刊上，說明文獻的研究質(zhì)量越來越高，相關(guān)研究也從最初的研究內(nèi)源性干細胞擴展到外源性干細胞，說明中國在該領(lǐng)域研究已有一定地位；自2005年開始其他國家也發(fā)表相關(guān)文獻，發(fā)文數(shù)量總體趨勢波動上升，尤以美國發(fā)文數(shù)量居多，說明中醫(yī)藥干預干細胞治療腦梗死影響深遠。

從文獻的高頻詞統(tǒng)計來看，中國知網(wǎng)的關(guān)鍵詞出現(xiàn)頻次較多主要集中在電針、補陽還五湯、丹參注射液、中醫(yī)藥、天麻多糖、丹龍醒腦方、腦脈通、任脈、地黃飲子、清熱化瘀方等與中醫(yī)藥相關(guān)詞匯，PubMed 數(shù)據(jù)庫的主題詞出現(xiàn)頻次較多的主題詞主要集中在Electroacupuncture、Drugs，Chinese Herbal/pharmacology、Drugs，Chinese Herbal/therapeutic use、Drugs，Chinese Herbal/administration & dosage、Acupuncture Points、Electroacupuncture/methods、Acupuncture Therapy 等相關(guān)詞匯，表明在中醫(yī)方面治療腦梗死多以組方及針灸的形式實施，中醫(yī)藥多成分多靶點多作用機制即是研究熱點。

圖8 PubMed數(shù)據(jù)庫高頻詞聚類樹狀圖

3.2 中醫(yī)藥干預干細胞治療腦梗死文獻高頻詞共現(xiàn)及聚類特征

針灸療法作為中醫(yī)學的重要組成部分，歷代醫(yī)籍早有針刺治療中風的相關(guān)記載[5]，近年來，作為中醫(yī)外治法中重要組成部分的針灸在治療中風后遺癥表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢[6]，電針是傳統(tǒng)針灸的改良，在針灸取穴的基礎(chǔ)上于針尾施以連續(xù)或間斷的電流替代手法捻轉(zhuǎn)加強治療作用；針刺腦卒中患者頭針感覺區(qū)和患側(cè)肢體，可促進感覺通路的修復,提高損傷區(qū)域支配的運動準確性[7]；NSCs起源于神經(jīng)外胚層，主要存在于腦部側(cè)腦室的室管膜下區(qū)（subventricular zone，SVZ）和海馬的齒狀回顆粒下層（subgranular zone，SGZ）兩個區(qū)域，研究表明，腦缺血時可激活內(nèi)源性NSCs 增殖和分化,促進細胞骨架的重構(gòu)和神經(jīng)元的再生[8]，兩個區(qū)域的新生神經(jīng)元可遷移至嗅球、皮層以及海馬顆粒層[9，10]，參與調(diào)控認知功能、學習記憶功能；這些主要是通過Wnt、Notch、PI3K/AKT、Rho/ROCK、PKA等信號通路的調(diào)節(jié)作用，發(fā)揮促進神經(jīng)細胞的修復,減輕神經(jīng)功能缺損程度的作用；實驗表明，電針通過激活Notch1信號轉(zhuǎn)導通路，上調(diào)并活化NICD 蛋白，激活Hes1 和Hes5，促進缺血損傷后神經(jīng)干細胞（NSCs）增殖，進而分化為膠質(zhì)細胞、神經(jīng)元，治療神經(jīng)功能缺損和改善肢體運動功能[11]；Wnt1 和Wnt3a 是Wnt 信號通路中的兩個配體也是激活劑，其表達的上升可促進NSCs 的增殖與遷徙，而電針可上調(diào)Wnt1/β-catenin 的表達，抑制GSK3 的表達，從而增強腦缺血皮質(zhì)NSCs 增殖[12]；Rho-ROCK 信號通路主要參與細胞的收縮、粘附、遷移、增殖、細胞骨架的形成等生物學過程，抑制通路關(guān)鍵因子Rho A、ROCK2 及MLCP，能夠動員神經(jīng)干細胞分化[13]；PI3K/AKT 通路是細胞存活的重要通路，激活PI3K/AKT 可抑制神經(jīng)細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用；研究表明電針能促進p-Ak 的表達，從而抑制神經(jīng)細胞的凋亡[14]；研究表明，干細胞（MSCs）移植可抑制大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細胞凋亡并改善其缺血后的神經(jīng)功能[15，16]，MSCs 聯(lián)合電針能有效抑制腦內(nèi)神經(jīng)細胞的凋亡和改善其神經(jīng)功能[17]；可能與以下機制相關(guān)：電針上調(diào)BDF 的表達，改善腦缺血區(qū)干細胞的生存環(huán)境，促進移植的ADSC 在腦缺血區(qū)的存活和遷移[18]。天麻含有多種藥物活性成分，天麻多糖是天麻的有效成分之一，在抗腦缺血、保護神經(jīng)元和提高學習記憶能力等方面有著廣泛的藥理活性，巢蛋白（Nestin）是一種胚胎期表達蛋白，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)生長發(fā)育，隨著神經(jīng)元的遷移分化在成熟細胞中逐漸停止表達，是神經(jīng)干細胞的重要標志蛋白，研究表明，天麻多糖也可通過上調(diào)腦缺血大鼠齒狀回、海馬CA3 區(qū)等部位的Nestin 和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達，從而促進神經(jīng)再生，同時電針又能促進天麻多糖在體內(nèi)的吸收,對腦缺血大鼠內(nèi)源性NSCs的遷移增殖起到協(xié)同效應[19]；地黃飲子用于治療缺血性中風病的療效已被臨床和實驗研究所證實[20]，其通過上調(diào)MCAO 大鼠大腦皮質(zhì)巢蛋白mRNA 和干細胞因子（SCF）mRNA 的表達，激活Notch信號通路，促進NSCs 的增殖及血管新生等作用；實驗證明地黃飲子可經(jīng)過Wnt 信號通路誘導骨髓充間質(zhì)干細胞向神經(jīng)元樣細胞分化[21]；人參皂苷Rg1 是人參的重要成分之一，具有抗炎、抗凋亡、抗腫瘤、改善腦缺血等藥理活性；其通過上調(diào)腦組織HIF-1a 蛋白與VEGF 蛋白含量發(fā)揮缺血保護，通過旁分泌、自分泌等形式誘導神經(jīng)干細胞的增殖與分化[22]；其聯(lián)合BMSCs移植可通過增強神經(jīng)元樣細胞的分化及抗細胞凋亡作用能夠促進腦缺血再灌注損傷腦組織的修復[23]，主要通過PI3K/Akt和MAPK/ERK1/2 信號通路調(diào)控NSCs的神經(jīng)發(fā)生[24]；經(jīng)臨床及動物實驗證實對腦梗死有確切治療作用的中藥制劑：清熱化瘀方，通過抑制Ca2+的過度內(nèi)流，上調(diào)Bcl-2 的表達；從而減輕腦水腫、減小腦梗死體積、抑制細胞凋亡等，促進NSCs 增殖為神經(jīng)元并促進其遷移，從而發(fā)揮腦保護作用[25-26]；補陽還五湯、丹龍醒腦方是治療腦卒中的有效方，方中丹參、田七、地龍活血化瘀通絡，遠志、石菖蒲化痰醒腦開竅，淫羊藿、菟絲子補腎生髓。中醫(yī)從“腦為髓?！绷⒄摚匝a腎生髓、去瘀生新法治療缺血性腦卒中促進腦血管新生和神經(jīng)元的再生；現(xiàn)代藥理學研究顯示，丹參酮、三七總皂苷通過PI3K/Akt 信號通路促進缺血大鼠SVZ區(qū)NSCs的增殖，促進梗死周圍區(qū)神經(jīng)重塑和突觸重建，并改善其學習能力。淫羊藿及其提取物通過Notch 信號通路Notch1，NICD 和Hes 的表達起調(diào)控干細胞增殖、分化作用[27]；丹酚酸B 作為丹參生物活性含量提取物最高的提取物之一，研究發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B主要通過PI3K/Akt/GSK-3β、AK2/STAT3 通路的調(diào)節(jié)維持內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的自我增殖及分化，通過抗炎抗氧化作用，改善神經(jīng)干細胞的生存環(huán)境，促進神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元分化，還具有抗腦缺血、促進神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌、抗凋亡等作用[28，29]；石菖蒲主要是其揮發(fā)油及α-細辛醚和β-細辛醚通過介導cAMP-PKA 信號通路和Akt-mTOR信號通路誘導星形膠質(zhì)細胞內(nèi)活性氧的累積刺激神經(jīng)生長因子，起到保護細胞的作用[30]。

神經(jīng)細胞及神經(jīng)網(wǎng)絡損傷不可逆且無增殖能力，無法替代、補充，傳統(tǒng)的支持療法效果甚微；干細胞療法是通過動員細胞增殖和調(diào)節(jié)擁有輔助功能的細胞因子的分泌量兩個思路對腦中風進行治療，從細胞水平上對神經(jīng)細胞增殖、遷移進行干預在動物實驗上取得可喜的進步[31]。但近年來發(fā)現(xiàn)單純干細胞療法存在較多局限性，中西醫(yī)結(jié)合治療相輔相成、融會貫通，將傳統(tǒng)中藥、針灸、康復訓練等與干細胞療法有機結(jié)合取得較為理想的治療效果，因此中醫(yī)藥的治療機制、研究熱點值得我們?nèi)ヌ接憽?/p>

本研究通過文獻計量分析，對中醫(yī)藥干預干細胞治療腦梗死的高頻詞進行統(tǒng)計，再進行高頻詞共現(xiàn)分析和聚類分析，重點分析中醫(yī)藥干預干細胞治療腦梗死文獻的發(fā)表年代、國家分布、語種分布、期刊分布和熱點研究方向等內(nèi)容。希望在干細胞治療腦梗死取得跨越性成就同時，中醫(yī)藥能發(fā)揮其獨特的多靶點多機制作用解決單純干細胞治療腦梗死的短板，以達到相輔相成作用，為腦梗死的中醫(yī)藥防治研究提供參考依據(jù)。